Summary
هنا، نقدم طريقة لدينا أنشئت لإعادة برمجة الخلايا الجسدية الإنسان في iPSCs الإنسان خالية من التحوير مع فيروس سينداي، والذي يظهر نتائج متسقة وتعزيز الكفاءة.
Abstract
وقبل بضع سنوات، وإنشاء الخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها الإنسان (iPSCs) إيذانا ببدء حقبة جديدة في مجال الطب الحيوي. الاستخدامات المحتملة لiPSCs الإنسان تشمل النمذجة التسبب في الأمراض الجينية البشرية، العلاج بالخلايا ذاتي بعد تصحيح الجين، وشخصية فحص المخدرات من خلال توفير مصدر للخلايا المريض أعراض محددة وذات الصلة. ومع ذلك، هناك العديد من العقبات للتغلب عليها، مثل القضاء على ما تبقى من عامل إعادة برمجة التحوير التعبير بعد الإنتاج iPSCs الإنسان. الأهم من ذلك، يمكن التعبير التحوير المتبقية في iPSCs الإنسان غير متمايزة تعوق التفرقة السليم وتضليل تفسير مرض ذات الصلة في الظواهر المختبر. مع هذا السبب، تم تطوير خالية من التكامل و / أو iPSCs الإنسان خالية من التحوير باستخدام عدة طرق، مثل اتش، نظام piggyBac، ناقلات minicircle، ناقلات episomal، والتسليم المباشر وبروتين توليفها مرنا. ومع ذلك، وكفاءة reprogramming باستخدام أساليب خالية من التكامل منخفضة جدا في معظم الحالات.
هنا، فإننا نقدم وسيلة لعزل iPSCs الإنسان باستخدام سينداي الفيروسات (فيروس RNA) إعادة برمجة النظام القائم. يظهر هذا الأسلوب إعادة برمجة نتائج متسقة وعالية الكفاءة بطريقة فعالة من حيث التكلفة.
Introduction
الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) لديها القدرة على تعدد القدرات في المختبر، ويكون تجديد الذات، والتي يمكن أن تكون مفيدة محتملة لنمذجة المرض، لفحص المخدرات، ووضع العلاجات المستندة إلى الخلايا لعلاج المرض وإصابات الأنسجة. ومع ذلك، hESCs وجود قيود لاستبدال العلاج الخلية بسبب الحواجز المناعية، الأورام والأخلاقية، ودراسة الجينات المرتبطة بالمرض، يمكن أن تكون معزولة hESCs بأمراض محددة من خلال ما قبل الزرع التشخيص الوراثي (PGD) النهج، لكنه لا يزال تحديا تقنيا والتبرعات الجنين نادرة جدا. وترتبط هذه القضايا إلى التقدم في بيولوجيا الخلايا الجذعية، مما أدى إلى تطور الخلايا الجذعية المحفزة (hiPSCs).
يتم برمجتها iPSCs الإنسان وراثيا من الخلايا الجسمية الكبار الإنسان وتؤوي الجذعية تشبه الخلايا المحفزة ميزات مشابهة لhESCs، مما يجعلها مصدرا مفيدا للطب التجديدي مثل داكتشاف البساط، والنمذجة المرض والعلاج بالخلايا في المريض محددة بطريقة 1،2.
حتى الآن، وهناك العديد من الطرق لتوليد iPSCs الإنسان، بما في ذلك بوساطة فيروس (اتش الارتجاعي و) 3، غير الفيروس بوساطة (نظام BAC وناقلات ترنسفكأيشن) 4 transductions الجينات، والبروتينات نظام التسليم 5-7.
على الرغم من أن تسليم الجينات بوساطة الفيروس يمكن ضمان مستوى معين من الكفاءة، ويمكن أن يترك بصمة ناقلات فيروسية جينية، لأنهم الاندماج في الكروموسومات المضيفة للتعبير عن الجينات إعادة برمجة بطريقة غير المنضبط. حتى عندما التكامل الفيروسية من عوامل النسخ قد تفعيل أو تعطيل الجينات المضيف 8، فإنه يمكن أن يسبب انحراف الوراثية غير متوقعة وخطر تكون الأورام 5،9. من ناحية أخرى، تم الإبلاغ عن الأخذ المباشر من البروتينات أو الحمض النووي الريبي في الخلايا الجسمية، ولكن لديها بعض العيوب مثل كثيفة العمالة، TRANSF المتكررةection، وانخفاض مستوى إعادة برمجة 7،10. حتى episomal وعدم إدماج-اتش، فيروس الغدة المرتبطة، والبلازميد ناقلات لا تزال نسبيا أقل كفاءة 11. لهذه الأسباب، فمن المعقول في اختيار أساليب إعادة برمجة عدم اندماج مع فعالية عالية من الجيل التوجيهية والتشوهات الجينية أقل. في هذه الدراسة، ونحن نستخدم برمجة سينداي الفيروسات القائمة. ويعرف هذا الأسلوب لتكون غير متكاملة في جينوم المضيف وتنتج باستمرار iPSCs الإنسان دون التكامل التحوير.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد الخليوي وسائل الإعلام (اليوم 1)
- الثقافة وتوسيع الخلايا الليفية الإنسان مع وسائل الاعلام DMEM تحتوي على 10٪ FBS.
- لوحة الخلايا الليفية الإنسان (الشكل 1) على طبق من ذهب 24 أيضا في الكثافة المناسبة لكل بئر في اليوم قبل تنبيغ.
ملاحظة: ويوصى التخفيفات المسلسل التالية (200K، 100K، 50K، 25K، 12.5K و6.25K) لأن أنواع مختلفة من الخلايا لديها القدرة المرفق مختلفة. - احتضان الخلايا لمدة يوم واحد أكثر في 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 الحاضنة، وضمان الخلايا انضمت بالكامل والموسعة.
2. تنفيذ تنبيغ (اليوم 2)
- في يوم تنبيغ، والتحقق من كثافة الخلايا واختار الآبار الكثافة الأكثر كفاءة (الشكل 2). فمن الأفضل لاختيار ثلاثة كثافات مختلفة: عالية (80 ~ 90٪) والمتوسطة (50 ~ 70٪) ومنخفضة (20 ~ 40٪).
- 1 ساعة على الأقل قبل تنبيغ، نضح fibroblوسائل الإعلام AST من الخلايا وتغيير 300 ميكرولتر جديدة من الخلايا الليفية المتوسطة.
- إزالة مجموعة واحدة من 4 مختلفة أنابيب فيروس سينداي من -80 درجة مئوية التخزين. ذوبان الجليد كل أنبوب في نفس الوقت في 37 ° C حمام الماء لبضع ثوان، ثم تأخذ أنابيب الخروج من حمام الماء. بعد ذلك، ذوبان الجليد منهم إلى درجة حرارة الغرفة؛ أنابيب الطرد المركزي في 6000 x ج لمدة 10 ثانية ووضعها على الجليد حتى الاستخدام. لا إعادة تجميد والذوبان الفيروس منذ سوف التتر لا الحفاظ عليها.
- إضافة كميات أشار كل من الأربعة أنابيب فيروس سينداي (أكتوبر 4، KLF-4، ج MYC وسوكس-2) لأنبوب الطرد المركزي الصغيرة. تأكد من أن الحل يتم خلط جيد من قبل pipetting بلطف.
على سبيل المثال، إذا 50K الخلايا / واحد بشكل جيد من 24 لوحة جيدا lookwell لتنبيغ:
(عيار استنادا إلى شهادة تحليل من تقنيات الحياة، يمكن أن تكون مختلفة من دفعة لدفعة)
أنبوب hOct-4 = 6.0 × 10 7 CIU، وزارة الداخلية 3 = 5 ميكرولتر
أنبوب hSox-2 = 6.5 × 10 7 CIU، وزارة الداخلية 3 = 4.6 μ، ل
أنبوب hKlf-4 = 6.3 × 10 7 CIU، وزارة الداخلية 3 = 4.8 ميكرولتر
أنبوب HC-MYC = 7.8 × 10 7 CIU، وزارة الداخلية 3 = 3.8 ميكرولتر
المجموع = 18.2 ميكرولتر من أربعة عوامل فيروس خليط / واحد كذلك (50K الخلايا) من 24 لوحة جيدا - اعتمادا على كثافة الخلية؛ إضافة 2X، 1X، 0.5X وحجم من الخليط الفيروس في البئر. يهز بلطف لوحة الأمام إلى الخلف واليمين واليسار (2X: 36.4 ميكرولتر من خليط الفيروس، 1X: 18.2 ميكرولتر و0.5X: 9.1 ميكرولتر).
- وضع الخلايا في 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 الحاضنة واحتضان بين عشية وضحاها.
3. استبدال الثقافة المتوسطة (يوم 3 ويوم 5)
- 24 ساعة بعد تنبيغ، استبدل المتوسطة مع الخلايا الليفية المتوسطة 500 الطازجة ميكرولتر.
- في يوم 5، تغيير متوسطة مع وسائل الاعلام الخلايا الليفية الطازجة.
4. إعداد أطباق MEF لالمشارك الثقافة (اليوم 8)
- إعداد الخلايا MEF في 60 الأطباق الثقافة ملم مع 10٪ FBS الواردة DMEM المتوسطة دا واحدذ قبل الركض الخلايا الليفية transduced على الخلايا المغذية MEF.
ملاحظة: نحن نستخدم 5 × 10 5 من MEF في كل طبق 60 ملم.
5. البدء المشارك الثقافة Transduced الخلايا مع الخلايا المغذية MEF (يوم 9)
- قبل الطلاء الخلايا transduced، الواردة نضح 10٪ FBS DMEM وسائل الاعلام من الأطباق المغذية MEF وإضافة جديدة 10٪ الواردة FBS DMEM المتوسطة.
- إزالة متوسطة من الخلايا الليفية transduced التي هي في 24 لوحة جيدا وغسل خلايا مرة واحدة مع مد برنامج تلفزيوني. إضافة 200 ميكرولتر من 0.25٪ التربسين / EDTA إلى خلايا الليفية تي إتش 24 لوحة جيدا. بعد أقل من 5 دقائق الحضانة مع التربسين / EDTA، عندما تبدأ الخلايا لفصل من لوحة، وجمع الخلايا مع النمو المتوسط في أنبوب 15 مل المخروطية. ثم الطرد المركزي لهم في 6،000 x ج لمدة 4 دقائق.
ملاحظة: تجميع 2X، 1X، 0.5X الفيروس وينصح الليفية transduced. - إزالة المتوسطة طاف ويغسل لاعادة تعليقبيليه الخلية مع 4-5 مل من المتوسط الخلايا الليفية جديدة لتحييد التربسين من. ثم الطرد المركزي في 135 x ج منهم لمدة 4 دقائق.
- لوحة الخلايا كما المسلسل الكثافة التخفيف والبدء في المشاركة في الثقافة مع وسائل الاعلام على الخلايا الليفية MEF: مثل 1/2، 1/4، 1/8، 1/16، 1/32، 1/64، و 1/128 في 60 مم الطبق. اعتمادا على معدل موت الخلايا خلال الأسبوع الأول من تنبيغ، واحدة قد لا تحتاج إلى تمييع إلى 1/2 أو 1/128 الكثافة. وضعت جانبا الخلايا المتبقية لاستخراج الحمض النووي الريبي مجموع كعنصر تحكم إيجابية لالتحوير RT-PCR.
- وضع 60 ملم أطباق في 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 حاضنة بين عشية وضحاها.
6. تغذية الجنينية البشرية الخلايا الجذعية متوسطة ورصد خلايا (اليوم 10)
- في اليوم التالي، وتغيير وسائل الاعلام الخلايا الليفية الإنسان إلى وسائل الإعلام وفاق مع 10 ميكرومتر Y-27632. بعد ذلك، قم بتغيير متوسطة يوميا مع البشرية المتوسطة ES: 800 مل + 200 مل DMEM/F12 خروج المغلوب المصل استبدال + 10 مل من L-الجلوتامين + 10 مل من 10 ملي MEM الحد الأدنى الأحماض الأمينية غير الأساسية+ 1 مل من 2 المركابتويثانول + 10 نانوغرام / مل من عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية.
- قيام وسائل الإعلام التغيير اليومي مع وسائل الاعلام ES الإنسان الطازجة. بعد أسبوع، والتحقق من الأطباق مرة واحدة في 2 ~ 3 أيام تحت المجهر لتشكيل ES مثل مستعمرة كتل الخلية. اعتمادا على نوع من الخلايا، فإن الثقافة تأخذ أكثر أو أقل وقت قبل أن يتم العثور على المستعمرات.
7. نكأ المستحثة افرة القوة الجذعية المستعمرات الخليوي وتوسيع خلايا (يوم 20 ~)
- بعد ثلاثة أسابيع تنبيغ، يجب أن تظهر المستعمرات نمت بشكل صحيح لالتقاط.
- قبل يوم من اختيار المستعمرات، وإعداد MEF المغذية في 24 لوحة جيدا.
ملاحظة: نحن نستخدم 12.5 × 10 5 من MEF في واحد 24 لوحة جيدا. - في اليوم التالي، وتغيير المتوسطة من الأطباق MEF من وسائل الاعلام الخلايا الليفية الإنسان إلى وسائل الإعلام وفاق مع 10 ميكرومتر Y-27632. اختيار يدويا مستعمرة واحدة في كل مرة تحت المجهر في قطف هود وجعل كتل أصغر من قبل pipetting ونقلهاعلى إعدادها حديثا MEF dishes.Try لاختيار العديد من الحيوانات المستنسخة.
- مرور وتوسيع كل بئر من 24 لوحة جيدا إلى 6 لوحة جيدا في البداية. ثم من لوحة 6 جيدا إلى 60 ملم الأطباق قبل مزيد من الانتشار.
8. توصيف iPSCs البشرية (بعد 10 مقاطع)
- المناعي
- لوحة iPSCs الإنسان في 24 لوحة جيدا والثقافة خلال 4-5 أيام مع تغير وسائل الإعلام يوميا.
- لبدء الفحص المناعي، وغسل لوحة مع D-PBS مرة واحدة. ثم إصلاح الخلايا مباشرة في بارافورمالدهيد 0.4٪ لمدة 30 دقيقة. بعد أن يغسل ثلاث مرات في مد برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق.
- علاج الخلايا الثابتة بنسبة 0.1٪ تريتون X-100 الحل في برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- نضح الحل permeablization (0.1٪ تريتون X-100 الحل)، ثم يضاف 0.5٪ BSA حل حجب لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- إجراء كشف NANOG، أكتوبر 4، SSEA (مرحلة محددة antig الجنينيةأون) وTRA-1-81 (الورم رفض مستضد) باستخدام الأجسام المضادة لمكافحة الإنسان في 0.5٪ BSA الحل (راجع الجدول المواد لمعدل الأجسام المضادة التخفيف). احتضان الضد الابتدائية لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة. ثم يغسل ثلاث مرات في مد برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لكل منهما.
- تحقق باستخدام المجهر مضان بعد 1 ساعة من الحضانة مع اليكسا فلور 488 الماعز المضادة للماوس مفتش الأضداد ك 2 الثانية الأجسام المضادة، التي المخفف 1:2،000 في 0.5٪ BSA الحل في درجة حرارة الغرفة. وصمة عار كل نوى كل الخلايا المغذية MEF وhiPSCs مع دابي.
- RT-PCR لتأكيد التحوير
- استخراج مجموع مرنا من بيليه الخلية باستخدام الكواشف استخراج الحمض النووي الريبي.
- القيام على عكس النسخ مأخوذة (1 ميكروغرام) من الحمض النووي الريبي مجموع وكدنا] الناتجة عن PCR التضخيم من قبل الناسخ العكسي.
- تحضير مخاليط PCR لاحتواء 2 ميكرولتر من قالب [كدنا]، 10 ميكرولتر من مزيج الرئيسي 2X PCR، 2 ميكرولتر من 2 بمول الاشعال(إلى الأمام: 1 ميكرولتر وعكس: 1 ميكرولتر) و 6 ميكرولتر من DW. للكشف عن التعبير الجيني، تفعل RT-PCR مع الاشعال المدرجة في الجدول 1.
- أداء RT-تقارير إنجاز المشروعات مع GAPDH الجين كعنصر تحكم لكفاءة ردود الفعل التضخيم. تصور وتحليل PCR المنتج بنسبة 1٪ الاغاروز هلام الكهربائي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الخلايا الليفية عادة المصابين لا تظهر أي تغيرات شكلية في عدة أيام بعد تنبيغ فيروس سينداي، ولكن بعد خمسة أيام، أنها بداية لديهم أشكال مختلفة (الشكل 1). كما هو موضح في اللوحة اليمنى من الشكل 1، وخلايا لم يكن لديك مورفولوجيا الخلايا الليفية النموذجية أي أكثر من ذلك. لديهم شكل دائري وأكبر نواة من السيتوبلازم. حتى عندما يتم تنفيذ تنبيغ في 80٪ confluency الخلوية، ويبدو أنهم أقل متكدسة في البئر بعد أن تبدأ في إعادة برمجة. إذا هذه الأنواع من التغيرات المورفولوجية تبدأ في أن ينظر في أكثر من البئر، transduced الخلايا الليفية هي على استعداد ليكون مطلي على أطباق الثقافة MEF-المغذية.
في بروتوكول لدينا، ونحن على نطاق مصغر خلية ثقافة وكما قدم مختلف الاحتمالات إعادة برمجة، مثل توظيف مختلف كثافة الخلايا الليفية وعيار الفيروس، وبعد ذلك العديد من نسبة إعادة الطلاء، MEF، الأمر الذي سيزيد hiPSCs كفاءة توليد ( في بداية إعادة برمجة على مغذيات MEF، فمن الصعب أن نميز أنواع الخلايا transduced، ولكن بعد أكثر من أسبوع واحد من زملاء والثقافة، وتظهر الخلايا الليفية برمجتها جزئيا وتبدو وكأنها خففت ES-مثل شكل (الشكل 3). لهذا السبب عندما المستعمرات التوجيهية الإنسان مستعدون للالركض في طبق جديد المغذية MEF، قطف دليل هو وسيلة أكثر كفاءة لنقل بدلا من التفكك مع الانزيم. في الشكل 3 والشكل 4، تحت المجهر iPSCs الإنسان فقط لها حواف واضحة، والتي تفرق تفريقا واضحا بين iPSCs الإنسان (تعتبر 'الخلايا التي أعيدت برمجتها بالكامل') و 'خلايا برمجتها بشكل غير كامل "من قبل التشكل. الخلايا التي أعيدت برمجتها بالكامل الصغرىطيب مثل المدمجة ومعبأة بإحكام. وخاصة المستعمرات ديك حدود واضحة، في حين أن الخلايا التي أعيدت برمجتها جزئيا تبدو وكأنها تجمع معا لجعل مستعمرة ولكن تفقد جدا وهشة لكسر. حتى لو كنا نفعل pipetting بلطف يتم فصل بسهولة. حتى بعد استبعاد إعادة برمجة جزئيا iPSCs الإنسان المستعمرات (خلال توسيعها والركض)، تحتاج iPSCs الإنسان برمجتها بالكامل لأن تحتفظ بها قطف اليدوي. بعد حصوله المستعمرات وتوسيع استنساخ hiPSC في غضون عدة أسابيع، التعبير عن علامات stemness يحتاج يحدد لاحقا. بعد التوسع في استنساخ hiPSC، ونحن تحقق لهم مجموعات مختلفة من الاختبارات، بما في ذلك تلوين الأجسام المضادة (SSEA4، أكتوبر 4، TRA-81 وNANOG) وRT-PCR من علامة المحفزة (لا يظهر البيانات) كوسيلة لمراقبة الجودة. مقارنة H9، وهما hiPSCs مختلفة إيجابية لSSEA4، أكتوبر 4، TRA-81، وNANOG. هذه النتيجة توضح أن iPSCs البشرية المكتسبة معزولة الجودة المحفزة ( أخيرا، ويبين الشكل 6 أننا لا يمكن الكشف عن أي تعبير التحوير في استنساخ hiPSC بواسطة RT-PCR. على الأقل أكثر من 10 مقاطع hiPSCs، الاشعال محددة (الجدول 1) لخارجية أكتوبر 4، سوكس-2، KLF-4 و ج MYC يمكن استخدامها مع عينات مراقبة إيجابية مع قوي مستوى التعبير التحوير. الجدول 1. الاشعال RT-PCR لتأكيد التحوير. هذه هي متواليات التمهيدي التي تستخدم لهيئة تنظيم الاتصالاتتأكيد nsgene. T م هو 50.6 درجة مئوية في جميع مجموعات التمهيدي. 
الشكل 1. التغيير الصرفي بعد تنبيغ فيروس سينداي. قبل تنبيغ، تظهر الخلايا الليفية نموذجية مثل مغزل الشكل (إلى اليسار). بعد ما يقرب من ثمانية أيام تنبيغ، مورفولوجيا تغير الخلية transduced أكثر من ذلك بكثير مثل شكل دائري (يمين). الرجاء النقر حيحرث لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. 
الرقم 2. مخطط خطة تحريض لضمان أقصى قدر من الكفاءة. أكثر من أربعة أنواع مختلفة من الخلايا يمكن مطلي في 24 لوحة جيدا (1-4). لأن القدرة تمسكهم وبقاء الخلية يمكن أن تكون مختلفة تعتمد على أنواع الخلايا، ويقترح لوحة كثافة مختلفة من الخلايا (من 200K إلى 6.25K خلايا لكل بئر). بالإضافة إلى ذلك، تركيز الفيروس يمكن تعديلها (0.5X، 1X 2X و). 
الرقم 3. تشكيل مستعمرة الإنسان يسببها الخلايا الجذعية المحفزة من و transducedibroblast. في حوالي اسبوعين بعد إعادة تصفيح-لهم في MEFs، يجب أن تظهر مستعمرات مستديرة وتبدو وكأنها مستعمرات الخلايا الجذعية الجنينية البشرية. عادة المستعمرات التوجيهية الإنسان برمجتها بالكامل لديها حدود واضحة جدا. (السهم: برمجتها بالكامل المستعمرات البشرية التوجيهية، رأس السهم: برمجتها جزئيا iPSCs الإنسان). اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر . 
الشكل 4. التقاط الإنسان الجذعية المحفزة التي يسببها المستعمرات الخلية. وغالبا ما تحيط المستعمرات التوجيهية الإنسان من قبل خلايا برمجتها جزئيا (يسار). تحت المجهر، واختيار ES مثل مستعمرة فقط، كسر في كتل صغيرة ثم نقل (يمين). بعد 2 ~ 3 مقاطع، هناك مستعمرات hiPSC غير متمايزة (أسفل واليسار). (السهم: برمجتها بالكامل المستعمرات البشرية التوجيهية، رأس السهم: الإنسان برمجتها جزئيا iPSCs) اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر . 
الرقم 5. تلطيخ المناعي مع علامات الخلايا الجذعية المحفزة. يظهر الفحص المناعي iPSCs الإنسان ديك stemness features.SSEA-4، TRA-81، NANOG، علامات المحفزة أكتوبر 4AS ودابي هو السيطرة لتلطيخ النواة. (A) يمثل H9 تلطيخ كعينة مراقبة. (B) و (C) تظهر استنساخ التوجيهية الإنسان.وآخرون = "_blank"> اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر. 
الرقم 6. تأكيد مستوى التحوير التعبير. على الأقل بعد الثقافة 10 مرور iPSCs الإنسان، إسكات Sox2 الخارجية، KLF-4، ج MYC، وأكتوبر 4 مستويات التعبير الجيني ما تؤكده سلسلة من ردود الفعل الناسخ البلمرة العكسية. hGAPDH هو الرقابة الداخلية. لمراقبة إيجابية، يتم استخراج الحمض النووي الريبي من الخلايا الليفية transduced بقايا (يوم 7 بعد الإصابة سينداي الفيروسات). (1 لين: ماركر، الممرات 2-6: GAPDH، Klf4، ج MYC، أكتوبر 4، وسوكس-2 في مراقبة إيجابية، والممرات 7-11: GAPDH، Klf4، ج MYC، أكتوبر 4، وسوكس -2 في hiPSCs). اسم التمهيدي <الدفتيريا> تسلسل hOCT4 (F) CCC غا غا AGA AGC غا CCA G hOCT4 (R) AAT GTA TCG الاهلي GTG CTC AA hMYC (F) TAA CTG ACT AGC AGG CTT GTC G hMYC (R) TCC ACA TAC AGT CCT GGA TGA TGA TG hSOX2 (F) ACA AGA غا AAA ACA TGT ATG G hSOX2 (R) ATG CGC TGG TTC ACG CCC CCC GCG AGG hKLF4 (F) ACA AGA غا AAA ACA TGT ATG G hKLF4 (R) CGC GCT GGC AGG دول مجلس التعاون الخليجي GCT GCT CGA C hGAPDH (F) AGG TCG GAG TCA ACG GAT TTG hGAPDH (R) GTG ATG GCA TGG ACT GTG GT
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
إعادة برمجة الخلايا الجسدية البشرية لhiPSCs يحمل وعودا لم يسبق لها مثيل في البيولوجيا الأساسية، والطب الشخصي، وزرع 12. في السابق، وأجيال التوجيهية البشرية اللازمة فيروس الحمض النووي الذي يحتوي على مخاطر الاندماج في الجينوم المضيف، والتي يمكن أن تخلق طفرات جينية غير مرغوب فيها التي تحد من زيادة التطبيقات السريرية مثل تطوير الأدوية والعلاجات زرع 13. مع هذا السبب، تم الإبلاغ عن العديد من الدراسات لتوليد ناقلات وخالية من التحوير نظام iPSCs البشرية من خلال العديد من الطرق البديلة، ولكن في نفس الوقت، وكفاءة عزل 'القدم الطباعة الحرة' ينبغي النظر iPSCs الإنسان. على سبيل المثال، يجب أن يكون الفيروس RNA الحد الأدنى من انحراف الوراثية مقارنة مع الطرق الأخرى 14، رغم عدم وجود النشر لتسلسل الجينوم كله للتدليل على "سلامة الجينوم 'من سينداي بوساطة فيروس الجيل التوجيهية حتى الآن. هنا، نقدم طريقة لتوليد hiPSCs معسينداي الفيروسات التي لديها كفاءة عالية في برمجة سيلة فعالة من حيث التكلفة. وiPSCs البشرية الناجمة خالية من التحوير مع الحفاظ على التشابه الخلوية والجزيئية لhESCs في إمكانات التكاثري والتنموية.
يمكننا إعادة برمجة الخلايا الليفية من أصول مختلفة (> 4) في نفس الوقت مع مجموعة واحدة فقط من الفيروسات سينداي. وفي أسلوبنا، ونحن نطبق مختلف ملتقيات الخلية والخلافات جرعة الفيروس. يمكن هذا 'مزيج المباراة' تقنية الجمع تعظيم كفاءة إعادة برمجة. الخلايا الليفية (من مريض واحد) في كل بئر ومختلفة على مستوى عدوى الفيروس، ولكن عن طريق تجميع معا، يمكن أن إمكانية صنع hiPSCs المستعمرات زيادة بناء على خبرتنا. قضايا أخرى من التباين بين خطوط نسيلي hiPSC هي معدل الانتشار، مرفق خلية / بقاء، وحالة تعطيل كروموسوم X 15، والتمايز الامكانيات 16، الخ في الواقع، لاحظنا أن كل استنساخ لديها تختلفENT الميل العصبية، والتي يمكن التنبؤ من خلال قياس مستوى التعبير من مجموعة مير 371. بالإضافة نجحنا في توليد iPSCs الإنسان من myoblasts الإنسان مع هذا الأسلوب، مما يوحي بأن الفيروسات سينداي يمكن استخدامها لكثير من أنواع مختلفة من الخلايا في عملية إعادة برمجة. وعلاوة على ذلك، وذلك باستخدام طريقة لدينا، ونحن قد ولدت hiPSCs في أكثر من 10 مرض الخلايا الليفية المتعلقة مختلفة. في المتوسط، ويمكن الحصول على 5-10 استنساخ hiPSC من الخلايا الليفية واحدة.
على الرغم من اشتقاق خلايا الجذع الإنسان خالية من التحوير مع الفيروسات سينداي هو الأسلوب الأكثر كفاءة إعادة برمجة التي يمكن أن تكون مسارات الأكثر عملية، وهناك عدد قليل من القيود التي يتعين النظر فيها في هذا البروتوكول؛
- اعتمادا على كل دفعة سينداي الفيروسات، يحتاج عيار الفيروس يتم حسابها لتتفق وزارة الداخلية (كما هو موضح في 2.4).
- لاحظنا أن التباين في نقل العدوى بين الخلايا الجسمية المختلفة، والتي تحتاج أيضا معايرة إضافية للروبوعدوى فيروسية الحادي والعشرين.
- وتتوسط إعادة برمجة فيروس سينداي يمكن اعتبارها واحدة من أفضل الخيارات لأغراض البحث. ولكن بالنسبة للتجربة سريرية، فإنه قد لا يكون الخيار الأول، لأنه ليس هناك قضية ترخيص مع الشركة التي وضعت أصلا للنظام فيروس سينداي.
- يستغرق حوالي شهرين حتى إعادة برمجة الخلايا الجسدية خالية من الجينات المحورة، والذي هو السبب في أننا بحاجة إلى التحقق من التعبير التحوير بعد لا يقل عن 10 الممرات.
- يبدو أن عدد مرور الخلايا الليفية مثقف الابتدائي قد تؤثر على كفاءة إعادة برمجة مع الفيروسات سينداي، على الرغم من أننا لم يكن لديك المقارنة المباشرة. يحتاج معدل الانتشار أيضا يحدد لاحقا. هناك حاجة لدراسات إضافية لتحديد تأثير الخلايا الليفية أرقام المرور وانتشارها على كفاءة إعادة برمجة.
- في هذه الدراسة، ونحن نستخدم طبقة المغذية الماوس لتوليد hiPSC والصيانة، ولكن نظام حر المغذية قد يكون البديلةالطريقة الإلكترونية في دراسة المستقبل.
لقد كان لدينا البروتوكول الحالي خطوة مهمة نحو دراسة hiPSCs المريض محددة لنمذجة المرض، الطب التجديدي، وغيرها من التطبيقات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
والكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
نود أن نشكر أعضاء المختبر لي لإجراء مناقشات قيمة على المخطوطة. وأيد العمل في المختبر لي من المنح المقدمة من روبرتسون جائزة الباحث نيويورك مؤسسة الخلايا الجذعية من ولاية ماريلاند وصندوق أبحاث الخلايا (TEDCO) الجذعية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CytoTune-iPS Reprogramming Kit | Invitrogen | A1378002 | |
| CF-6,MEFs, neomycin-resistant, mitomycin C treated | Global stem | GSC-6105M | 5 x 105/6 cm or 12.5 x 105/24-well plate |
| Trypsin EDTA 0.25% Trypsin with EDTA 4Na 1X | Invitrogen | 25200114 | |
| DMEM/F-12 medium | Invitrogen | 11330-032 | |
| 24-well Cell Culture Plate, flat-bottom with lid | BD | 353935 | |
| Y-27632 | TOCRIS | 1254 | 10 μM (Stock: 10 mM) |
| basic fibroblast growth factor | LIFE TECHNOLOGIES | PHG0263 | 10 ng (Stock : 100 ug) |
| Knock-out serum replacement | Gibco | 10828028 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (D-MEM, DMEM) (1X), liquid (high glucose) | Invitrogen | 11965118 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Scientific Fermentas | SH30071.03 | |
| L-Glutamine-200 mM (100X), liquid | GIBCO | 25030-081 | 1/100 |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X | LIFE TECHNOLOGIES | 11140050 | 1/100 |
| 2-Mercaptoethanol (1,000X), liquid | GIBCO | 21985023 | 1/1,000 |
| Hausser Phase Contrast Hemacytometers | Hausser Scientific | 02-671-54 | |
| EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution | Millipore | ES-006-B | |
| SSEA-4 | DSHB | MC-813-70 | 1/200 |
| anti-Tra-1-81 | Cell Signaling | 4745S | 1/200 |
| mouse monoclonal Oct4 antibody | Santa Cruz | SC-5279 | 1/1,000 |
| Nanog | R&D | AF1997 | 1/1,000 |
| Alexa Flouor 488 goat anti-mouse | Invitrogen | 948492 | 1/2,000 |
| DPBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline), 1X without calcium & magnesium | Cellgro | 21-031-CV | |
| QuantiTect Reverse Transcription Kit | QIAGEN | 205313 | |
| PCR Master Mix [2X] | Thermo Scientific Fermentas | K0171 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596018 | |
| picking hood | NuAire | NU-301 | |
| dissecting scope | Nikon | SMZ745 |
References
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
- Okita, K., Nakagawa, M., Hyenjong, H., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of mouse induced pluripotent stem cells without viral vectors. Science. 322, 949-953 (2008).
- Zhou, W., Freed, C. R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27, 2667-2674 (2009).
- Woltjen, K., et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458, 766-770 (2009).
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8, 409-412 (2011).
- Yusa, K., Rad, R., Takeda, J., Bradley, A. Generation of transgene-free induced pluripotent mouse stem cells by the piggyBac transposon. Nature Methods. 6, 363-369 (2009).
- Kim, D., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins. Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).
- Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
- Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature. 448, 313-317 (2007).
- Yoshioka, N., et al. Efficient Generation of Human iPSCs by a Synthetic Self-Replicative RNA. Cell Stem Cell. 13, 246-254 (2013).
- Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. K., Ye, Z., Cheng, L. Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression. Nature Protocols. 7, 2013-2021 (2012).
- Fluri, D. A., et al. Derivation, expansion and differentiation of induced pluripotent stem cells in continuous suspension cultures. Nature Methods. 9, 509-516 (2012).
- Nakagawa, M., et al. Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts. Nature Biotechnology. 26, 101-106 (2008).
- Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. P Jpn Acad B-Phys. 85, 348-362 Forthcoming.
- Silva, S. S., Rowntree, R. K., Mekhoubad, S., Lee, J. T. X-chromosome inactivation and epigenetic fluidity in human embryonic stem cells. P Natl Acad Sci USA. 105, 4820-4825 (2008).
- Kim, H., et al. miR-371-3 expression predicts neural differentiation propensity in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 8, 695-706 (2011).
