Summary
Здесь мы представляем наш стандартный метод перепрограммирования соматических клеток человека в трансгенных без человека ИПСК с вирусом Сендай, который показывает последовательное исход и повышенную эффективность.
Abstract
Несколько лет назад, создание человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) открыла новую эпоху в биомедицине. Потенциальные области применения человеческих ИПСК включают моделирования патогенеза генетических заболеваний человека, аутогенной клеточной терапии после коррекции гена, и персональная проверка лекарств, предоставляя источник конкретного пациента и симптомов соответствующих клеток. Тем не менее, существует несколько препятствия для преодоления, такие как устранение оставшегося фактор перепрограммирования трансгена выражение после производства человека ИПСК. Что еще более важно, остаточная трансгенная экспрессия в недифференцированных человека ИПСК может помешать надлежащие дифференциации и дезинформировать интерпретацию болезни-соответствующей в фенотипов пробирке. С этой причине интеграция свободной и / или трансгенные свободного человека ИПСК были разработаны с использованием нескольких методов, таких как аденовирус, системы PiggyBac, minicircle вектор, эписомные векторы, прямой доставки белков и синтезированы мРНК. Тем не менее, эффективность reprogramming помощью интеграции без методов является довольно низким в большинстве случаев.
Здесь мы представляем метод, чтобы изолировать человека ИПСК с помощью Сендай-вирус (РНК вируса) на основе системы перепрограммирования. Этот метод перепрограммирования показывает стабильные результаты и высокую эффективность в экономически эффективным образом.
Introduction
Эмбриональные стволовые клетки человека (ЭСК) имеют мощность до самообновлению в пробирке и есть плюрипотентности, который может быть потенциально полезными для моделирования заболевания, для скрининга лекарственных средств, а также разработки клеточной терапии для лечения заболеваний и повреждения тканей. Тем не менее, ЭСК имеют ограничение для заместительной клеточной терапии из-за иммунологических, онкологических и этических барьеров, а также для изучения генов заболеваний, связанных, по конкретным болезням ЭСК могут быть выделены через предимплантационной генетической диагностики (ПГД) приближается, но он по-прежнему технически сложными и эмбрион пожертвования довольно редки. Эти вопросы связаны с прогрессом в биологии стволовых клеток, что привело к развитию индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs).
Человека ИПСК генетически перепрограммировать от взрослых соматических клетках человека и гавань плюрипотентных клеток-подобные функции стволовых подобные ЭСК, что делает их полезным источником для регенеративной медицины, таких как гОткрытие ковер, моделирование болезней и клеточной терапии в пациент-специфической манере 1,2.
До сих пор, есть несколько методов для создания человека ИПСК, в том числе вирус-опосредованной (ретровируса и аденовируса) 3, не вирус опосредованной (система БАК и векторы трансфекции) 4 гена каскадов, и белок система доставки 5-7.
Хотя поставка вирус-опосредованной генов может обеспечить определенный уровень эффективности, вирусные векторы могут оставить генетический след, потому что они интегрироваться в хромосомы хозяина, чтобы выразить гены перепрограммирования неконтролируемым образом. Даже когда вирусный интеграция факторов транскрипции может активировать или инактивировать гены хост-8, это может вызвать неожиданное генетической аберрации и риск онкогенеза 5,9. С другой стороны, сообщалось прямое введение белков или РНК в соматических клетках, но имеют некоторые недостатки, такие как трудоемкий, при неоднократном TransfАЗДЕЛ, и низкий уровень перепрограммирования 7,10. Даже эписомными и не интеграции аденовирус, вирус адено-ассоциированный, и плазмидные векторы все еще относительно менее эффективным 11. По этим причинам, то вполне вероятно, чтобы выбрать не-интеграционные методы перепрограммирования с высокой эффективностью генерации IPSC и меньше генетических аномалий. В этом исследовании, мы используем перепрограммирование Сэндай вирус основе. Этот метод, как известно, не-интегрированы в геном хозяина и последовательно производит человека ИПСК без трансгенных интеграции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка Cell и СМИ (день 1)
- Культура и расширить фибробластов человека с DMEM среде, содержащей 10% FBS.
- Пластинчатые фибробласты человека (рис. 1) на 24-луночный планшет при соответствующей плотности на лунку в день перед трансдукции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие серийные разведения рекомендуется (200K, 100K, 50K, 25K, 12.5K и 6.25K), потому что разные типы клеток имеют разные способности вложений. - Инкубируйте клетки для еще одного дня в 37 ° С, 5% СО 2 инкубатора, обеспечивая клетки полностью придерживался и расширена.
2. Выполните трансдукция (День 2)
- В день трансдукции, проверьте плотность клеток и выбрал наиболее эффективные скважин плотности (рис. 2). Лучше выбрать три различных плотностей: высокая (80 ~ 90%), средний (50 ~ 70%) и низкий (20 ~ 40%).
- По крайней мере, 1 час до трансдукции, аспирации fibroblАСТ носители из клеток и изменение новых 300 мкл фибробластов среды.
- Удалить один набор 4-х различных вирусных Сендай труб от -80 ° C хранения. Оттепель каждую пробирку в то же время в водяной бане при 37 ° в течение нескольких секунд, а затем извлечь пробирки из водяной бане. После этого оттаивают их до комнатной температуры; центрифужные пробирки на 6000 мкг в течение 10 сек и разместить их на льду до использования. Не повторно при замораживании и оттаивании вирус, так как титры не будет поддерживать.
- Добавить указанные объемы каждой из четырех труб вирус Сендай (OCT-4, Klf-4, с-Myc и Sox-2) в микро-центрифужную пробирку. Убедитесь, что раствор хорошо перемешивают с помощью пипетки осторожно.
Например, если 50K клеток / одна скважина из пластины lookwell 24-а для трансдукции:
(Титр на основе сертификата анализа от Life Technologies, может отличаться от партии к партии)
Труба hOct-4 = 6,0 х 10 7 CIU, 3 МВД = 5 мкл
Труба hSox-2 = 6,5 х 10 7 CIU, 3 МВД = 4,6 μ; Л
Труба hKlf-4 = 6,3 х 10 7 CIU, 3 МВД = 4,8 мкл
Труба жк-Мус = 7,8 х 10 7 CIU, 3 МВД = 3,8 мкл
Всего = 18.2 мкл четырех вирусных факторов смесь / один а (50K ячеек) 24-луночный планшет - В зависимости от плотности клеток; добавить 2X, 1X, и 0.5x объем вируса смеси в скважину. Аккуратно встряхните планшет спереди назад, влево и вправо (2X: 36,4 мкл вируса смеси, 1X: 18,2 мкл и 0.5x: 9.1 мкл).
- Поместите клетки в 37 ° С, 5% СО 2 инкубатора и инкубировать в течение ночи.
3. Замена культуральной среды (День 3 & 5-й день)
- 24 часа после трансдукции, замените носитель с 500 мкл свежей среды фибробластов.
- На 5-й день, изменить Средний свежим фибробластов СМИ.
4. Подготовьте MEF Посуда для сотрудничества культуры (День 8)
- Подготовка MEF клеток в 60 мм чашки для культивирования с 10% FBS содержится среде ДМЕМ один DAу до пассажей Трансдуцированные фибробластов на MEF фидерных клеток.
Примечание: Мы используем 5 х 10 5 из MEF в каждом 60 мм блюдо.
5. Первая Со-культуры трансдуцированных клеток с MEF фидерных клеток (День 9)
- Перед покрытием трансдуцированных клетки, аспирации 10% FBS содержится DMEM СМИ от MEF фидерных блюд и добавить свежий 10% FBS, содержащуюся DMEM среду.
- Удаление среды из трансдуцированных фибробластов, которые находятся в 24-луночный планшет и промыть клетки один раз D-PBS. Добавить 200 мкл 0,25% трипсина / EDTA в клетках фибробластов InThe 24-луночный планшет. После менее 5 мин инкубации с трипсином / EDTA, когда клетки начинают отделяться от пластины, собирают клетки с ростовой среды в 15 мл коническую трубку. Тогда отцентрифугированы в 6000 мкг в течение 4 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Объединение 2X, 1X, и вирус 0.5x трансдуцировали фибробластов рекомендуется. - Удалить супернатантной среды и мыть повторно приостановитьОсадок клеток с 4-5 мл свежего фибробластов среды для нейтрализации с трипсином. Тогда отцентрифугированы при 135 мкг в течение 4 мин.
- Пластина клеток как последовательный плотности разбавления и начинают сотрудничать культуры с фибробластов СМИ на MEF: такие, как 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64 и 1/128 с 60 мм блюдо. В зависимости от уровня смертности клеток в течение первой недели трансдукции, не может потребоваться развести на 1/2 или 1/128 плотности. Поместите в сторону остальные ячейки для извлечения суммарной РНК в качестве положительного контроля для Transgene RT-PCR.
- Наведите 60 мм блюда в 37 ° С, 5% СО 2 инкубатора в течение ночи.
6. Поток человеческих эмбриональных стволовых клеток Средний и монитор клеток (день 10)
- На следующий день, изменить фибробластов СМИ для человеческого ES СМИ с 10 мкМ Y-27632. После этого изменить средний ежедневно с человеческим ES среды: 800 мл DMEM/F12 + 200 мл Нокаут заменитель сыворотки + 10 мл L-глютамина + 10 мл 10 мМ MEM минимальных несущественных аминокислот+ 1 мл 2-меркаптоэтанола + 10 нг / мл основного фактора роста фибробластов.
- У ежедневная смена СМИ со свежими человека СМИ ES. Через неделю, проверить посуду раз в 2 ~ 3 дней под микроскопом для формирования ES колониеобразующих как сгустки клеток. В зависимости от типа клеток, культуры займет больше или меньше времени перед колонии найдено.
7. Выбор индуцированных плюрипотентных стволовых клеток колоний и Развернуть клеток (день 20 ~)
- Через три недели после трансдукции, колонии должны появиться выросли должным образом для сбора.
- За день до сбора колонии, подготовить MEF подачи в 24-луночный планшет.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мы используем 12,5 х 10 5 из MEF в одном 24-луночный планшет. - На следующий день, изменить среду MEF блюд из фибробластов СМИ для человеческого ES СМИ с 10 мкМ Y-27632. Вручную выбрать одну колонию в каждый момент времени под микроскопом в захватывающего капотом и сделать меньше сгустки с помощью пипетки и передавать ихна недавно подготовлен MEF dishes.Try подобрать несколько клонов.
- Прохождение и расширить каждую лунку с 24-луночный планшет для луночный планшет первоначально 6. Тогда из 6-луночный планшет до 60 мм блюд до дальнейшего размножения.
8. Характеристика человека ИПСК (после 10 пассажей)
- Иммунофлюоресценция
- Пластинчатые человека ИПСК в 24-луночный планшет и культуры в течение 4-5 дней с ежедневной сменой СМИ.
- Для запуска иммунофлуоресцентной, мыть тарелку с D-PBS один раз. Затем зафиксировать клетки немедленно в 0,4% параформальдегидом в течение 30 мин. После этого мыть три раза в D-PBS в течение 5 мин.
- Treat фиксированные клетки с 0,1% Тритон Х-100 в ЗФР раствора в течение 15 мин при комнатной температуре.
- Аспирируйте permeablization раствор (0,1% Х-100 раствор тритона), затем добавляют 0,5%-ный раствор блокирующего BSA в течение 1 часа при комнатной температуре.
- Выполните обнаружение Nanog, Oct-4, SSEA (этап-эмбриональный antigен) и TRA-1-81 (опухоль отказ антиген) с использованием анти-человеческого антитела в 0,5%-ном растворе БСА (проверить материал таблицу для скорости разбавления антитела). Инкубировать первичными антителами в течение 2 ч при комнатной температуре. Затем промыть три раза в D-PBS в течение 5 минут каждый.
- Проверка с помощью флуоресцентной микроскопии после 1 часа инкубации с Alexa Fluor 488 козьего антитела против мышиных IgG антител в качестве 2-го антитела, которые разбавленного 1:2000 в 0,5%-ном растворе БСА при комнатной температуре. Пятно все ядра каждого MEF фидерных клеток и hiPSCs с DAPI.
- ОТ-ПЦР трансгенных Подтверждение
- Выписка общее мРНК из клеточного осадка с помощью экстракции РНК реагентов.
- Выполните обратную транскрипцию на аликвоты (1 мкг) общей РНК и полученную кДНК для ПЦР-амплификации с помощью обратной транскриптазы.
- Подготовка смеси ПЦР, содержат 2 мкл кДНК-матрицей, 10 мкл 2X PCR Master Mix, 2 мкл 2 пмоль праймеров(Вперед: 1 мкл и обратного: 1 мкл) и 6 мкл DW. Для обнаружения экспрессии гена, делают ОТ-ПЦР с праймерами, перечисленных в таблице 1.
- Выполните RT-МКП с геном GAPDH в качестве контроля для эффективности реакции амплификации. Визуализации и анализа ПЦР-продукта на 1% агарозном геле.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Обычно зараженные фибробласты не показывают морфологические изменения в несколько дней после вирус Сендай трансдукции, но через пять дней, они начинают иметь различные формы (рис. 1). Как описано в правой панели, показанной на фиг.1, клетки не имеют типичную морфологию фибробластов больше. Они имеют круглую форму и большую ядро, чем цитоплазме. Даже когда трансдукции выполняется в 80% сотовой слияния, похоже, они менее сливающийся в колодце после они начинают перепрограммировать. Если эти виды морфологических изменений начинают рассматриваться в самых скважины, трансдуцированные фибробласты готовы быть покрыты на МЭФ-фидерных чашек для культивирования.
В нашем протоколе, мы сведены к минимуму масштаб культуре клеток, а также дал различные возможности перепрограммирования, например используя различную плотность клеток фибробластов и титр вируса и последующего нескольких соотношение повторно покрытие MEF, что позволит увеличить hiPSCs эффективность выработки ( В начале перепрограммирования на MEF фидеров, трудно отличить трансдуцированные типы клеток, но после более одной недели от совместного культивирования, частично перепрограммировать фибробласты появляются и выглядеть ослаблены ES-образную форму (рис. 3). Именно по этой причине, когда человека колонии ИПСК готовы для пассажей в новой MEF подачи блюда, ручное прослеживание является более эффективным способом для передачи вместо диссоциации с ферментом. В рисунках 3 и 4, под микроскопом только человеческие ИПСК иметь четкие края, которые делают четкое различие между человека ИПСК (рассматриваемых как «полностью перепрограммировать клетки») и «полностью перепрограммировать клетки" по морфологии. Полностью перепрограммировать клетки вотв порядке, как компактный и плотно упакованы. Особенно колонии имеют четкую границу, в то время как частично перепрограммировать клетки выглядеть собираются вместе, чтобы сделать колонию, но очень потерять и хрупкая, чтобы сломать. Даже если мы делаем пипетирование мягко он легко отделяется. Даже после исключения частично перепрограммировать человека ИПСК колонии (во время их расширения и пассирование), полностью перепрограммировать человека ИПСК необходимо поддерживать с помощью ручного сбора. После выбора колонии и расширения hiPSC клонов в течение нескольких недель, экспрессия стволовости маркеров должна быть определена. После расширения hiPSC клонов, мы проверим их с различными наборами тестов, включая окрашивания антител (SSEA4, Oct-4, TRA-81 и Nanog) и ОТ-ПЦР плюрипотентных маркера (данные не показаны) в качестве контроля качества. По сравнению с H9, два разных hiPSCs положительны для SSEA4, Oct-4, TRA-81, и Nanog. Этот результат показывает, что изолированные населенные ИПСК приобрела плюрипотентных качество ( Наконец, на рисунке 6 показывает, что мы не можем обнаружить любой экспрессию трансгена в hiPSC клонов ОТ-ПЦР. По крайней мере, в течение 10 пассажей hiPSCs, специфические праймеры (табл. 1) для экзогенный Oct-4, Sox-2, Klf-4 и C-Myc может быть использован с образцами положительного контроля с сильным уровнем экспрессии трансгена. Таблица 1. Праймеры RT-ПЦР для подтверждения трансгена. Эти последовательности праймеров, которые используются для TRAподтверждение nsgene. Т м является 50,6 ° C во всех наборов праймеров. 
Рисунок 1. Морфологические изменения после вирус Сендай трансдукции. Перед трансдукции, фибробласты показать типичную шпинделя-образную форму (слева). Примерно через восемь дней после трансдукции, морфология трансдуцированные изменения клеток, как гораздо более круглой формы (справа). Пожалуйста, нажмите чпрежде чем, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. 
Рисунок 2. Схема индукционного плана для обеспечения максимальной эффективности. Более четырех различных типов клеток могут быть покрыты в 24-луночный планшет (от 1 до 4). Поскольку их способность крепление и выживаемость клеток могут быть различными в зависимости от типов клеток, предлагается к пластине различную плотность клеток (от 200K до 6.25K клеток на лунку). Кроме того, концентрация вируса может быть отрегулирована (0.5x, 1x и 2x). 
Рисунок 3. Формирование антропогенных колонии плюрипотентных стволовых клеток из трансдуцированной еibroblast. Примерно через две недели после повторного посева их в MEFs, круглые колонии должны появиться и выглядеть эмбриональных колоний стволовых клеток человека. Обычно полностью перепрограммировать человека колонии ИПСК имеют очень четкие границы. (Стрелка: полностью перепрограммировать колонии людей IPSC, стрелку: частично перепрограммировать человеческий ИПСК). Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение . 
Рисунок 4. Подняв человека индуцированных плюрипотентных колонии стволовых клеток. Человека колонии ИПСК часто окружены частично перепрограммировать клетки (слева). Под микроскопом, выбирая ES-как колонию только, распадаются на небольшие пряди, а затем перевод (справа). Через 2 ~ 3 проходов, Есть недифференцированные колонии hiPSC (внизу и слева). (Стрелка: полностью перепрограммировать человека колонии ИПСК, наконечник стрелы: частично перепрограммировать человеческий ИПСК) Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение . 
Рисунок 5. Иммунофлуоресцентное окрашивание с стволовых клеток плюрипотентные маркеров. Реакция иммунофлюоресценции показывает человека ИПСК есть стволовости features.SSEA-4, TRA-81, Nanog, Окт-4aS плюрипотентные маркеры и DAPI является элементом управления для ядра окрашивания. (А) представляет окрашивание H9 качестве контрольного образца. (B) и (C) показывают человеческих клонов ИПСК.ET = "_blank"> Нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение. 
Рисунок 6. Подтверждение уровня экспрессии трансгенов. По крайней мере, после 10-прохода культуре человеческих ИПСК, глушителей экзогенного Sox2, КФК-4, C-Myc, и октябрь-4 уровня экспрессии генов подтверждается обратной цепной реакции транскриптазы полимеразы. hGAPDH является внутренний контроль. Для положительного контроля, РНК экстрагируют из оставшихся трансдуцированных фибробластов (7 день после Сэндай вирусной инфекции). (полоса 1: Маркер, полосы 2 - 6: GAPDH, Klf4, с-Myc, октябрь-4, и Сокс-2 в положительного контроля, дорожки 7 - 11: GAPDH, Klf4 с-Myc, Окт-4, и Сокс -2 в hiPSCs). Грунтовка Имя <TD> Последовательность hOCT4 (F) CCC ГАА AGA ГАА АРУ ГАА ОСО G hOCT4 (R) ААТ GTA TCG AAG GTG СТС А.А. hMYC (F) ТАА КТГ ACT АРУ AGG СТТ GTC G hMYC (R) TCC АСА TAC АГТ ССТ GGA TGA TGA Т.Г. hSOX2 (F) АСА AGA ГАА AAA ACA TGT ATG G hSOX2 (R) ATG CGC TGG TTC АЧГ CCC GCG CCC AGG hKLF4 (F) АСА AGA ГАА AAA ACA TGT ATG G hKLF4 (R) CGC GCT GGC AGG GCC GCT GCT CGA C hGAPDH (F) AGG TCG ГАГ TCA АЧГ GAT ТТГ hGAPDH (R) ГТГ ATG GCA TGG ACT ГТГ GT
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Перепрограммирование соматических клеток человека в hiPSCs проводит беспрецедентные обещания в фундаментальной биологии, личной медицине и трансплантации 12. Ранее человека поколений ИПСК требуется вирус ДНК, которая имеет интеграционный риск в геном хозяина, который может создать нежелательные генетические мутации, которые ограничивают дальнейшие клинические приложения, такие как лекарства разработки и трансплантации терапии 13. С этой причине, многие исследования были зарегистрированы для получения Vector-и трансгенных без системы человека ИПСК несколькими альтернативными методами, но в то же время, эффективность изоляции 'фут-печать бесплатный' человека ИПСК должны быть рассмотрены. Например, вирус РНК должны иметь минимальный уровень генетической аберрации по сравнению с другими методами 14, хотя нет издание для всей секвенирования генома для демонстрации 'геномной безопасности "Сендай вирус-опосредованной IPSC поколения еще. Здесь мы представляем метод для генерации hiPSCs сСэндай вирус, который имеет высокую эффективность перепрограммирования в экономически эффективным способом. Полученные человека ИПСК свободны от трансгенов с обеспечением клеточных и молекулярных сходства в ЭСК в пролиферативной и развития потенциала.
Мы можем перепрограммировать различные (> 4) происхождение фибробластов в то же время только с одним набором Сендай-вируса. И в нашем методе, мы применяем различные слияния клеток и вируса лекарственных различия. Это "смешивать и сочетать" сочетание техника может максимизировать перепрограммирования эффективность. Фибробласты (от одного пациента) в каждую лунку имеют различный уровень вирусной инфекции, но, объединив вместе, возможность принятия hiPSCs колонии может увеличиться на основе нашего опыта. Другие выпуски клонального различий между hiPSC линий скорость пролиферации, привязанность клеток / выживание, статус Х-хромосомы инактивации 15, дифференциация потенциалов 16, и т.д. Действительно, мы обнаружили, что каждый клон имеет отличаютсяЛОР нейронной склонность, которая могла бы быть предсказана путем измерения уровня экспрессии Мир-371 кластера. Кроме того, нам удалось в создании человека ИПСК из человеческих миобластов с помощью этого метода, что позволяет предположить, что Сэндай вирус может быть использован для различных типов клеток в процессе перепрограммирования. Кроме того, с помощью нашего метода, мы сформировали hiPSCs в более чем 10 различных заболеваний, связанных с фибробластами. В среднем, от 5 до 10 hiPSC клоны могут быть получены из одного фибробластов.
Хотя вывод трансгенных без человеческих клеток плюрипотентных с Сендай-вируса является наиболее эффективным методом перепрограммирования, которые могут быть наиболее практичными пути, есть несколько ограничений, которые необходимо учитывать в данном протоколе;
- В зависимости от каждого вируса Сендай-серии, титр вируса должна быть рассчитана для последовательного MOI (как описано в 2.4).
- Мы наблюдали изменение инфекционной между различными соматическими клетками, что также нуждается в дополнительных титрования для Робуул вирусная инфекция.
- Вирус Сендай опосредованной перепрограммирование можно рассматривать как один из лучших вариантов для исследовательских целей. Но для клинического испытания, она не может быть первым выбором, так как есть вопрос лицензирования с компанией, которая изначально разработанный вирус Сендай систему.
- Она занимает около двух месяцев, пока перепрограммировать соматические клетки не свободны от трансгенов, и именно поэтому мы должны проверить экспрессию трансгена после не менее 10 проходов.
- Похоже, что проход количество первичного культурного фибробластов может повлиять на эффективность перепрограммирования с Сендай-вируса, хотя мы не имеем прямое сравнение. Скорость пролиферации также должна быть определена. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы определить влияние фибробластов числа пассажей и их распространения на эффективность перепрограммирования.
- В этом исследовании мы используем питательный слой мыши для генерации и обслуживания hiPSC, но свободная система подачи может быть Alternativэ способ в будущем исследовании.
Наш текущий протокол был важным шагом на пути к изучению пациент-специфических hiPSCs для моделирования заболевания, регенеративной медицины, и других приложений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить членов лаборатории Ли за ценные обсуждения по рукописи. Работа в лаборатории Ли была поддержана грантами от Robertson следователь премии Нью-Йорк Фонда стволовых клеток и из Мэриленда Исследования стволовых клеток фонд (TEDCO).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CytoTune-iPS Reprogramming Kit | Invitrogen | A1378002 | |
| CF-6,MEFs, neomycin-resistant, mitomycin C treated | Global stem | GSC-6105M | 5 x 105/6 cm or 12.5 x 105/24-well plate |
| Trypsin EDTA 0.25% Trypsin with EDTA 4Na 1X | Invitrogen | 25200114 | |
| DMEM/F-12 medium | Invitrogen | 11330-032 | |
| 24-well Cell Culture Plate, flat-bottom with lid | BD | 353935 | |
| Y-27632 | TOCRIS | 1254 | 10 μM (Stock: 10 mM) |
| basic fibroblast growth factor | LIFE TECHNOLOGIES | PHG0263 | 10 ng (Stock : 100 ug) |
| Knock-out serum replacement | Gibco | 10828028 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (D-MEM, DMEM) (1X), liquid (high glucose) | Invitrogen | 11965118 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Scientific Fermentas | SH30071.03 | |
| L-Glutamine-200 mM (100X), liquid | GIBCO | 25030-081 | 1/100 |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X | LIFE TECHNOLOGIES | 11140050 | 1/100 |
| 2-Mercaptoethanol (1,000X), liquid | GIBCO | 21985023 | 1/1,000 |
| Hausser Phase Contrast Hemacytometers | Hausser Scientific | 02-671-54 | |
| EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution | Millipore | ES-006-B | |
| SSEA-4 | DSHB | MC-813-70 | 1/200 |
| anti-Tra-1-81 | Cell Signaling | 4745S | 1/200 |
| mouse monoclonal Oct4 antibody | Santa Cruz | SC-5279 | 1/1,000 |
| Nanog | R&D | AF1997 | 1/1,000 |
| Alexa Flouor 488 goat anti-mouse | Invitrogen | 948492 | 1/2,000 |
| DPBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline), 1X without calcium & magnesium | Cellgro | 21-031-CV | |
| QuantiTect Reverse Transcription Kit | QIAGEN | 205313 | |
| PCR Master Mix [2X] | Thermo Scientific Fermentas | K0171 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596018 | |
| picking hood | NuAire | NU-301 | |
| dissecting scope | Nikon | SMZ745 |
References
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
- Okita, K., Nakagawa, M., Hyenjong, H., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of mouse induced pluripotent stem cells without viral vectors. Science. 322, 949-953 (2008).
- Zhou, W., Freed, C. R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27, 2667-2674 (2009).
- Woltjen, K., et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458, 766-770 (2009).
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8, 409-412 (2011).
- Yusa, K., Rad, R., Takeda, J., Bradley, A. Generation of transgene-free induced pluripotent mouse stem cells by the piggyBac transposon. Nature Methods. 6, 363-369 (2009).
- Kim, D., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins. Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).
- Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
- Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature. 448, 313-317 (2007).
- Yoshioka, N., et al. Efficient Generation of Human iPSCs by a Synthetic Self-Replicative RNA. Cell Stem Cell. 13, 246-254 (2013).
- Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. K., Ye, Z., Cheng, L. Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression. Nature Protocols. 7, 2013-2021 (2012).
- Fluri, D. A., et al. Derivation, expansion and differentiation of induced pluripotent stem cells in continuous suspension cultures. Nature Methods. 9, 509-516 (2012).
- Nakagawa, M., et al. Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts. Nature Biotechnology. 26, 101-106 (2008).
- Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. P Jpn Acad B-Phys. 85, 348-362 Forthcoming.
- Silva, S. S., Rowntree, R. K., Mekhoubad, S., Lee, J. T. X-chromosome inactivation and epigenetic fluidity in human embryonic stem cells. P Natl Acad Sci USA. 105, 4820-4825 (2008).
- Kim, H., et al. miR-371-3 expression predicts neural differentiation propensity in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 8, 695-706 (2011).
