Summary
Ici, nous vous présentons notre méthode établie pour reprogrammer des cellules somatiques humaines dans CSPi humaines sans transgène avec le virus de Sendai, qui montre des résultats cohérents et une efficacité accrues.
Abstract
Il ya quelques années, la mise en place de cellules souches pluripotentes humaines induites (CISP) a inauguré une nouvelle ère dans le domaine biomédical. Les usages potentiels des CSPi humaines comprennent la modélisation pathogenèse des maladies génétiques humaines, la thérapie cellulaire autologue après la correction de gène, et le dépistage des drogues personnalisé en fournissant une source de cellules pertinentes et des symptômes spécifiques du patient. Cependant, il existe de nombreux obstacles à surmonter, par exemple en éliminant le facteur de reprogrammation expression transgène qui reste après la production de iPSCs humains. Plus important encore, l'expression du transgène résiduelle dans CSPi humaines indifférenciées pourrait entraver différenciations propres et égarer l'interprétation de la maladie pertinents dans les phénotypes in vitro. Avec cette raison, sans l'intégration et / ou CSPi humaines libre transgènes ont été développés en utilisant plusieurs méthodes, telles que l'adénovirus, le système de piggyBac, vecteur minicercle, vecteurs épisomiques, la livraison directe des protéines et la synthèse de l'ARNm. Cependant, l'efficacité de reprogramming utilisant des méthodes sans rapprochement est très faible dans la plupart des cas.
Ici, nous présentons une méthode pour isoler CSPi humaines en utilisant Sendai-virus (virus à ARN) du système de reprogrammation base. Cette méthode de reprogrammation montre des résultats cohérents et de haute efficacité de manière rentable.
Introduction
Cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) ont une capacité d'auto-renouvellement in vitro et ont pluripotence, qui pourrait être potentiellement utile pour la modélisation de la maladie, pour le criblage de médicaments, et de développer des thérapies à base de cellules pour traiter les maladies et les blessures des tissus. Toutefois, les CSEh ont une limitation pour la thérapie de remplacement de la cellule en raison de barrières immunologiques, oncologiques et éthiques, et à étudier les gènes liés à la maladie, les CSEh spécifiques à la maladie ont pu être isolés par diagnostic pré-implantatoire génétique (DPI) des approches, mais il est encore techniquement difficile et les dons d'embryons sont assez rares. Ces problèmes sont liés au progrès de la biologie des cellules souches, ce qui a conduit à la mise au point de cellules souches pluripotentes induites (hiPSCs).
CSPi humaines sont génétiquement reprogrammées à partir de cellules somatiques humaines adultes et abritent souches caractéristiques de cellules pluripotentes comme similaires à CSEh, qui les rend une source utile pour la médecine régénérative, comme ddécouverte de tapis, la modélisation des maladies et de thérapie cellulaire chez un patient spécifique de manière 1,2.
Jusqu'à présent, il existe plusieurs méthodes pour générer des CSPi humaines, y compris le virus médiation (rétrovirus et adénovirus) 3, non-virus médiation (système de BAC et les vecteurs de transfection) 4 transductions de gènes et de protéines système de livraison 5-7.
Même si une livraison de gènes du virus médiée peut assurer un certain niveau d'efficacité, des vecteurs viraux peuvent laisser l'empreinte génétique, car ils s'intègrent dans les chromosomes de l'hôte pour exprimer des gènes de reprogrammation d'une manière incontrôlée. Même lorsque l'intégration virale de facteurs de transcription peut activer ou inactiver les gènes de l'hôte 8, il peut provoquer une aberration génétique inattendu et le risque de tumorigenèse 5,9. D'autre part, l'introduction directe de protéines ou d'ARN dans les cellules somatiques ont été rapportés, mais ils ont quelques inconvénients tels que main-d'œuvre, transf répétéeection, et le faible niveau de la reprogrammation de 7,10. Même adénovirus épisomique et sans intégration, virus adéno-associés, et les vecteurs plasmidiques sont encore relativement moins efficace 11. Pour ces raisons, il est plausible de choisir non-intégration des méthodes de reprogrammation avec une grande efficacité de la production iPSC et moins d'anomalies génétiques. Dans cette étude, nous utilisons une reprogrammation base Sendai-virus. Ce procédé est connu pour être non-intégrés dans le génome de l'hôte et produit constamment iPSCs humains sans intégration du transgène.
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Protocol
1. Préparation de la cellule et des médias (Jour 1)
- Culture et élargir fibroblastes humains avec du milieu DMEM contenant 10% de FBS.
- Plate fibroblastes humains (figure 1) sur une plaque de 24 puits à la densité appropriée pour bien le jour avant la transduction.
REMARQUE: Les dilutions en série suivantes sont recommandées (200K, 100K, 50K, 25K, 12.5K et 6.25K) parce que différents types de cellules ont la capacité de fixation différents. - Incuber les cellules pour un jour de plus dans un 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur, assurant que les cellules ont pleinement adhéré et étendu.
2. Effectuer transduction (Jour 2)
- Le jour de la transduction, vérifier la densité cellulaire et choisir les plus efficaces puits de la densité (figure 2). Il est préférable de choisir trois densités différentes: haute (80 ~ 90%), moyen (50 ~ 70%) et faible (20 ~ 40%).
- Au moins 1 heure avant la transduction, aspirer le fibroblmédias ast des cellules et modifier nouveaux 300 pi de milieu de fibroblastes.
- Supprimer un jeu de 4 différents tubes de virus Sendai de -80 ° C stockage. Décongeler chaque tube en même temps dans un bain-marie à 37 ° pendant quelques secondes, puis prendre les tubes à partir du bain d'eau. Après cela, les décongeler à la température ambiante; tubes de centrifugation à 6000 g pendant 10 secondes et les placer sur la glace jusqu'à utilisation. Ne pas réutiliser gel et de dégel du virus depuis les titres ne seront pas maintenir.
- Ajouter les volumes de chacun des quatre tubes de virus Sendai (Oct-4, Klf-4, c-Myc et Sox-2) indiquées au tube de micro-centrifugeuse. Assurez-vous que la solution est bien mélangée par pipetage.
Par exemple, si 50K cellules / un puits de 24 puits plaque lookwell pour la transduction:
(Titre basé sur le certificat d'analyse de Life Technologies, peut être différent d'un lot à)
Tube hOct-4 = 6,0 x 10 7 SDI, 3 MOI = 5 pi
Tube hSox-2 = 6,5 x 10 7 SDI, 3 MOI = 4,6 μ; L
Tube hKlf-4 = 6,3 x 10 7 SDI, 3 MOI = 4,8 pi
Tube hc-Myc = 7,8 x 10 7 SDI, 3 MOI = 3,8 pi
Total = 18.2 pi de quatre facteurs de virus mélange / un puits (50K cellules) de la plaque de 24 puits - Selon les densités cellulaires; ajouter 2X, 1X, 0,5 X et le volume du mélange de virus dans le puits. Secouer doucement le devant de la plaque à l'arrière, à gauche et à droite (2X: 36,4 pi de mélange de virus, 1X: 18,2 pi et 0.5X: 9,1 pi).
- Placer les cellules dans un 37 ° C, 5% CO 2 incubateur et incuber pendant une nuit.
3. Remplacement du milieu de culture (Jour 3 & Jour 5)
- 24 heures après la transduction, remplacer le milieu avec 500 moyen de fibroblastes ul frais.
- Le jour 5, changement de milieu avec les médias des fibroblastes frais.
4. Préparer des plats du MEF pour la co-culture (Jour 8)
- Préparer les cellules MEF dans 60 boîtes de culture mm avec 10% de FBS contenait un milieu DMEM day repiquer avant le fibroblaste transduit sur cellules nourricières du MEF.
Remarque: Nous utilisons 5 x 10 5 MEF dans chaque boîte de 60 mm.
5. Démarrer co-culture de cellules transduites avec des cellules nourricières du MEF (Jour 9)
- Avant étalement des cellules transduites, aspirer 10% de FBS contenait milieu DMEM de plats d'alimentation du MEF et ajouter frais 10% de FBS contenait milieu DMEM.
- Supprimer le milieu à partir des fibroblastes qui sont transduites dans la plaque à 24 puits et laver les cellules une fois avec du D-PBS. Ajouter 200 ul de 0,25% de trypsine / EDTA dans les cellules de fibroblastes inThe plaque de 24 puits. Après moins de 5 minutes d'incubation avec de la trypsine / EDTA, lorsque les cellules commencent à se détacher de la plaque, de recueillir les cellules avec un milieu de croissance dans 15 ml de tube conique. Puis centrifuger les dans 6000 g pendant 4 min.
REMARQUE: La mise en commun 2X, 1X, 0.5X et virus fibroblastes transduction est recommandé. - Retirez le milieu surnageant et laver à remettre en suspensionle culot cellulaire avec 5.4 ml de milieu de fibroblastes frais pour la neutralisation de la trypsine. Puis centrifuger à 135 xg les pendant 4 min.
- Cellules de la plaque que la densité de dilution en série et commencer à co-culture avec des milieux de fibroblastes sur MEF: telle que 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64 et 1/128 par 60 plat mm. Selon le taux de mort cellulaire au cours de la première semaine de la transduction, on ne peut pas besoin de diluer à 1/2 ou 1/128 densité. Mettez de côté les cellules restantes pour extraire l'ARN total comme un contrôle positif pour Transgene RT-PCR.
- Placer des boîtes de 60 mm à 37 ° C, 5% CO 2 incubateur pendant une nuit.
6. Flux cellules souches embryonnaires humaines à moyen et surveiller les cellules (Jour 10)
- Le lendemain, changer de support fibroblastes aux médias ES humain avec 10 uM Y-27632. Après cela, changer moyen quotidien avec le milieu ES humain: 800 ml de DMEM/F12 + 200 ml Sérum de remplacement Knockout + 10 ml de L-Glutamine + 10 ml de 10 mM de MEM acides aminés non essentiels minimaux+ 1 ml de 2-mercaptoéthanol + 10 ng / ml de facteur de croissance basique des fibroblastes.
- Faire un changement quotidien des médias avec les médias de nouvelles souches embryonnaires humaines. Après une semaine, vérifiez les plats une fois par 2 ~ 3 jours sous un microscope pour la formation d'amas de cellules ES colonies comme. Selon le type de cellule, la culture aura plus ou moins de temps avant colonies se trouvent.
7. Cueillette de la souches pluripotentes induites colonies cellulaires et Développer les cellules (Jour 20 ~)
- Trois semaines après la transduction, les colonies doivent apparaître grandi bien pour la cueillette.
- La veille de la cueillette des colonies, préparer MEF alimentation en plaque de 24 puits.
NOTE: Nous utilisons 12,5 x 10 5 MEF dans une plaque de 24 puits. - Le lendemain, changement de milieu de plats MEF de médias de fibroblastes de médias ES humain avec 10 uM Y-27632. Choisir manuellement une colonie à chaque fois sous le microscope dans la cueillette de capot et faire des petits bouquets de pipetage et de les transférersur fraîchement préparée MEF dishes.Try de choisir plusieurs clones.
- Passage et développer chaque puits d'une plaque de 24 puits à une plaque à 6 puits initialement. Ensuite, à partir d'une plaque à 6 puits à une boîtes de 60 mm avant la propagation ultérieure.
8. Caractérisation des iPSCs humain (après 10 passages)
- Immunofluorescence
- Plaque CSPi humaines dans la plaque et de la culture de 24 puits pendant 4-5 jours avec changement de support quotidienne.
- Pour commencer immunofluorescence, laver la plaque avec le D-PBS fois. Puis fixer les cellules immédiatement dans 0,4% de paraformaldéhyde pendant 30 min. Après que les laver trois fois dans du D-PBS pendant 5 min.
- Traiter les cellules fixées avec 0,1% de Triton X-100 solution dans du PBS pendant 15 min à température ambiante.
- Aspirer la solution de permeablization (0,1% triton X-100 solution), puis ajouter une solution à 0,5% de blocage de BSA pendant 1 heure à température ambiante.
- Effectuer une détection de Nanog, Oct-4, l'AESS (Antig embryonnaire spécifique au stadefr) et TRA-1-81 (antigène de rejet tumoral) en utilisant un anticorps anti-humain dans une solution de BSA à 0,5% (consulter le tableau matière de taux de dilution d'anticorps). Incuber l'anticorps primaire pendant 2 heures à température ambiante. Puis laver trois fois dans D-PBS pendant 5 min chacun.
- Vérifier en utilisant la microscopie de fluorescence, après 1 h d'incubation avec Alexa Fluor 488 anticorps IgG de chèvre anti-souris comme 2 ème anticorps, qui sont dilué 1:2000 dans une solution de BSA à 0,5% à la température ambiante. Colorer tous les noyaux de chacune des cellules nourricières du MEF et hiPSCs avec DAPI.
- RT-PCR de Transgene Confirmation
- Extrait ARNm total de culot cellulaire en utilisant des réactifs d'extraction d'ARN.
- Faire une transcription inverse sur aliquotes (1 pg) de l'ARN total et l'ADNc résultant pour l'amplification PCR par transcriptase inverse.
- Préparer les mélanges de PCR pour contenir 2 pi de matrice d'ADNc, 10 pi de 2X PCR Master Mix, 2 pi de 2 pmol d'amorces(Avant: 1 pl et inverser: 1 pi) et 6 pi de DW. Pour détecter l'expression des gènes, faire la RT-PCR avec les amorces énumérées dans le tableau 1.
- Effectuer la RT-PCR avec le gène de la GAPDH comme contrôle pour l'efficacité des réactions d'amplification. Visualiser et analyser le produit de PCR par électrophorèse sur agarose-gel 1%.
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Representative Results
Habituellement fibroblastes infectés ne présentent pas de changements morphologiques dans plusieurs jours après la transduction du virus Sendai, mais cinq jours plus tard, ils commencent à avoir des formes différentes (Figure 1). Comme décrit dans un panneau de droite de la figure 1, les cellules n'ont pas la morphologie des fibroblastes typique plus. Ils ont une forme ronde et grand noyau de cytoplasme. Même lorsque la transduction est réalisée dans 80% de confluence cellulaire, on dirait qu'ils sont moins confluentes dans le puits après ils commencent à reprogrammer. Si ces types de changements morphologiques commencent à être vu dans la plupart des puits, des fibroblastes transduites sont prêts à être étalées sur des boîtes de culture MEF-nourricier.
Dans notre protocole, nous avons minimisé l'échelle de culture cellulaire et également donné de nombreuses possibilités de reprogrammation, comme employant densité différente de cellules de fibroblastes et le titre du virus, et la suite de plusieurs rapport re-placage MEF, ce qui augmentera hiPSCs efficacité de la production ( Au début de la reprogrammation sur les départs du MEF, il est difficile de distinguer les différents types de cellules transduites, mais après plus d'une semaine à partir de co-culture, les fibroblastes partiellement reprogrammées apparaissent et ressemble desserré forme ES-comme (Figure 3). Pour cette raison, lorsque les colonies humaines iPSC sont prêts pour le repiquage en nouveau plat d'alimentation MEF, cueillette manuelle est beaucoup plus efficace pour le transfert à la place de dissociation avec l'enzyme. Dans les figures 3 et 4, sous le microscope seulement CSPi humaines ont des bords nets, qui font une distinction claire entre CSPi humaines (considérés comme des «cellules reprogrammées pleinement») et les «cellules reprogrammées incomplète» par la morphologie. Cellules reprogrammées entièrement look comme compact et bien emballé. En particulier, les colonies ont frontière claire, tandis que les cellules reprogrammées partiellement ressemblent rassembler pour faire colonie mais très perdent et fragile à se décomposer. Même si nous faisons un pipetage doucement se détache facilement. Même après exclusion partiellement reprogrammés iPSCs droits colonies (pendant les passages et expansion), CSPi humaines entièrement reprogrammées doivent être maintenus par la récolte manuelle. Après la cueillette des colonies et l'expansion de clones hiPSC dans plusieurs semaines, l'expression de marqueurs stemness doit être déterminé. Après l'expansion de clones hiPSC, on les vérifications à différents jeux de tests, y compris la coloration d'anticorps (SSEA4, Oct-4, TRA-81 et Nanog) et RT-PCR de marqueur pluripotent (données non représentées) comme un contrôle de qualité. Par rapport à H9, deux hiPSCs différents sont positifs à SSEA4, Oct-4, TRA-81, et Nanog. Ce résultat démontre que les CSPi humaines isolées acquis la qualité pluripotentes ( Enfin, la figure 6 montre que nous ne pouvons pas détecter toute l'expression du transgène dans les clones hiPSC par RT-PCR. Au moins plus de 10 passages hiPSCs, des amorces spécifiques (Tableau 1) pour exogène Oct-4, Sox-2, 4-Klf et c-Myc peuvent être utilisées avec des échantillons témoins positifs avec le niveau d'expression de transgène forte. Tableau 1. Amorces de RT-PCR pour la confirmation du transgène. S'agit des séquences d'amorces qui sont utilisées pour traconfirmation NsGene. T m est égal à 50,6 ° C dans tous les ensembles d'amorces. 
Figure 1. Changement morphologique après transduction du virus de Sendai. Avant la transduction, les fibroblastes montrent forme de broche-comme typique (à gauche). Environ huit jours après la transduction, la morphologie de changement de cellule transduction comme beaucoup plus en forme de tour (à droite). S'il vous plaît cliquer hERE pour voir une version plus grande de cette figure. 
Figure 2. Schéma de plan d'induction pour assurer une efficacité maximale. Plus de quatre différents types de cellules peuvent être étalées dans une plaque de 24 puits (de 1 à 4). En raison de leur capacité de fixation et la survie des cellules pourraient être différents dépend des types de cellules, il est suggéré à la plaque densité cellulaire différente (de 200K à 6.25K cellules par puits). En outre, la concentration de virus peut être ajustée (0.5X, 1X et 2X). 
Figure 3. Formation de colonies de cellules souches pluripotentes humaines induites par transduction à partir de fibroblast. Dans environ deux semaines après les re-placage en MEF, colonies rondes devraient apparaître et ressembler à des colonies de cellules souches embryonnaires humaines. Normalement, les colonies iPSC humaines entièrement reprogrammées ont des limites très nettes. (Flèche: entièrement reprogrammé colonies humaines iPSC, flèche: iPSCs humain partiellement reprogrammé). Cliquez ici pour agrandir l'image . 
Figure 4. Reprenant pluripotentes colonies de cellules souches d'origine humaine. Colonies iPSC humaines sont souvent entourés par des cellules reprogrammées partiellement (à gauche). Sous le microscope, la cueillette de la colonie ES-comme seul, se décomposent en petits bouquets, puis transfert (à droite). Après 2 à 3 passages, il ya des colonies de hiPSC indifférenciées (en bas et à gauche). (Flèche: colonies entièrement reprogrammées iPSC humaines, flèche: humain partiellement reprogrammé CISP) Cliquez ici pour agrandir l'image . 
Figure 5. Immunofluorescence avec des marqueurs pluripotentes de cellules souches. Immunofluorescence montre CSPi humaines ont stemness features.SSEA-4, TRA-81, Nanog, marqueurs pluripotentes Oct-4AS et DAPI est un contrôle pour la coloration noyau. (A) représente H9 coloration comme échantillon de contrôle. (B) et (C) montrent des clones iPSC humaines.et = "_blank"> Cliquez ici pour agrandir l'image. 
Figure 6. Confirmation de niveau de l'expression du transgène. Au moins après culture de 10 passage de iPSCs humaines, au silence de Sox2 exogène, Oct-4 niveaux d'expression des gènes Klf-4, c-Myc, et est confirmé par des réactions en chaîne transcriptase polymerase inverse. hGAPDH est un contrôle interne. Pour un contrôle positif, l'ARN est extrait à partir de fibroblastes restes de transduction (Jour 7 après l'infection Sendai-virus). (Piste 1: marqueur, voies 2 - 6: GAPDH, Klf4, c-Myc, Oct-4, et Sox-2 dans le contrôle positif, lignes 7 - 11: GAPDH, Klf4, c-Myc, Oct-4, et Sox -2 dans hiPSCs). Nom Primer <td> Séquence hOCT4 (F) CCC GAA GAA AGA AGC GAA CCA G hOCT4 (R) AAT GTA TCG AAG GTG CTC AA hMYC (F) TAA CTG ACT AGC AGG CTT GTC G hMYC (R) TCC ACA TAC AGT CCT GGA TGA TGA TG hSOX2 (F) ACA GAA AGA AAA ACA TGT ATG G hSOX2 (R) ATG CCG TGG TTC ACG CCC CCC GCG AGG hKLF4 (F) ACA GAA AGA AAA ACA TGT ATG G hKLF4 (R) CCG GCT GGC AGG GCC GCT GCT CGA C hGAPDH (F) AGG TCG GAG TCA ACG GAT TTG hGAPDH (R) GTG ATG GCA TGG LOI GTG GT
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Discussion
Reprogrammation des cellules somatiques humaines à hiPSCs détient promesses sans précédent dans la biologie fondamentale, la médecine personnelle, et la transplantation 12. Auparavant, les générations iPSC humaines requises virus à ADN qui a un risque d'intégration dans le génome de l'hôte, ce qui peut créer des mutations génétiques indésirables qui limitent d'autres applications cliniques telles que le développement de médicaments et de thérapies de transplantation 13. Avec cette raison, de nombreuses études ont été rapportés pour générer des vecteurs et système CSPi humaines libre de transgéniques par plusieurs méthodes, mais en même temps, l'efficacité de l'isolement «sans empreinte» CSPi humaines devraient être pris en considération. Par exemple, le virus à ARN doit avoir un niveau minimum d'aberration génétique comparer à d'autres méthodes 14, bien qu'il n'y ait pas de publication pour le séquençage du génome entier de démontrer la «sécurité génomique" de sendai génération iPSC virus médiée encore. Ici, nous présentons une méthode pour générer hiPSCs avec leSendai-virus qui a une grande efficacité de la reprogrammation de manière rentable. Les CSPi humaines qui en résultent sont sans transgène avec le maintien de similitudes cellulaires et moléculaires de CSEh à potentiel de prolifération et de développement.
Nous ne pouvons reprogrammer différentes origines de fibroblastes (> 4) en même temps avec un seul ensemble de la Sendai-virus. Et dans notre méthode, nous appliquons divers confluents de cellules et les différences de dosage de virus. Cette technique de combinaison «mix and match» peut maximiser l'efficacité de la reprogrammation. Fibroblastes (à partir d'un seul patient) dans chaque puits ont un niveau d'infection de virus différent, mais en regroupant, la possibilité de faire hiPSCs colonies pourraient augmenter sur la base de notre expérience. D'autres questions de la variation clonale entre les lignes hiPSC sont taux de prolifération, la fixation des cellules / survie, le statut de l'inactivation du chromosome X 15, la différenciation des potentiels 16, etc En effet, nous avons observé que chaque clone a une différenceORL propension de neurones, ce qui pourrait être prédit en mesurant le niveau d'une grappe mir-371 expression. En outre, nous avons réussi à générer des CSPi humaines de myoblastes humains avec cette méthode, ce qui suggère que le virus Sendai-peut être utilisé pour de nombreux types de cellules différents dans le processus de reprogrammation. En outre, en utilisant notre procédé, nous avons généré hiPSCs dans plus de 10 fibroblastes de la maladie liée différentes. En moyenne, 5 à 10 clones hiPSC pourraient être obtenus à partir d'un fibroblaste.
Bien que la dérivation de cellules iPS humaines sans transgène avec le Sendai-virus est la méthode de reprogrammation plus efficace qui pourrait être les voies les plus pratiques, il ya quelques limites à prendre en considération dans ce protocole;
- En fonction de chaque lot sendai-virus, le titre de virus doit être calculé pour MOI compatible (comme décrit au paragraphe 2.4).
- Nous avons observé la variation de l'infectiosité entre les différentes cellules somatiques, qui doit également titrage supplémentaire pour Robust infection virale.
- Le virus Sendai à médiation reprogrammation peut être considéré comme l'un des meilleurs choix pour des fins de recherche. Mais pour l'essai clinique, il pourrait ne pas être le premier choix, car il s'agit d'un problème de licence avec la société qui a développé à l'origine du système de virus Sendai.
- Il faut environ deux mois jusqu'à ce que les cellules somatiques reprogrammées sont exempts de transgènes, ce qui explique pourquoi nous avons besoin de vérifier l'expression du transgène après au moins 10 passages.
- Il semble que le nombre de passage de la culture de fibroblastes primaires peut affecter l'efficacité de la reprogrammation de la Sendai-virus, même si nous n'avons pas une comparaison directe. Le taux de prolifération doit également être déterminé. D'autres études sont nécessaires pour déterminer l'effet de fibroblastes numéros de passage et de leur prolifération sur l'efficacité de la reprogrammation.
- Dans cette étude, nous utilisons une couche d'alimentation de la souris pour la production et la maintenance hiPSC, mais un système sans chargeur peut être une alternativfaçon de e dans une étude future.
Notre protocole actuel a été une étape importante vers l'étude hiPSCs spécifiques au patient pour la modélisation de la maladie, la médecine régénérative, et d'autres applications.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier les membres du laboratoire Lee pour des discussions utiles sur le manuscrit. Le travail dans le laboratoire Lee a été soutenue par des subventions de Robertson Investigator Award de New York Fondation des cellules souches et du Maryland souches Fonds de recherche sur les cellules (TEDCO).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CytoTune-iPS Reprogramming Kit | Invitrogen | A1378002 | |
| CF-6,MEFs, neomycin-resistant, mitomycin C treated | Global stem | GSC-6105M | 5 x 105/6 cm or 12.5 x 105/24-well plate |
| Trypsin EDTA 0.25% Trypsin with EDTA 4Na 1X | Invitrogen | 25200114 | |
| DMEM/F-12 medium | Invitrogen | 11330-032 | |
| 24-well Cell Culture Plate, flat-bottom with lid | BD | 353935 | |
| Y-27632 | TOCRIS | 1254 | 10 μM (Stock: 10 mM) |
| basic fibroblast growth factor | LIFE TECHNOLOGIES | PHG0263 | 10 ng (Stock : 100 ug) |
| Knock-out serum replacement | Gibco | 10828028 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (D-MEM, DMEM) (1X), liquid (high glucose) | Invitrogen | 11965118 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Scientific Fermentas | SH30071.03 | |
| L-Glutamine-200 mM (100X), liquid | GIBCO | 25030-081 | 1/100 |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X | LIFE TECHNOLOGIES | 11140050 | 1/100 |
| 2-Mercaptoethanol (1,000X), liquid | GIBCO | 21985023 | 1/1,000 |
| Hausser Phase Contrast Hemacytometers | Hausser Scientific | 02-671-54 | |
| EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution | Millipore | ES-006-B | |
| SSEA-4 | DSHB | MC-813-70 | 1/200 |
| anti-Tra-1-81 | Cell Signaling | 4745S | 1/200 |
| mouse monoclonal Oct4 antibody | Santa Cruz | SC-5279 | 1/1,000 |
| Nanog | R&D | AF1997 | 1/1,000 |
| Alexa Flouor 488 goat anti-mouse | Invitrogen | 948492 | 1/2,000 |
| DPBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline), 1X without calcium & magnesium | Cellgro | 21-031-CV | |
| QuantiTect Reverse Transcription Kit | QIAGEN | 205313 | |
| PCR Master Mix [2X] | Thermo Scientific Fermentas | K0171 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596018 | |
| picking hood | NuAire | NU-301 | |
| dissecting scope | Nikon | SMZ745 |
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