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Biology

सेंडाइ वायरस के साथ मानव दैहिक कोशिकाओं से कुशल उत्पादन मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल

Published: April 23, 2014 doi: 10.3791/51406
Automatic Translation
1, 1, 1
1Institute for Cell Engineering, Department of Neurology and Neuroscience, Johns Hopkins University School of Medicine

Summary

यहाँ, हम लगातार परिणाम और बढ़ाया दक्षता को दर्शाता है जो सेंडाइ वायरस, साथ transgene मुक्त मानव iPSCs में मानव दैहिक कोशिकाओं reprogram हमारे स्थापित विधि प्रस्तुत करते हैं.

Abstract

कुछ साल पहले, मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (iPSCs) की स्थापना biomedicine में एक नए युग की शुरुआत की. मानव iPSCs की क्षमता का उपयोग करता मानव आनुवंशिक रोगों की मॉडलिंग रोगजनन, जीन सुधार के बाद ऑटोलॉगस सेल थेरेपी, और रोगी विशेष और लक्षण प्रासंगिक कोशिकाओं का एक स्रोत प्रदान करके व्यक्तिगत दवा स्क्रीनिंग में शामिल हैं. हालांकि, इस तरह के मानव iPSCs उत्पादन के बाद शेष reprogramming कारक transgene अभिव्यक्ति को नष्ट करने के रूप में कई बाधाओं को पार कर रहे हैं. इससे भी महत्वपूर्ण बात, undifferentiated मानव iPSCs में अवशिष्ट transgene अभिव्यक्ति उचित differentiations में बाधा और रोग प्रासंगिक विट्रो phenotypes में की व्याख्या गुमराह कर सकता है. इस कारण के साथ एकीकरण से मुक्त और / या transgene मुक्त मानव iPSCs ऐसे adenovirus, piggyBac प्रणाली, minicircle वेक्टर, episomal वैक्टर, प्रत्यक्ष प्रोटीन वितरण के रूप में कई तरीकों का उपयोग कर विकसित और mRNA संश्लेषित किया गया है. हालांकि, reprogra की दक्षताएकीकरण से मुक्त तरीकों का उपयोग कर mming ज्यादातर मामलों में काफी कम है.

यहाँ, हम सेंडाइ वायरस (आरएनए वायरस) आधारित reprogramming प्रणाली का उपयोग करके मानव iPSCs अलग करने के लिए एक तरीका मौजूद है. इस reprogramming विधि अनुरूप परिणाम और लागत प्रभावी ढंग से उच्च दक्षता को दर्शाता है.

Introduction

मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (hESCs) दवा स्क्रीनिंग के लिए, रोग मॉडलिंग के लिए संभावित रूप से उपयोगी हो सकता है, और रोग और ऊतकों को चोट के इलाज के लिए सेल आधारित चिकित्सा के विकास के लिए जो स्वयं को नवीनीकृत विट्रो में और है pluripotency करने की क्षमता है. हालांकि, hESCs क्योंकि, प्रतिरक्षा आंकलोजिकल और नैतिक बाधाओं के सेल प्रतिस्थापन चिकित्सा के लिए एक सीमा है, और रोग से संबंधित जीन का अध्ययन करने के लिए, रोग विशेष hESCs पूर्व आरोपण आनुवंशिक निदान (PGD) दृष्टिकोण के माध्यम से अलग किया जा सकता है, लेकिन यह अभी भी तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है और भ्रूण दान बहुत दुर्लभ हैं. इन मुद्दों को प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (hiPSCs) के विकास के लिए नेतृत्व किया गया है, जो स्टेम कोशिका जीव विज्ञान में प्रगति से संबंधित हैं.

मानव iPSCs आनुवंशिक रूप से मानव वयस्क दैहिक कोशिकाओं से reprogrammed और उन्हें इस तरह के विकास के रूप में पुनर्योजी चिकित्सा के लिए एक उपयोगी स्रोत बनाता है जो hESCs के लिए इसी तरह pluripotent स्टेम सेल की तरह सुविधाओं, बंदरगाह रहे हैंगलीचा खोज, रोग मॉडलिंग और रोगी विशेष ढंग 1,2 में सेल थेरेपी.

अब तक, वायरस की मध्यस्थता (रेट्रोवायरस और adenovirus) सहित मानव iPSCs उत्पन्न करने के लिए कई तरीकों, 3, गैर वायरस की मध्यस्थता (बीएसी प्रणाली और वैक्टर अभिकर्मक) 4 जीन transductions, और प्रोटीन वितरण प्रणाली 5-7 कर रहे हैं.

वायरस की मध्यस्थता जीन की एक वितरण क्षमता का एक निश्चित स्तर को सुनिश्चित कर सकते हैं कि वे एक अनियंत्रित ढंग से reprogramming जीन व्यक्त करने के लिए मेजबान गुणसूत्रों में एकीकृत क्योंकि, वायरल वैक्टर, आनुवंशिक पदचिह्न छोड़ सकता है. प्रतिलेखन कारक के वायरल एकीकरण को सक्रिय या मेजबान जीन 8 निष्क्रिय हो सकता है, तब भी जब यह एक अप्रत्याशित आनुवंशिक विपथन और tumorigenesis 5,9 का खतरा पैदा कर सकता है. दूसरी ओर, दैहिक कोशिकाओं में प्रोटीन या शाही सेना का प्रत्यक्ष परिचय सूचना दी, लेकिन इस तरह के श्रम प्रधान, दोहराया transf के रूप में कुछ नुकसान गयाection, और 7,10 reprogramming के निम्न स्तर. यहां तक कि episomal और गैर समेकित करने adenovirus, एडिनो से जुड़े वायरस, और प्लाज्मिड वैक्टर अभी भी 11 अपेक्षाकृत कम कुशल हैं. इन कारणों के लिए, यह iPSC पीढ़ी के उच्च क्षमता और कम आनुवंशिक असामान्यताएं के साथ गैर एकीकरण reprogramming तरीकों चुनने के लिए प्रशंसनीय है. इस अध्ययन में, हम एक सेंडाइ वायरस आधारित reprogramming का उपयोग करें. इस विधि मेजबान जीनोम में गैर एकीकृत और लगातार transgene एकीकरण के बिना मानव iPSCs का उत्पादन हो जाता है.

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Protocol

1. सेल की तैयारी और मीडिया (दिवस 1)

  1. संस्कृति और DMEM मीडिया 10% FBS युक्त के साथ मानव fibroblast विस्तार.
  2. प्लेट मानव fibroblasts पारगमन पहले दिन पर अच्छी तरह से प्रति उचित घनत्व में 24 अच्छी तरह से थाली पर (चित्रा 1).
    नोट: विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं अलग कुर्की की क्षमता है क्योंकि निम्न धारावाहिक dilutions (200K, 100K, 50K, 25K, 12.5K और 6.25K) की सिफारिश की है.
  3. कोशिकाओं को पूरी तरह पालन किया और बढ़ाया है, यह सुनिश्चित करने के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में एक और दिन के लिए कोशिकाओं को सेते हैं.

2. पारगमन प्रदर्शन करना (2 दिन)

  1. पारगमन के दिन, सेल घनत्व की जांच और सबसे कुशल घनत्व कुओं (चित्रा 2) चुना. उच्च (80 ~ 90%), मध्यम (50 ~ 70%) और कम (20 ~ 40%): यह तीन अलग घनत्व लेने के लिए बेहतर है.
  2. कम से कम 1 घंटा पारगमन से पहले, fibrobl महाप्राणAST कोशिकाओं से मीडिया और fibroblast माध्यम की नई 300 μl बदल जाते हैं.
  3. -80 डिग्री सेल्सियस भंडारण से 4 अलग सेंडाइ वायरस ट्यूबों का एक सेट को हटा दें. कुछ सेकंड के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में एक ही समय में प्रत्येक ट्यूब पिघलना, और फिर पानी के स्नान से बाहर ट्यूब ले. उसके बाद, कमरे के तापमान पर उन्हें पिघलना; अपकेंद्रित्र 10 सेकंड के लिए 6000 XG पर ट्यूब और उपयोग तक बर्फ पर उन्हें जगह है. फ्रीज कर रहे हैं और titers बनाए रखने नहीं होगा क्योंकि वायरस पिघलना मत करो.
  4. सूक्ष्म अपकेंद्रित्र ट्यूब चार सेंडाइ वायरस ट्यूब (Oct-4, KLF-4, सी Myc और सॉक्स -2) में से प्रत्येक के संकेत मात्रा में जोड़ें. समाधान धीरे pipetting द्वारा अच्छी तरह से मिश्रित है कि सुनिश्चित करें.
    उदाहरण के लिए, अगर पारगमन के लिए 24 अच्छी तरह से थाली lookwell की कोशिकाओं 50K / एक अच्छी तरह से:
    (जीवन टेक्नोलॉजीज से विश्लेषण के प्रमाण पत्र के आधार पर टिटर, बैच से बैच के लिए अलग अलग हो सकते हैं)
    ट्यूब hOct-4 = 6.0 x 10 7 CIU, 3 MOI 5 μl =
    ट्यूब hSox-2 = 6.5 x 10 7 CIU, 3 MOI = 4.6 μ, एल
    ट्यूब hKlf-4 = 6.3 x 10 7 CIU, 3 MOI = 4.8 μl
    ट्यूब HC-Myc = 7.8 x 10 7 CIU, 3 MOI = 3.8 μl
    कुल = 24 अच्छी तरह से थाली के चार वायरस कारकों मिश्रण / एक अच्छी तरह से (50 कोशिकाओं) का 18.2 μl
  5. सेल घनत्व पर निर्भर करता है; 2X, 1X, और कुएँ में वायरस मिश्रण की 0.5X मात्रा में जोड़ें. धीरे, थाली सामने वापस करने के लिए हिला बाएँ और दाएँ (2X: वायरस मिश्रण, 1X का 36.4 μl: 18.2 μl और 0.5X: 9.1 μl).
  6. एक 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में कोशिकाओं प्लेस और रातोंरात सेते हैं.

3. संस्कृति के माध्यम से रिप्लेसमेंट (3 दिन और दिन 5)

  1. 24 घंटा पारगमन के बाद, 500 μl ताजा fibroblast मध्यम से मध्यम जगह.
  2. 5 दिन में, ताजा fibroblast मीडिया के साथ मध्यम बदलें.

4. सह संस्कृति के लिए MEF व्यंजन तैयार दिवस (8)

  1. 10% के साथ 60 मिमी संस्कृति बर्तन में MEF कोशिकाओं को तैयार FBS DMEM मध्यम एक दा निहितMEF फीडर कोशिकाओं पर transduced fibroblast passaging पहले वाई.
    नोट: हम प्रत्येक 60 मिमी पकवान में MEF के 5 एक्स 10 5 का उपयोग कर रहे हैं.

5. प्रारंभ सह संस्कृति MEF फीडर कोशिकाओं (दिन 9) के साथ कोशिकाओं transduced

  1. Transduced कोशिकाओं चढ़ाना पहले, महाप्राण 10% FBS MEF फीडर बर्तन से DMEM मीडिया रखी जाती है और FBS DMEM मध्यम निहित ताजा 10% जोड़ें.
  2. 24 अच्छी तरह से थाली में हैं और डी पीबीएस के साथ कोशिकाओं को एक बार धोने कि transduced fibroblasts से मध्यम निकालें. 24 अच्छी तरह से थाली inthe fibroblast कोशिकाओं में 0.25% trypsin / EDTA के 200 μl जोड़ें. कोशिकाओं थाली से अलग करने के लिए शुरू जब trypsin / EDTA के साथ कम से कम 5 मिनट ऊष्मायन के बाद, 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में मध्यम विकास के साथ कोशिकाओं को इकट्ठा. तब 4 मिनट के लिए 6000 XG में उन्हें अपकेंद्रित्र.
    नोट: 2X, 1X, और 0.5X वायरस पूलिंग transduced fibroblast की सिफारिश की है.
  3. सतह पर तैरनेवाला मध्यम निकालें और फिर से निलंबित करने के लिए धोनेtrypsin से निराकरण के लिए ताजा fibroblast माध्यम की 4-5 मिलीलीटर के साथ सेल गोली. तब 4 मिनट के लिए 135 XG पर उन्हें अपकेंद्रित्र.
  4. जैसे 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64, और 1/128 से 60 प्रति: धारावाहिक कमजोर पड़ने घनत्व के रूप में और MEF पर fibroblast मीडिया के साथ सह संस्कृति को शुरू प्लेट कोशिकाओं मिमी पकवान. पारगमन के पहले सप्ताह के दौरान कोशिका मृत्यु दर पर निर्भर करता है, एक 1/2 या 1/128 घनत्व को कमजोर करने की आवश्यकता नहीं हो सकता है. ट्रांसजीन RT-पीसीआर के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में कुल शाही सेना को निकालने के लिए एक तरफ शेष कोशिकाओं डाला.
  5. 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर रातोंरात, 37 डिग्री सेल्सियस में 60 मिमी व्यंजन रखें.

6. मानव भ्रूण स्टेम सेल मध्यम फ़ीड और कोशिकाओं (10 दिन) की निगरानी

  1. अगले दिन, 10 माइक्रोन वाई 27,632 के साथ मानव ES मीडिया को fibroblast मीडिया बदल जाते हैं. उसके बाद, मानव ते माध्यम के साथ दैनिक मध्यम बदलने के लिए: 800 मिलीलीटर DMEM/F12 + 200 मिलीलीटर नॉकआउट सीरम रिप्लेसमेंट + की 10 मिलीलीटर एल Glutamine 10 + 10 मिमी सदस्य न्यूनतम गैर आवश्यक अमीनो एसिड के मिलीलीटरबुनियादी fibroblast वृद्धि कारक के 2-mercaptoethanol + 10 एनजी / एमएल के 1 मिलीलीटर.
  2. ताजा मानव ES मीडिया के साथ एक दैनिक मीडिया बदल सकता हूँ. एक सप्ताह के बाद, ते कॉलोनी की तरह सेल clumps के गठन के लिए एक खुर्दबीन के नीचे एक बार प्रति 2 ~ 3 दिनों के बर्तन की जाँच करें. कालोनियों पाया जाता है से पहले सेल के प्रकार पर निर्भर करता है, संस्कृति और अधिक या कम समय लगेगा.

7. प्रेरित pluripotent सेल कालोनियों स्टेम और कोशिकाओं का विस्तार उठा दिवस (20 ~)

  1. तीन सप्ताह के पारगमन के बाद, कालोनियों चुनने के लिए ठीक से उगाया दिखाई देनी चाहिए.
  2. कालोनियों चुनने से पहले दिन, 24 अच्छी तरह से थाली में MEF फीडर तैयार करते हैं.
    नोट: हम एक 24 अच्छी तरह से थाली में MEF का 12.5 x 10 5 का उपयोग कर रहे हैं.
  3. अगले दिन, 10 माइक्रोन वाई 27,632 के साथ मानव ES मीडिया को fibroblast मीडिया से MEF व्यंजन का माध्यम बदल जाते हैं. मैन्युअल उठा हुड में खुर्दबीन के नीचे एक समय में एक कॉलोनी उठाओ और pipetting द्वारा छोटे clumps बनाने और उन्हें स्थानांतरणहाल में कई क्लोन लेने के लिए MEF dishes.Try तैयार पर.
  4. यात्रा और शुरू में एक 6 अच्छी तरह से थाली करने के लिए एक 24 अच्छी तरह से थाली से प्रत्येक अच्छी तरह का विस्तार. फिर 6 अच्छी तरह से थाली से आगे प्रचार से पहले एक 60 मिमी व्यंजन के लिए.

(10 मार्ग के बाद) मानव iPSCs के 8. विशेषता

  1. Immunofluorescence
    1. दैनिक मीडिया परिवर्तन के साथ 4-5 दिनों के दौरान 24 अच्छी तरह से थाली और संस्कृति में प्लेट मानव iPSCs.
    2. Immunofluorescence परख शुरू करने के लिए, एक बार डी पीबीएस के साथ थाली धोने. फिर 30 मिनट के लिए 0.4% paraformaldehyde में तुरंत कोशिकाओं को ठीक. उसके बाद 5 मिनट के लिए डी पीबीएस में तीन बार धोएं.
    3. कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए पीबीएस में 0.1% ट्राइटन X-100 के समाधान के साथ तय की कोशिकाओं का इलाज.
    4. Permeablization समाधान (0.1% ट्राइटन X-100 समाधान) Aspirate, तो कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए 0.5% बीएसए अवरुद्ध समाधान जोड़ने.
    5. Nanog, Oct-4, SSEA (मंच विशिष्ट भ्रूण antig का पता लगाने के प्रदर्शन करनाएन) और टीआरए-1-81 0.5% BSA समाधान में एक विरोधी मानव एंटीबॉडी का उपयोग (ट्यूमर अस्वीकृति प्रतिजन) (एंटीबॉडी कमजोर पड़ने दर के लिए सामग्री तालिका जाँच). कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी सेते हैं. फिर 5 मिनट प्रत्येक के लिए डी पीबीएस में तीन बार धोएं.
    6. कमरे के तापमान पर 0.5% BSA समाधान में 1:2,000 पतला कर रहे हैं जो 2 एन डी एंटीबॉडी, के रूप में एलेक्सा Fluor 488 बकरी विरोधी माउस आईजीजी साथ ऊष्मायन के 1 घंटे के बाद प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग की जाँच करें. DAPI के साथ प्रत्येक MEF फीडर कोशिकाओं और hiPSCs के सभी नाभिक दाग.
  2. ट्रांसजीन पुष्टि की RT-पीसीआर
    1. शाही सेना निकासी अभिकर्मकों का उपयोग करके सेल गोली से कुल mRNA निकालें.
    2. रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस द्वारा पीसीआर प्रवर्धन के लिए कुल शाही सेना और उसके एवज में सीडीएनए की aliquots पर एक रिवर्स प्रतिलेखन (1 ग्राम) करो.
    3. सीडीएनए टेम्पलेट के 2 μl, 2X पीसीआर मास्टर मिश्रण के 10 μl, प्राइमरों के 2 pmol के 2 μl को रोकने के लिए पीसीआर मिश्रण तैयार करें(आगे: 1 μl और रिवर्स: 1 μl) और DW के 6 μl. तालिका 1 में सूचीबद्ध प्राइमरों के साथ आरटी पीसीआर करना, जीन अभिव्यक्ति का पता लगाने.
    4. प्रवर्धन प्रतिक्रियाओं की दक्षता के लिए एक नियंत्रण के रूप में GAPDH जीन के साथ RT-PCRs प्रदर्शन करना. कल्पना और 1% agarose जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा पीसीआर उत्पाद का विश्लेषण.

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Representative Results

आमतौर पर संक्रमित fibroblasts सेंडाइ वायरस पारगमन के बाद कई दिनों में किसी भी morphological परिवर्तन नहीं दिखा है, लेकिन पांच दिन बाद वे अलग अलग आकार (चित्रा 1) के लिए शुरू करते हैं. संख्या 1 के एक सही पैनल में वर्णित है, कोशिकाओं किसी भी अधिक विशिष्ट fibroblast आकारिकी नहीं है. वे कोशिका द्रव्य से एक गोल आकार और बड़ा नाभिक है. पारगमन 80% सेलुलर confluency में किया जाता है यहां तक ​​कि जब वे reprogram करने के लिए शुरू के बाद वे अच्छी तरह से में कम मिला हुआ हैं ऐसा लगता है. Morphological परिवर्तन के इन प्रकार अच्छी तरह से अधिकांश में देखा जाना चाहिए शुरू, transduced fibroblasts MEF फीडर संस्कृति व्यंजन पर चढ़ाया होने के लिए तैयार हैं.

हमारे प्रोटोकॉल में, हम सेल संस्कृति पैमाने को कम से कम और भी hiPSCs पीढ़ी दक्षता में वृद्धि होगी जो इस तरह के अलग fibroblast सेल घनत्व और वायरस टिटर को रोजगार के रूप में विभिन्न reprogramming संभावनाओं, और बाद में कई पुनः चढ़ाना अनुपात MEF, (दिया

MEF भक्षण पर reprogramming की शुरुआत में, यह transduced सेल प्रकार के भेद करना मुश्किल है, लेकिन सह संस्कृति से एक से अधिक सप्ताह के बाद, आंशिक रूप से reprogrammed fibroblasts दिखाई देते हैं और ढीला ते की तरह आकार (चित्रा 3) की तरह लग रहे. क्योंकि मानव iPSC कालोनियों नई MEF फीडर डिश में passaging के लिए तैयार कर रहे हैं जब इस कारण से, मैनुअल उठा एंजाइम के साथ हस्तांतरण के बजाय हदबंदी के लिए ज्यादा कारगर तरीका है.

चित्रा 3 और 4 चित्र में, खुर्दबीन के नीचे ही मानव iPSCs ('पूरी तरह से reprogrammed कोशिकाओं' के रूप में माना जाता है) मानव iPSCs और आकारिकी द्वारा 'अधूरे reprogrammed कोशिकाओं' के बीच एक स्पष्ट अंतर बनाने के लिए जो स्पष्ट किनारों है. पूरी तरह से reprogrammed कोशिकाओं लोठीक कॉम्पैक्ट और कसकर बांध की तरह. आंशिक रूप से reprogrammed कोशिकाओं कॉलोनी बनाने के लिए एक साथ एकत्र की तरह लग रही है लेकिन बहुत कम है और नीचे तोड़ने के लिए नाजुक जबकि विशेष रूप से कालोनियों, स्पष्ट सीमा है. हम धीरे एक pipetting यहां तक ​​कि अगर यह आसानी से अलग है. यहां तक ​​कि (उन्हें और passaging के विस्तार के दौरान) को आंशिक रूप से reprogrammed मानव iPSCs कालोनियों को छोड़कर बाद, पूरी तरह से reprogrammed मानव iPSCs पुस्तिका उठा द्वारा बनाए रखा जाना चाहिए.

कालोनियों उठा और कई हफ्तों में hiPSC क्लोन के विस्तार के बाद, stemness मार्करों की अभिव्यक्ति निर्धारित किया जाना चाहिए. HiPSC क्लोन के विस्तार के बाद, हम एक गुणवत्ता नियंत्रण के रूप में (नहीं दिखाया डेटा है) एंटीबॉडी धुंधला (SSEA4 अक्टूबर -4, टीआरए-81 और Nanog) और pluripotent मार्कर की RT-पीसीआर सहित परीक्षण के विभिन्न सेट के साथ उन्हें सत्यापित.

H9 की तुलना में, दो अलग hiPSCs SSEA4 अक्टूबर -4, टीआरए-81, और Nanog के लिए सकारात्मक हैं. इस परिणाम पृथक मानव iPSCs pluripotent गुणवत्ता (अधिग्रहीत यह दर्शाता है कि

अंत में, चित्रा 6 हम RT-पीसीआर द्वारा hiPSC क्लोन में किसी भी transgene अभिव्यक्ति का पता नहीं लगा सकते हैं कि पता चलता है. के लिए कम से कम 10 से अधिक मार्ग hiPSCs, विशिष्ट प्राइमरों (तालिका 1) एक्सोजेनस Oct-4, सॉक्स -2, KLF-4 और सी Myc मजबूत transgene अभिव्यक्ति के स्तर के साथ सकारात्मक नियंत्रण के नमूनों के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है.

चित्रा 1
चित्रा 1. Morphological परिवर्तन सेंडाइ वायरस पारगमन के बाद. पारगमन इससे पहले, fibroblasts ठेठ धुरी की तरह आकार (बाएं) दिखा. लगभग आठ दिनों पारगमन के बाद, बहुत अधिक गोल आकार (दाएं) की तरह transduced सेल परिवर्तन की आकारिकी. घंटे क्लिक करेंइस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए अरे.

चित्रा 2
अधिकतम क्षमता सुनिश्चित करने के लिए प्रेरण योजना के 2. आरेख चित्र. चार से अधिक विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं (1-4) 24 अच्छी तरह से थाली में चढ़ाया जा सकता है. उनके लगाव की क्षमता और सेल अस्तित्व सेल प्रकार पर निर्भर अलग हो सकता है, यह अच्छी तरह से (प्रति 200K 6.25K को कोशिकाओं से) अलग सेल घनत्व थाली करने के लिए सुझाव दिया है. इसके अलावा, वायरस एकाग्रता (0.5X, 1x और 2x) समायोजित किया जा सकता है.

चित्रा 3
Transduced च से मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल कॉलोनी की चित्रा 3. गठनibroblast. MEFs में उन्हें फिर से चढ़ाना के बाद के बारे में दो सप्ताह में, दौर कालोनियों प्रकट करना चाहिए और मानव भ्रूण स्टेम सेल कालोनियों की तरह लग रहे. आम तौर पर पूरी तरह से reprogrammed मानव iPSC कालोनियों बहुत स्पष्ट सीमाओं है. (एरो: पूरी तरह से मानव iPSC कालोनियों, Arrowhead reprogrammed: आंशिक रूप से reprogrammed मानव iPSCs). बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 4
चित्रा 4. मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल कालोनियों उठा. मानव iPSC कालोनियों अक्सर आंशिक रूप से reprogrammed कोशिकाओं (बाएं) से घिरे हैं. खुर्दबीन के तहत, ते तरह कॉलोनी उठा ही, छोटे clumps में टूट और फिर स्थानांतरण (दाएं). 2 ~ 3 मार्ग के बाद, अविभाजित hiPSC कालोनियों (नीचे और बाएं) कर रहे हैं. (एरो: पूरी तरह से reprogrammed मानव iPSC कालोनियों, Arrowhead: आंशिक रूप से reprogrammed मानव iPSCs) बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 5
स्टेम सेल pluripotent मार्कर के साथ चित्रा 5. Immunofluorescence धुंधला. Immunofluorescence परख मानव iPSCs stemness features.SSEA-4, टीआरए-81, Nanog, Oct-4as pluripotent मार्करों और DAPI नाभिक धुंधला के लिए एक नियंत्रण है दिखाता है. (ए) H9 धुंधला का प्रतिनिधित्व करता है एक नियंत्रण नमूना. (बी) और (सी) मानव iPSC क्लोन दिखाने के रूप में.एट = "_blank"> बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 6
Transgene अभिव्यक्ति के स्तर का आंकड़ा 6. पुष्टि. कम से कम मानव iPSCs, एक्सोजेनस Sox2 का मुंह बंद, KLF-4, सी Myc, और Oct-4 जीन अभिव्यक्ति के स्तर की 10 बीतने संस्कृति के बाद रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस पोलीमरेज़ चेन प्रतिक्रियाओं से इसकी पुष्टि की है. hGAPDH एक आंतरिक नियंत्रण है. एक सकारात्मक नियंत्रण के लिए, शाही सेना बचे हुए transduced fibroblasts (सेंडाइ वायरस के संक्रमण के बाद 7 दिन) से निकाला जाता है. (लेन 1: मार्कर, गलियों 2-6: GAPDH, Klf4, सी Myc, Oct-4, और सकारात्मक नियंत्रण में सॉक्स -2, गलियों 7-11: GAPDH, Klf4, सी Myc, Oct-4, और सॉक्स -2 hiPSCs में).

<टीडी> अनुक्रम
प्राइमर नाम
hOCT4 (एफ) सीसीसी GAA आगा GAA AGC GAA सीसीए जी
hOCT4 (नि.) AAT जीटीए टीसीजी आग GTG सीटीसी ए.ए.
hMYC (एफ) TAA CTG अधिनियम AGC AGG सीटीटी जीटीसी जी
hMYC (नि.) टीसीसी एसीए टीएसी AGT सीसीटी GGA TGA TGA टीजी
hSOX2 (एफ) एसीए आगा GAA एएए एसीए TGT ATG जी
hSOX2 (नि.) ATG CGC TGG टीटीसी ACG सीसीसी GCG सीसीसी AGG
hKLF4 (एफ) एसीए आगा GAA एएए एसीए TGT ATG जी
hKLF4 (नि.) CGC GCT GGC AGG जीसीसी GCT GCT सीजीए सी
hGAPDH (एफ) AGG टीसीजी भूमिकाः टीसीए ACG जी ए टी टीटीजी
hGAPDH (नि.) GTG ATG जीसीए TGG अधिनियम GTG जी.टी.

Transgene पुष्टि के लिए तालिका 1. आरटी पीसीआर प्राइमरों. ये टीआरए के लिए उपयोग किया जाता है कि प्राइमर दृश्यों हैंnsgene पुष्टि. टी एम सभी प्राइमर सेट में 50.6 डिग्री सेल्सियस है.

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Discussion

HiPSCs के लिए मानव दैहिक कोशिकाओं reprogramming बुनियादी जीव विज्ञान, निजी चिकित्सा, और प्रत्यारोपण के 12 में अभूतपूर्व वादों रखती है. इससे पहले, मानव iPSC पीढ़ियों ऐसी दवा के विकास और प्रत्यारोपण चिकित्सा के रूप में 13 आगे नैदानिक ​​अनुप्रयोगों है कि सीमा अवांछनीय आनुवंशिक परिवर्तन बना सकते हैं, जो मेजबान जीनोम, एकीकरण में जोखिम है कि डीएनए वायरस की आवश्यकता है. इस कारण से, कई अध्ययनों से कई वैकल्पिक तरीकों से वेक्टर और transgene मुक्त प्रणाली मानव iPSCs उत्पन्न करने के लिए सूचित किया गया है, लेकिन एक ही समय में, 'मुक्त फुट प्रिंट' अलग करने की दक्षता मानव iPSCs विचार किया जाना चाहिए. अभी तक सेंडाइ वायरस की मध्यस्थता iPSC पीढ़ी के 'जीनोमिक सुरक्षा' प्रदर्शित करने के लिए पूरे जीनोम अनुक्रमण के लिए कोई प्रकाशन हालांकि वहाँ उदाहरण के लिए, आरएनए वायरस, अन्य तरीकों से 14 की तुलना आनुवंशिक विपथन का एक न्यूनतम स्तर होना चाहिए. यहाँ, हम साथ hiPSCs पैदा करने के लिए एक विधि प्रस्तुतलागत प्रभावी तरीके से एक उच्च reprogramming क्षमता है जो सेंडाइ वायरस. जिसके परिणामस्वरूप मानव iPSCs proliferative और विकास क्षमता में hESCs के लिए सेलुलर और आणविक समानता के रखरखाव के साथ transgene के लिए स्वतंत्र हैं.

हम सेंडाइ वायरस का केवल एक सेट के साथ एक ही समय में fibroblast की अलग मूल (> 4) reprogram कर सकते हैं. और हमारे विधि में, हम विभिन्न सेल संगम और वायरस खुराक मतभेद लागू होते हैं. इस 'मिश्रण और मैच' संयोजन तकनीक reprogramming प्रभावकारिता को अधिकतम कर सकते हैं. प्रत्येक कुएं में (एक भी मरीज से) fibroblasts एक अलग वायरस के संक्रमण का स्तर है, लेकिन एक साथ पूलिंग करके, hiPSCs कालोनियों बनाने की संभावना के हमारे अनुभव के आधार पर बढ़ाया जा सकता है. HiPSC लाइनों के बीच प्रतिरूप भिन्नता के अन्य मुद्दों प्रसार दर, सेल लगाव / अस्तित्व, एक्स गुणसूत्र निष्क्रियता 15 की स्थिति हैं, भेदभाव आदि, 16 क्षमता दरअसल, हम एक क्लोन एक अलग है कि मनायाएक मीर 371 क्लस्टर की अभिव्यक्ति के स्तर को मापने के द्वारा भविष्यवाणी की जा सकती है, जो तंत्रिका प्रवृत्ति, ईएनटी. इसके अलावा हम सेंडाइ वायरस reprogramming प्रक्रिया में कई अलग अलग प्रकार की कोशिकाओं के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि जो पता चलता है कि इस विधि के साथ मानव myoblasts से मानव iPSCs पैदा करने में सफल रहा है. इसके अलावा, हमारे विधि का उपयोग कर, हम 10 से अधिक विभिन्न रोग से संबंधित fibroblasts में hiPSCs उत्पन्न किया है. औसत पर, 5-10 hiPSC क्लोन एक fibroblast से प्राप्त किया जा सकता है.

सेंडाइ वायरस के साथ transgene मुक्त मानव आईपीएस कोशिकाओं की व्युत्पत्ति सबसे व्यावहारिक रास्तों हो सकता है जो सबसे कुशल reprogramming विधि है हालांकि, इस प्रोटोकॉल में माना जा करने के लिए कुछ सीमाएं हैं;
- (2.4 में वर्णित है) प्रत्येक सेंडाइ वायरस बैच के आधार पर, वायरस टिटर संगत MOI के लिए गणना की जरूरत है.
- हम भी robu के लिए अतिरिक्त अनुमापन की जरूरत है जो विभिन्न दैहिक कोशिकाओं के बीच संक्रामकता की भिन्नता, मनायासेंट वायरल संक्रमण.
- सेंडाइ वायरस मध्यस्थता reprogramming अनुसंधान प्रयोजनों के लिए सबसे अच्छा विकल्प में से एक के रूप में माना जा सकता है. मूल रूप से सेंडाइ वायरस प्रणाली विकसित की है कि कंपनी के साथ एक लाइसेंस मुद्दा है लेकिन जब से चिकित्सीय परीक्षण के लिए, यह पहली पसंद नहीं हो सकता है.
- Reprogrammed दैहिक कोशिकाओं transgenes से मुक्त कर रहे हैं जब तक यह है कि हम कम से कम 10 अंश के बाद transgene अभिव्यक्ति की जांच की जरूरत है, जिसके कारण लगभग दो महीने लग जाते हैं.
- हम एक प्रत्यक्ष तुलना नहीं है, हालांकि यह प्राथमिक सुसंस्कृत fibroblast के पारित होने संख्या सेंडाइ वायरस के साथ reprogramming की क्षमता को प्रभावित कर सकता है कि ऐसा लगता है. प्रसार की दर भी निर्धारित किया जाना चाहिए. आगे के अध्ययन के fibroblasts बीतने संख्या और reprogramming दक्षता पर उनके प्रसार के प्रभाव को निर्धारित करने की जरूरत है.
- इस अध्ययन में, हम hiPSC पीढ़ी और रखरखाव के लिए एक माउस फीडर परत का उपयोग, लेकिन एक फीडर मुक्त प्रणाली एक alternativ हो सकता हैएक भविष्य अध्ययन में ई रास्ता.

हमारे मौजूदा प्रोटोकॉल रोग मॉडलिंग, पुनर्योजी चिकित्सा, और अन्य अनुप्रयोगों के लिए रोगी विशेष hiPSCs का अध्ययन करने की ओर एक महत्वपूर्ण कदम है.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

हम पांडुलिपि पर बहुमूल्य विचार विमर्श के लिए ली प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद देना चाहूंगा. ली प्रयोगशाला में काम सेल रिसर्च फंड (TEDCO) स्टेम न्यूयॉर्क स्टेम सेल फाउंडेशन की रॉबर्टसन अन्वेषक पुरस्कार से और मेरीलैंड से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CytoTune-iPS Reprogramming Kit Invitrogen A1378002
CF-6,MEFs, neomycin-resistant, mitomycin C treated  Global stem GSC-6105M 5 x 105/6 cm or 12.5 x 105/24-well plate
Trypsin EDTA 0.25% Trypsin with EDTA 4Na 1X Invitrogen 25200114
DMEM/F-12 medium Invitrogen 11330-032
24-well Cell Culture Plate, flat-bottom with lid BD 353935
Y-27632 TOCRIS 1254 10 μM (Stock: 10 mM)
basic fibroblast growth factor LIFE TECHNOLOGIES PHG0263 10 ng (Stock : 100 ug)
Knock-out serum replacement Gibco 10828028
Dulbecco's Modified Eagle Medium (D-MEM, DMEM) (1X), liquid (high glucose) Invitrogen 11965118
Fetal bovine serum Thermo Scientific Fermentas SH30071.03
L-Glutamine-200 mM (100X), liquid GIBCO 25030-081 1/100
MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X LIFE TECHNOLOGIES 11140050 1/100
2-Mercaptoethanol (1,000X), liquid GIBCO 21985023 1/1,000
Hausser Phase Contrast Hemacytometers Hausser Scientific 02-671-54
EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution Millipore ES-006-B
SSEA-4 DSHB MC-813-70 1/200
anti-Tra-1-81 Cell Signaling 4745S 1/200
mouse monoclonal Oct4 antibody Santa Cruz SC-5279 1/1,000
Nanog R&D AF1997 1/1,000
Alexa Flouor 488 goat anti-mouse Invitrogen 948492 1/2,000
DPBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline), 1X without calcium & magnesium Cellgro 21-031-CV
QuantiTect Reverse Transcription Kit QIAGEN 205313
PCR Master Mix [2X] Thermo Scientific Fermentas K0171
Trizol Invitrogen 15596018
picking hood NuAire NU-301
dissecting scope  Nikon SMZ745

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References

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सेल बायोलॉजी अंक 86 प्रेरित pluripotent स्टेम सेल मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं सेंडाइ वायरस स्टेम
सेंडाइ वायरस के साथ मानव दैहिक कोशिकाओं से कुशल उत्पादन मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल
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Choi, I. Y., Lim, H., Lee, G. Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus. J. Vis. Exp. (86), e51406, doi:10.3791/51406 (2014).

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