Summary
Qui vi presentiamo il nostro metodo stabilito per riprogrammare cellule somatiche umane in libera-transgene iPSCs umane con virus di Sendai, che mostra esito coerente e una maggiore efficienza.
Abstract
Alcuni anni fa, la creazione di cellule staminali umane pluripotenti indotte (iPSCs) ha inaugurato una nuova era nel campo della biomedicina. Possibili usi di iPSCs umani comprendono la modellazione patogenesi delle malattie genetiche umane, la terapia cellulare autologa dopo la correzione genica e screening di farmaci personalizzati, fornendo una fonte di cellule rilevanti e sintomi specifici del paziente. Tuttavia, ci sono diversi ostacoli da superare, come eliminare l'espressione del transgene fattore riprogrammazione restante dopo la produzione iPSCs umani. Ancora più importante, l'espressione del transgene residuo in iPSCs umane indifferenziate potrebbe ostacolare differenziazioni corretta e fuorviare l'interpretazione della malattia in questione in fenotipi vitro. Con questo motivo, privo di integrazione e / o iPSCs umani privi di transgene sono state sviluppate utilizzando diversi metodi, quali adenovirus, il sistema piggyBac, minicircle vettore, vettori episomale, la consegna diretta delle proteine e sintetizzato mRNA. Tuttavia, l'efficienza di reprograllo utilizzando metodi libero-integrazione è piuttosto basso nella maggior parte dei casi.
Qui, vi presentiamo un metodo per isolare iPSCs umani utilizzando Sendai-virus (virus RNA) sistema di riprogrammazione based. Questo metodo di riprogrammazione mostra i risultati coerenti e di alta efficienza in modo economicamente efficiente.
Introduction
Le cellule umane staminali embrionali (hESC) hanno la capacità di auto-rinnovarsi in vitro e hanno pluripotenza, che potrebbe essere potenzialmente utile per la modellazione della malattia, per lo screening di stupefacenti, e di sviluppare le terapie a base di cellule per il trattamento di malattie e lesioni dei tessuti. Tuttavia, hESCs hanno una limitazione per la terapia di sostituzione cellulare a causa delle barriere immunologiche, oncologiche ed etiche, e di studiare i geni correlati alla malattia, hESCs malattie specifiche possono essere isolati attraverso pre-impianto diagnosi genetica preimpianto (PGD) si avvicina, ma è ancora tecnicamente impegnativo e le donazioni di embrioni sono piuttosto rari. Questi problemi sono legati al progresso della biologia delle cellule staminali, che ha portato allo sviluppo di cellule staminali pluripotenti indotte (hiPSCs).
IPSCs umani sono geneticamente riprogrammate da cellule somatiche adulte umane e porto le caratteristiche di cellule simil-staminali pluripotenti simili a hESCs, che li rende una fonte utile per la medicina rigenerativa, come dscoperta tappeto, modelli di malattia e la terapia cellulare in paziente-specifici 1,2 maniera.
Fino ad ora, ci sono diversi metodi per generare iPSCs umani, inclusi virus-mediata (retrovirus e adenovirus) 3, non virus mediata (sistema BAC e vettori di transfezione) 4 trasduzioni gene, e di sistema di consegna di proteine 5-7.
Sebbene una consegna di geni del virus-mediata può garantire un certo livello di efficienza, vettori virali potevano lasciare impronta genetica, perché integrano nei cromosomi ospite per esprimere geni riprogrammazione in modo incontrollato. Anche quando integrazione virale di fattori di trascrizione può attivare o inattivare geni ospite 8, può causare un'aberrazione genetica inattesa e il rischio di tumorigenesi 5,9. D'altra parte, l'introduzione diretta di proteine o RNA in cellule somatiche sono stati segnalati, ma hanno alcuni svantaggi, come intensità di lavoro, trasf ripetutaezione, e basso livello di riprogrammazione 7,10. Anche episomale e non integranti adenovirus, virus adeno-associati, e vettori plasmidici sono ancora relativamente meno efficienti 11. Per queste ragioni, è plausibile scegliere non-integrazione metodi di riprogrammazione con elevata efficacia della generazione iPSC e un minor numero di anomalie genetiche. In questo studio, usiamo una riprogrammazione basata Sendai-virus. Questo metodo è noto per essere non integrata nel genoma dell'ospite e produce costantemente iPSCs umani senza integrazioni transgene.
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Protocol
1. Preparazione di cellule e dei media (1 ° giorno)
- Cultura ed espandere fibroblasti umani con i media DMEM contenente 10% FBS.
- Piastre fibroblasti umani (Figura 1) su una piastra da 24 pozzetti alla densità appropriata per pozzetto il giorno prima trasduzione.
NOTA: Le seguenti diluizioni seriali sono raccomandati (200K, 100K, 50K, 25K, 12.5K e 6.25K), perché diversi tipi di cellule hanno diverse capacità di attacco. - Incubare le cellule per un giorno a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore, assicurando le cellule hanno pienamente aderito ed esteso.
2. Eseguire trasduzione (Day 2)
- Il giorno di trasduzione, controllare la densità cellulare e scelto pozzetti densità più efficienti (Figura 2). E 'meglio scegliere tre diverse densità: alta (80 ~ 90%), medio (50 ~ 70%) e bassa (20 ~ 40%).
- Almeno 1 ora prima di trasduzione, aspirare il fibroblsupporti AST dalle cellule e modificare nuovi 300 ml di mezzo fibroblasti.
- Rimuovere un set di 4 diversi tubi di virus Sendai dal -80 ° C di stoccaggio. Scongelare ogni provetta allo stesso tempo in un bagno d'acqua a 37 ° per alcuni secondi, e poi le valvole fuori dal bagno di acqua. Dopo di che, scongelare a temperatura ambiente; provette da centrifuga a 6000 xg per 10 sec e disporli sul ghiaccio fino all'uso. Non ricongelare e scongelare il virus dal momento che i titoli non manterrà.
- Aggiungere i volumi di ciascuna delle quattro tubi virus Sendai (OCT-4, Klf-4, c-Myc e Sox-2) indicati al tubo micro-centrifuga. Assicurarsi che la soluzione viene mescolata ben pipettando delicatamente.
Ad esempio, se 50K cellule / pozzetto di una 24-pozzetti lookwell per trasduzione:
(Titer sulla base del certificato di analisi di Life Technologies, può essere diverso da lotto a lotto)
Tubo hOct-4 = 6,0 x 10 7 CIU, 3 MOI = 5 ml
Tubo hSox-2 = 6,5 x 10 7 CIU, 3 MOI = 4.6 μ; L
Tubo hKlf-4 = 6,3 x 10 7 CIU, 3 MOI = 4.8 ml
Tubo hc-Myc = 7.8 x 10 7 CIU, 3 MOI = 3,8 microlitri
Totale = 18.2 ml di quattro fattori virali miscela / uno così (50K celle) della piastra da 24 pozzetti - A seconda densità cellulari; aggiungere 2X, 1X, 0.5X e volume della miscela virus nel pozzo. Agitare delicatamente la piastra anteriore alla parte posteriore, a sinistra ea destra (2X: 36.4 ml di miscela di virus, 1X: 18,2 microlitri e 0.5X: 9.1 ml).
- Mettere le cellule a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore e incubare una notte.
3. Sostituzione della Cultura Media (Day 3 & Day 5)
- 24 ore dopo la trasduzione, sostituire il mezzo con 500 microlitri media fibroblasti fresco.
- Il giorno 5, cambiare il Piano con i media fibroblasti fresca.
4. Preparare piatti MEF per il Co-cultura (Giorno 8)
- Preparare cellule MEF in 60 millimetri capsule di Petri con il 10% FBS conteneva DMEM uno day prima passaging fibroblasti trasdotte sul feeder cellule MEF.
Nota: Stiamo usando 5 x 10 5 del MEF in ogni piatto 60 millimetri.
5. Avvio co-coltura con cellule trasdotte Feeder MEF (Giorno 9)
- Prima di placcatura cellule trasdotte, aspirare il 10% FBS conteneva DMEM supporto dai piatti alimentatore MEF e aggiungere fresco del 10% FBS conteneva DMEM.
- Rimuovere il terreno dai fibroblasti trasdotti che sono 24 pozzetti e lavare le cellule una volta con D-PBS. Aggiungere 200 ml di 0,25% tripsina / EDTA nelle cellule di fibroblasti inthe 24-pozzetti. Dopo meno di 5 minuti di incubazione con tripsina / EDTA, quando le cellule iniziano a staccarsi dalla piastra, raccogliere le cellule con mezzo di coltura in tubo da 15 ml. Poi si centrifuga a 6000 g per 4 min.
NOTA: Pooling 2X, 1X, e il virus 0.5X è raccomandato fibroblasti trasdotte. - Rimuovere il mezzo surnatante e lavare per risospendereil pellet cellulare con 4-5 ml di terreno fresco fibroblasti di neutralizzazione da tripsina. Poi centrifugare a 135 g per 4 min.
- Cellule Piastra come densità diluizione seriale e iniziare a co-coltura di fibroblasti con i media sul MEF: come 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64 e 1/128 a 60 mm piatto. A seconda del tasso di morte delle cellule durante la prima settimana di trasduzione, non si può avere bisogno di diluire a 1/2 o 1/128 densità. Mettere da parte cellule rimanenti per estrarre l'RNA totale come controllo positivo per Transgene RT-PCR.
- Porre 60 millimetri piatti 37 ° C, 5% CO 2 incubatore durante la notte.
6. Feed Cellule Staminali embrionali umane a medio e Controllo delle Cellule (Giornata 10)
- Il giorno dopo, cambiare i media fibroblasti ai media ES umana con 10 pM Y-27632. Dopo di che, cambiare medio giornaliero con terreno ES umana: 800 ml DMEM/F12 + 200 ml Knockout siero sostituzione + 10 ml di L-Glutammina + 10 ml di 10 mM MEM aminoacidi non essenziali minimi+ 1 ml di 2-mercaptoetanolo + 10 ng / ml di fattore base di crescita dei fibroblasti.
- Fare un cambiamento dei media ogni giorno con mezzi freschi umane ES. Dopo una settimana, controllare i piatti una volta ogni 2 ~ 3 giorni sotto un microscopio per la formazione di grumi di cellule ES colonia-like. A seconda del tipo di cellula, la cultura vorrà più o meno tempo prima colonie si trovano.
7. Picking staminali pluripotenti indotte colonie di cellule ed espandere la Cells (giorno 20 ~)
- Tre settimane dopo la trasduzione, le colonie dovrebbero apparire cresciuto correttamente per la raccolta.
- Il giorno prima di prendere le colonie, preparare alimentatore MEF a 24 pozzetti.
NOTA: Stiamo usando 12,5 x 10 5 del MEF in una piastra da 24 pozzetti. - Il giorno dopo, cambiare mezzo di piatti MEF dai media fibroblasti a supporto ES umana con 10 pM Y-27632. Scegliere manualmente una colonia in ogni tempo sotto il microscopio alla raccolta-cappuccio e macchie più piccole pipettando e trasferirlisulla nuova preparati MEF dishes.Try di scegliere diversi cloni.
- Passaggio ed espandere l'ciascun pozzetto di una piastra da 24 pozzetti di una piastra inizialmente 6 bene. Poi da un 6-pozzetti a 60 mm piatti prima di ulteriore moltiplicazione.
8. Caratterizzazione di iPSCs umano (dopo 10 passaggi)
- Immunofluorescenza
- Piatto iPSCs umani in lamiera e della cultura 24 pozzetti durante 4-5 giorni con cambio giornaliero dei media.
- Per avviare test immunofluorescenza, lavare la piastra con D-PBS volta. Poi fissare le cellule immediatamente nello 0,4% paraformaldeide per 30 min. Dopo che lavare tre volte in D-PBS per 5 min.
- Trattare cellule fissate con 0.1% Triton X-100 in PBS soluzione per 15 minuti a temperatura ambiente.
- Aspirare la soluzione permeablization (0,1% triton X-100 soluzione), poi aggiungere BSA soluzione bloccante 0,5% per 1 ora a temperatura ambiente.
- Eseguire una rilevazione di Nanog, Oct-4, SSE (antig embrionale stadio-specificait) e TRA-1-81 (tumore rifiuto antigene) utilizzando un anticorpo anti-umano in soluzione BSA allo 0,5% (controllare la tabella materiale per tasso di diluizione di anticorpi). Incubare anticorpo primario per 2 ore a temperatura ambiente. Quindi lavare tre volte in D-PBS per 5 minuti ciascuno.
- Verificare usando la microscopia a fluorescenza dopo 1 ora di incubazione con Alexa Fluor 488 di capra anti-topo IgG come 2 ° anticorpi, che vengono diluiti in soluzione 1:2.000 BSA 0,5% a temperatura ambiente. Colorare tutti i nuclei di ogni MEF cellule feeder e hiPSCs con DAPI.
- RT-PCR di Transgene Conferma
- Estrarre mRNA totale di pellet cella utilizzando reagenti di estrazione di RNA.
- Fare una trascrizione inversa su aliquote (1 mg) di RNA totale e il cDNA risultante per l'amplificazione PCR da trascrittasi inversa.
- Preparare le miscele PCR per contenere 2 ml di cDNA, 10 ml di 2X PCR master mix, 2 ml di 2 pmol di primer(Avanti: 1 ml e reverse: 1 ml) e 6 ml di DW. Per rilevare l'espressione genica, apportare la RT-PCR con i primer elencati nella Tabella 1.
- Eseguire la RT-PCR con gene GAPDH come controllo per l'efficienza delle reazioni di amplificazione. Visualizzare e analizzare prodotto di PCR dell'1% elettroforesi su agarosio-gel.
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Representative Results
Fibroblasti solito infette non mostrano cambiamenti morfologici in diversi giorni dopo la trasduzione del virus Sendai, ma cinque giorni dopo, cominciano ad avere forme diverse (Figura 1). Come descritto in un pannello di destra della figura 1, le cellule non hanno tipica morfologia fibroblasto più. Hanno una forma rotonda e più grande nucleo di citoplasma. Anche quando trasduzione viene eseguita nel 80% di confluenza cellulare, sembra che siano meno confluenti nel pozzo dopo cominciano a riprogrammare. Se questo tipo di cambiamenti morfologici cominciano ad essere visto nella maggior parte del bene, fibroblasti trasdotti sono pronti per essere placcato su MEF-feeder coltura piatti.
Nel nostro protocollo, abbiamo ridotto al minimo cellule scala la cultura e anche dato varie possibilità di riprogrammazione, ad esempio impiegando differenti densità delle cellule dei fibroblasti e titolo del virus, e la successiva vari rapporto di ri-placcatura MEF, che consentirà di aumentare l'efficienza hiPSCs generazione ( All'inizio della riprogrammazione su linee MEF, è difficile distinguere i tipi di cellule trasdotte, ma dopo più di una settimana dalla co-coltura, fibroblasti parzialmente riprogrammate apparire e apparire come allentato forma ES-like (Figura 3). A causa di questo motivo quando le colonie IPSC umani sono pronti per il passaging nel nuovo piatto alimentatore MEF, raccolta manuale è il modo più efficiente per il trasferimento invece di dissociazione con l'enzima. Nella Figura 3 e Figura 4, sotto il microscopio solo iPSCs umani hanno bordi trasparenti, che rendono una chiara distinzione tra iPSCs umani (considerati come «cellule completamente riprogrammate ') e' cellule non completamente riprogrammate 'per morfologia. Completamente cellule riprogrammate look come compatto e fitto. Soprattutto le colonie hanno chiaro confine, mentre le cellule riprogrammate in parte sembrano raccogliere insieme per rendere colonia, ma molto perdono e fragile per abbattere. Anche se facciamo un pipettaggio delicatamente è facilmente staccato. Anche dopo aver escluso parzialmente riprogrammate iPSCs umani colonie (durante la loro e passaging espansione), iPSCs umani completamente riprogrammati devono essere mantenuti con raccolta manuale. Dopo aver raccolto le colonie e in espansione cloni hiPSC in diverse settimane, espressione di marcatori di staminalità deve essere determinato. Dopo l'espansione di cloni hiPSC, noi li verifichiamo con diverse serie di test, tra cui la colorazione anticorpale (SSEA4, Oct-4, TRA-81 e Nanog) e RT-PCR di marcatore pluripotenti (dati non viene mostrata) come controllo di qualità. Rispetto a H9, due hiPSCs differenti sono positive per SSEA4, Oct-4, TRA-81, e Nanog. Questo risultato dimostra che isolati iPSCs umane acquisite qualità pluripotenti ( Infine, la Figura 6 mostra che non si può rilevare alcuna espressione del transgene in cloni hiPSC mediante RT-PCR. Almeno oltre 10 passaggi hiPSCs, primers specifici (Tabella 1) per esogeno Oct-4, Sox-2, Klf-4 e c-Myc possono essere utilizzati con campioni di controllo positivi con forte livello di espressione del transgene. Tabella 1. Primer RT-PCR per conferma transgene. Queste sono le sequenze dei primer utilizzati per tradiconferma nsgene. T m è 50,6 ° C in tutte le serie di primer. 
Figura 1. Cambiamento morfologico dopo trasduzione del virus Sendai. Prima della trasduzione, fibroblasti mostrano la forma del mandrino come tipico (a sinistra). Circa otto giorni dopo la trasduzione, la morfologia del cambiamento delle cellule trasdotte come forma più rotonda (a destra). cliccate here per visualizzare una versione più grande di questa figura. 
Figura 2. Schema di piano induzione per garantire la massima efficienza. Oltre quattro diversi tipi di cellule possono essere seminate in una piastra da 24 pozzetti (da 1 a 4). Poiché la capacità di attacco e la sopravvivenza delle cellule potrebbero essere diverse dipenderà dai tipi di cellule, si suggerisce alla piastra densità delle cellule diversa (da 200K a 6.25K cellule per pozzetto). Inoltre, concentrazione virale può essere regolata (0.5X, 1X e 2X). 
Figura 3. Formazione di umana indotta colonia di cellule staminali pluripotenti da f trasdottaibroblast. In circa due settimane dopo ri-placcatura in MEF, colonie rotonde dovrebbero apparire e apparire come colonie di cellule staminali embrionali umane. Normalmente le colonie IPSC umani completamente riprogrammate hanno confini molto chiari. (Arrow: completamente riprogrammato colonie umane IPSC, punta di freccia: parzialmente riprogrammato iPSCs umano). Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita . 
Figura 4. Raccogliendo umane pluripotenti indotte colonie di cellule staminali. Colonie IPSC umani sono spesso circondate da cellule parzialmente riprogrammate (a sinistra). Sotto il microscopio, raccogliendo la colonia ES-like solo, rompere in piccoli grumi e poi trasferimento (a destra). Dopo 2 ~ 3 passaggi, ci sono colonie hiPSC indifferenziati (in basso e sinistra). (Arrow: completamente riprogrammate colonie umane IPSC, punta di freccia: umana parzialmente riprogrammato iPSCs) Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita . 
Figura 5. Colorazione immunofluorescenza con i marcatori di cellule staminali pluripotenti. Saggio di immunofluorescenza mostra iPSCs umani hanno stemness features.SSEA-4, TRA-81, Nanog, marcatori pluripotenti Oct-4AS e DAPI è un controllo per la colorazione del nucleo. (A) rappresenta H9 colorazione come campione di controllo. (B) e (C) mostrano cloni IPSC umani.et = "_blank"> Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita. 
Figura 6. Conferma del livello di espressione del transgene. Almeno dopo coltura 10-passaggio di iPSCs umani, il silenziamento di Sox2 esogena, Klf-4, c-Myc e ottobre-4 livelli di espressione genica è confermato da reazioni a catena della polimerasi transcriptasi inversa. hGAPDH è un controllo interno. Per un controllo positivo, l'RNA viene estratto dai fibroblasti avanzi trasdotte (giorno 7 dopo l'infezione Sendai-virus). (corsia 1: Marker, corsie 2-6: GAPDH, Klf4, c-Myc, ottobre-4, e Sox-2 in controllo positivo, corsie 7-11: GAPDH, Klf4, c-Myc, Oct-4, e Sox -2 in hiPSCs). Nome Primer <td> Sequenza hOCT4 (F) CCC GAA AGA GAA GAA AGC CCA G hOCT4 (R) AAT GTA TCG AAG GTG CTC AA hMYC (F) TAA CTG ACT AGC AGG CTT GTC G hMYC (R) TCC ACA TAC AGT CCT GGA TGA TGA TG hSOX2 (F) ACA AGA GAA AAA ACA TGT ATG G hSOX2 (R) ATG CGC TGG TTC ACG CCC GCG CCC AGG hKLF4 (F) ACA AGA GAA AAA ACA TGT ATG G hKLF4 (R) CGC GCT GGC AGG GCC GCT GCT CGA C hGAPDH (F) AGG TCG GAG TCA ACG GAT TTG hGAPDH (R) GTG ATG GCA TGG ACT GTG GT
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Discussion
Riprogrammazione delle cellule somatiche umane per hiPSCs detiene promesse senza precedenti nella biologia di base, medicina personale, e il trapianto 12. In precedenza, le generazioni IPSC umane necessarie virus a DNA che ha il rischio di integrazione nel genoma dell'ospite, che può creare mutazioni genetiche indesiderabili che limitano ulteriori applicazioni cliniche quali sviluppo di farmaci e terapie di trapianto 13. Con questa ragione, molti studi sono stati riportati per generare-vettore e sistema iPSCs umani senza transgene per diversi metodi alternativi, ma allo stesso tempo, l'efficienza di isolare 'impronta libero' iPSCs umana devono essere considerati. Ad esempio, il virus RNA dovrebbe avere un livello minimo di aberrazione genetica confrontare con altri metodi 14, anche se non c'è la pubblicazione per intero sequenziamento del genoma per dimostrare la 'sicurezza genomica' del virus-mediata Sendai generazione iPSC ancora. Qui, presentiamo un metodo per generare hiPSCs con l'Sendai-virus che ha un'alta efficienza riprogrammazione in modo conveniente. I iPSCs umani risultanti sono liberi di transgene con il mantenimento di somiglianze cellulari e molecolari di hESC in potenziale proliferativo e di sviluppo.
Possiamo riprogrammare diverse origini di fibroblasti (> 4) Allo stesso tempo con una sola serie di Sendai-virus. E nel nostro metodo, applichiamo diverse confluenze cellulari e le differenze di dosaggio virus. Questo 'mix and match' tecnica combinazione può massimizzare l'efficacia riprogrammazione. I fibroblasti (da un singolo paziente) in ciascun pozzetto hanno un diverso livello di infezione da virus, ma mettendo in comune, la possibilità di fare hiPSCs colonie potrebbero aumentare in base alla nostra esperienza. Altre questioni della variazione clonale tra le linee hiPSC sono tasso di proliferazione, adesione cellulare / sopravvivenza, lo stato di inattivazione del cromosoma X 15, differenziazione Potenziali 16, ecc Infatti, abbiamo osservato che ogni clone ha un diversoent propensione neurale, che poteva essere previsto misurando il livello di espressione di un cluster mir-371. Inoltre siamo riusciti a generare iPSCs umani da mioblasti umani con questo metodo, il che suggerisce che il virus Sendai-può essere utilizzato per vari tipi di cellule differenti nel processo di riprogrammazione. Inoltre, utilizzando il nostro metodo, abbiamo generato hiPSCs in più di 10 diversi fibroblasti relazione con la malattia. In media, 5-10 cloni hiPSC potrebbero essere ottenuti da uno dei fibroblasti.
Anche se la derivazione di cellule iPS umane libero transgene con la Sendai-virus è il metodo più efficace riprogrammazione che potrebbe essere i percorsi più pratici, ci sono alcune limitazioni da considerare in questo protocollo;
- A seconda di ogni lotto Sendai-virus, il titolo virale deve essere calcolato per coerente MOI (come descritto in 2.4).
- Abbiamo osservato la variazione di infettività tra le diverse cellule somatiche, che ha anche bisogno di titolazione supplementare per Robuinfezione virale st.
- Il virus Sendai riprogrammazione mediata può essere considerata come una delle migliori scelte per scopi di ricerca. Ma per la sperimentazione clinica, potrebbe non essere la prima scelta, poiché non vi è un problema di licenza con la società che ha originariamente sviluppato il sistema di virus Sendai.
- Ci vogliono circa due mesi fino a quando le cellule somatiche riprogrammate sono esenti da transgeni, che è il motivo per cui abbiamo bisogno di controllare l'espressione del transgene dopo almeno 10 passaggi.
- Sembra che il numero passaggio del fibroblasti in coltura primaria può influenzare l'efficienza della riprogrammazione con il Sendai-virus, anche se non abbiamo un confronto diretto. Il tasso di proliferazione ha anche bisogno di essere determinato. Sono necessari ulteriori studi per determinare l'effetto di fibroblasti numeri passaggio e la proliferazione sull'efficienza riprogrammazione.
- In questo studio, usiamo un livello di alimentazione del mouse per la generazione e la manutenzione hiPSC, ma un sistema gratuito di alimentazione può essere un alternative così in uno studio futuro.
Il nostro protocollo attuale è stato un passo importante verso lo studio hiPSCs paziente-specifiche per la modellazione malattia, medicina rigenerativa, e altre applicazioni.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare i membri del laboratorio Lee per le discussioni importanti sul manoscritto. Il lavoro in laboratorio Lee è stato sostenuto da sovvenzioni dal Robertson Investigator Award of Foundation di New York Stem Cell e dal Maryland Stem Cell Research Fund (TEDCO).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CytoTune-iPS Reprogramming Kit | Invitrogen | A1378002 | |
| CF-6,MEFs, neomycin-resistant, mitomycin C treated | Global stem | GSC-6105M | 5 x 105/6 cm or 12.5 x 105/24-well plate |
| Trypsin EDTA 0.25% Trypsin with EDTA 4Na 1X | Invitrogen | 25200114 | |
| DMEM/F-12 medium | Invitrogen | 11330-032 | |
| 24-well Cell Culture Plate, flat-bottom with lid | BD | 353935 | |
| Y-27632 | TOCRIS | 1254 | 10 μM (Stock: 10 mM) |
| basic fibroblast growth factor | LIFE TECHNOLOGIES | PHG0263 | 10 ng (Stock : 100 ug) |
| Knock-out serum replacement | Gibco | 10828028 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (D-MEM, DMEM) (1X), liquid (high glucose) | Invitrogen | 11965118 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Scientific Fermentas | SH30071.03 | |
| L-Glutamine-200 mM (100X), liquid | GIBCO | 25030-081 | 1/100 |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X | LIFE TECHNOLOGIES | 11140050 | 1/100 |
| 2-Mercaptoethanol (1,000X), liquid | GIBCO | 21985023 | 1/1,000 |
| Hausser Phase Contrast Hemacytometers | Hausser Scientific | 02-671-54 | |
| EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution | Millipore | ES-006-B | |
| SSEA-4 | DSHB | MC-813-70 | 1/200 |
| anti-Tra-1-81 | Cell Signaling | 4745S | 1/200 |
| mouse monoclonal Oct4 antibody | Santa Cruz | SC-5279 | 1/1,000 |
| Nanog | R&D | AF1997 | 1/1,000 |
| Alexa Flouor 488 goat anti-mouse | Invitrogen | 948492 | 1/2,000 |
| DPBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline), 1X without calcium & magnesium | Cellgro | 21-031-CV | |
| QuantiTect Reverse Transcription Kit | QIAGEN | 205313 | |
| PCR Master Mix [2X] | Thermo Scientific Fermentas | K0171 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596018 | |
| picking hood | NuAire | NU-301 | |
| dissecting scope | Nikon | SMZ745 |
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