Summary
assay ביטוי גני תא הבודד שדרוש להבנת heterogeneities בתאי גזע.
Abstract
ההטרוגניות של אוכלוסיית תאי גזע פוגעת בהבנה מפורטת של ביולוגיה של תאי גזע, כגון הנטייה הבידול שלהם כלפי שושלות שונות. Assay transcriptome התא בודד יכול להיות גישה חדשה ללנתח וריאציה בודדת. פיתחנו שיטת qRT-PCR תא הבודד, ואישרתי כי שיטה זו עובדת היטב במספר פרופילי ביטוי גנים. ברמת תא בודדת, כל תא גזע עוברי אנושי, מסודרים על ידי Oct4 :: תאים חיוביים EGFP, יש ביטוי גבוה בOct4, אבל רמת ביטוי Nanog שונה. assay הביטוי שלנו בודד גן התא צריך להיות שימושי לחקור heterogeneities אוכלוסייה.
Introduction
אוכלוסיות eukaryote רוב גבוהות יותר הן הטרוגנית וכך עם ניתוח של אוכלוסייה נקוותה, הוא לעתים קרובות קשה לפרש תכונות הסלולריות שלהם. תאים בודדים בתוך אוכלוסייה עשויים להיות מעט שונים, והבדלים אלה יכולים להיות השלכות חשובות עבור הנכס והתפקוד של כל האוכלוסייה 1, 2. במיוחד, תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) ידועים להיות הטרוגניות, מה שגורם לרמות שונות של pluripotency ופוטנציאלים מגוונים למפרט שושלת בעדינות דרכים ייחודיות 3, 4. לדוגמא, ניתן להשתמש בם פני השטח אנטיגנים תא שונים כדי לסווג את תאי גזע pluripotent מובחנים, 5 וקבוצת אוסטין סמית מוצעת רמות שונות של pluripotency בתאי גזע העובריים של עכברים, המבוססים על המורפולוגיה, הנטייה והתלות של מסלול איתות 6 הבידול שלהם. תופעה זו הייתה שיערו בעובר אנושיתאי גזע NIC 7. בעוד שהמחקרים הכוללים בוצעו בין קווים שונים בתאי גזע, ולא בתאי גזע אחד בודדים, זה יכול להיות מאוד מעניין לנתח את הרמות של pluripotency שונים ברמת התא הבודד, אשר באופן פוטנציאלי משפיעה על יכולות ההבחנה שלהם כלפי כל שושלות התאים סומטיים.
הטרוגניות תאית ומולקולרית יכולה להיות מוכתבת על ידי פרופיל שעתוק, אשר נקראה "transcriptome התא הבודד 'ומדגישה גישות חדשות לכימות רמות ביטוי הגנים 8-10. לניתוח של רמות ביטוי הגנים בתאים בודדים, פיתחנו פרוטוקול פשוט, אבל חזק של תא הבודד RT-PCR. אנחנו אישרו את היעילות ואת הכדאיות של הפרוטוקול שלנו על ידי השוואת כל מחצית lysates תא הבודד, כמו גם RNAs הכולל דילול סדרתי של hESCs, וכתוצאה מוריאציות טכניות מינימליות והבדלים. יתר על כן, אנו משמשים קו כתב גנטי לבודד עמ הומוגניתopulation של hESCs באמצעות מערכת מיקוד גן. הווקטור התורם למיקוד לוקוס Oct4 (Oct4-2A-EGFP-PGK-Puro לבנות) וזוג פלסמידים Talen שימש 11. וקטור התורם וזוג פלסמידים Talen הוכנסו hESCs (H9, WA09) באמצעות nucleofection ופרוטוקול בחירה משובט והתחזוקה של hESCs בוצע על בסיס פרוטוקול השגרה שלנו 12. אנחנו אישרו שורת כתב זה גנטי לבטא EGFP לביטוי Oct4 בOct4 :: EGFP hESCs.
התוצאה שלנו מוכיחה כי hESCs הבודד (מסודרים על ידי Oct4 :: תאים חיוביים מאוד EGFP) להחזיק רמות גבוהות של ביטוי Oct4, אבל רמות של ביטוי Nanog שונות. לכן, assay הביטוי שלנו בודד גן התא צריך להיות שימושי ללמוד heterogeneities אוכלוסייה של תאי גזע pluripotent.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת פלייט 96 היטב
- מערבבים 1 μl של תא בודד DNase1 לתא בודד 9 μl תמוגה פתרון.
- שים את הפתרון מעורב 10 μl בכל טוב של 96 היטב צלחת ה-PCR.
2. ניתוק hESCs לטיהור FACS
- ניתוק Oct4 :: שורת תאי EGFP ES מצלחת 60 מ"מ עם 1 מיליליטר Accutase עבור 20 דקות, על 37 מעלות צלזיוס, שנוטרלו עם תקשורת ES אנושית.
- הכן את אוכלוסיית תאים ב 1 מיליליטר FACS חיץ ולהתאים את התא ל1 x 10 6 תאים / מיליליטר.
- להעביר את דגימת התא דרך צינור כובע מסננת תא 35 מיקרומטר.
- אחסן את הצינור בקרח לפני מיון תא.
3. תמוגה של תא בודד מטוהר-FACS בבאר כל הצלחת 96 היטב
- מיין את המדגם עבור תאים חיוביים EGFP על סדרן תא עם מפעיל מיומן. שים את התא הבודד לפתרון Lysis/DNase1 תא בודד בצלחת PCR 96 היטב. במידת צורך, 9צלחת 6 היטב עם מדגם יכולה להיות מאוחסנת ב-80 ° C מקפיא עמוק פחות מחודש.
- דגירה דגימות 5 דקות ב RT לתמוגה תא.
- הוסף 1 μl של להפסיק פתרון כדי לעצור את תגובת תמוגה.
- דגירה 2 דקות ב RT.
4. הפוך תמלול
- הוסף לכל aliquot 0.5 μl של 20 מיקרומטר SMA-T15, SMA-.
- הוסף 4 μl חיץ 5X, 2 μl DTT, μl ההפוך transcriptase 1, וdNTP μl 1 היטב כל אחד.
- לבצע שעתוק לאחור בCycler תרמית.
- הגדר את תכנית התרמית על 42 מעלות צלזיוס × 90 דקות ולהשבית טרנסקריפטאז הפוך על 85 מעלות צלזיוס × 5 דקות.
5. הגברה
- הוסף 4 μl של מגיב ExoSAP-IT לכל דגימה עיבד הפוך.
- דגירה דגימות ב 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות ו80 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות כדי להשבית מגיב ExoSAP-IT.
- הכן תערובת תגובת PCR wה-i SMA-P2 (2 ננומטר)
- הוסף 10 μl של תערובת תגובת PCR לכל דגימה הפוכה עיבד.
- לבצע את ההגברה, בהיקף של 20 מחזורים של denaturation (94 מעלות צלזיוס במשך 30 שניות), חישול (57 מעלות צלזיוס במשך 30 שניות), וסיומת (68 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות).
6. QRT-PCR ביצועים
- הוסף 10 μl של 2X SYBR גרין PCR מיקס מאסטר, 1 μl cDNA הגברה, 2 פריימרים ננומטר, ו7 מים μl היטב כל אחד.
- להגדיר את התכנית ואחרי 95 מעלות צלזיוס במשך 3 שניות, C ° 60 ל30 שניות x 40 מחזורים.
- לבצע בשני עותקים לטעויות טכניות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הגברה RNA התא בודדת יעילה וחזקה
כדי לצמצם את השוני בין תעתיק hESCs, השתמשנו Oct4 :: שיבוט EGFP hESC לטיהור FACS. לאחר מיון Oct4 :: תאים חיוביים EGFP לתוך צלחת 96 היטב, כל תא הוא lysed במאגר תמוגה והמיר פולי (א) + RNA לcDNA באורך מלא באמצעות פריימר SMA-T15 (GACATGTATCCGGATGTTTTTTTTTTTTTTTT) ועיגון עם SMA-(ACATGTATCCGGATGTGGG ) על ידי שימוש בטכנולוגית מיתוג תבנית SMART. Oligonucleotides העודפת היו מתעכל עם מגיב ExoSAP-IT, לאחר מכן על ידי 18-20 מחזורים של PCR הגברה של cDNA עם SMA-P2 (GACATGTATCCGGATGT) 13. אנו משמשים cDNA ההגברה כדי להפוך את התבנית לqRT-PCR (איור 1). ישנם מספר מחקרים על רצף באורך מלא RNA ומדידה של השתנות RNA באמצעות כמויות נמוכות של תאים ותאים בודדים 3, 14, 15. לoידע ur, אנחנו בדילול RNA הכולל של hESCs (כמויות מיקרוגרם) עד לרמות ננו ופיקו גרם ומיושמים הפרוטוקול שלנו כדי להעריך את השונות וגילוי טכניות של הבדל בכמויות נמוכות של רנ"א המוחלט. אנחנו נקבע את שחזור ברמות ביטוי הגנים שנוצרו מ-RNA המדולל ותאים בודדים. ניתוח של ה-RNA בדילול סדרה מציג מתאם בין כל דגימה ותוצאות qRT-PCR עם כמה תאים בודדים להראות את ערכי ה-CT הדומה בגן GAPDH (איור 2).
הערכה כמותית של פרופילים גנטיים תא בודדים
כדי לאמת את העקביות בין קבוצות שונות של תגובות שעתוק לאחור, חילקנו lysates תא הבודד מטוהר-FACS למחצית ומיושמים הפרוטוקול שלנו בנפרד לכל אחד מחצית מlysates להשוואות אצווה. אנחנו מסודרים תאים חיוביים EGFP חזקים באמצעות סדרן FACS (איור 3), ולכן רמת ביטוי Oct4 הייתה גבוהה בEGFPתאים חיוביים, אבל רמת ביטוי Nanog הוא שונות. התוצאה מראה קשר מובהק בין ערך Oct4 CT של כל מחצית lysates תא הבודד (איור 4).
ניתוח של פרופילים גנטיים בתאי גזע עובריים
אנחנו מסודרים hESCs הבודד ונותחו ברמת ביטוי הגנים שלהם תוך שימוש בפרוטוקול שלנו, אשר מציג רמת ביטוי Oct4 עקבית, ולאחר מכן בדקנו עוד Nanog גן סמן בתאי גזע בhESCs. כתוצאה מכך, ברמת ביטוי גני Oct4 הייתה גבוהה בכל תא ותא, אבל Nanog מציג דפוסים שונים (איור 5).
איור 1. סקירה סכמטי של תאי גזע עובריים אנושיים אחת qRT-PCR לאחר טיהור FACS.
איור 2. בזמן אמת RT-PCR של GAPDH באמצעות mRNA דילול סדרתי של תאי גזע עובריים אנושיים ונקווה. כל נקודה מראה את ערך CT של mRNA בדילול סדרתי וה-mRNA תא הבודד מסודרים על ידי FACS. סה"כ RNAs היו מדולל מ10 ng / ul ל0.1 pg / ul. אנו חוזרים על אותה ניסויים להשוואה ולעלילה ליניארית שנעשתה.
איור 3. ניתוח FACS של תאים חיוביים OCT. אנחנו מסודרים תא חיובי EGFP באמצעות סדרן FACS. שורת hESC כתב Oct4 :: EGFP מציגה אוכלוסייה חיובית EGFP 60% בערך בהשוואה לאוכלוסייה שלילית (ב '). בחרנו תאי EGFP חזקים חיוביים ().
איור 4. השוואה של רמת ביטוי גן בכל מחצית של lysates תא הבודד. כדי לאמת את העקביות בין קבוצות שונות של תגובות שעתוק והגברה הפוכה, חילקנו lysates תא בודד במחצית, ומיושמים הפרוטוקול שלנו להשוואה אצווה.
איור 5.60;. מצגת מפת החום של ביטוי עוברי אנושי אחד הגנים בתאי גזע ניתוח ביטוי גני תא בודד מטוהר על ידי FACS מראה ביטוי חזק בOct4, אבל רמת ביטוי שונה בNanog.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרופיל גנטי תא בודד יכול להיות כלי עיקרי לחזות את הפונקציונליות של תא בודד או אוכלוסייה שלמה. עקב מגבלות טכניות, ניתוח פרופיל הגנטי כולו הוגבל לממוצע אוכלוסייה. שינויים בדפוסי ביטוי גנים והרמות בין תאים הבודדים והאוכלוסיות הוצעו לגרום לפרשנות מוטעה. ניתן למצוא היבטים תאיים מגוונים כגון בhESCs וההטרוגניות שלהם גורמת ליכולת שונה בעדינות לשמירה על pluripotency ותהליך מפרט גורל.
פיתחנו ומאומתים על כמותיים תא בודד RT-PCR, אשר מספק שיטה פשוטה, אבל חזקה ללימוד ביטוי גנים בתאים בודדים. כדי לאמת את הפרוטוקול שלנו, lysates של תא בודד מטוהר-FACS היה מחולק לשניים ולהחיל שיטה זו לבדיקת דיוקים. התוצאה שלנו עם תאים בודדים אושרה בסך הכל דגימות RNA דילול סדרתי ומצאנו תוצאות עקביות בetween כל מחצית lysate תא (איור 4). עם זאת, עם הפרוטוקול שלנו, יש כמה מגבלות. אנחנו יכולים לזהות ברמת ביטוי של מעל 40 גנים, אבל מידע ספציפי שעתוק (למשל mRNAs שאינו polyadenylated, מירנה, תמלילים לא ידועים, וכו ') עשוי שלא להתגלות. כמו כן, יש כמה הזדמנויות כדי לייעל את פריימרים לגני המטרה. אורך פריימר המקובל הוא בדרך כלל 18-22 זוגות בסיסים. טמפרטורות חישול של פריימרים בדרך כלל עובדות בטווח של 50-60 ° C. תוכן GC של פריימר יכול להיות מושפע מיכולת חישול של פריימר. במאמר זה, ואנחנו פינינו את צעד חישול בqPCR להפחית את השגיאה של חישול פריימר. אנחנו רק הראיתי את גן GAPDH כביקורת, אבל הבית האחר שמירה על הגנים יכול להיות שימושי כביקורת. כרגע אנחנו אופטימיזציה הפרוטוקול שלנו לגישת רצף RNA, אשר יחשוף transcriptome מפורט יותר של תאים בודדים מבודדים בעתיד קרוב. המגבלה השנייה היא ACCUעסיסי של טיהור FACS לבידוד תאים בודדים. FACS מכונה בעיקר מקצה תאים בודדים לתוך כל טוב, אבל אנחנו לא יכולים לשלול את האפשרות שכל אחד גם יכול להכיל יותר מתא אחד, שניתן להבין עם התקדמות טכנית של מערכת טיהור FACS. עם זאת, הפרוטוקול שלנו יכול להיות ישים ישירות לכל מעבדה עם מאמץ מינימאלי ועלות דרך יעילה לאפיון ביטוי יחיד גן התא.
תאים כפי שמוצג באיור 5, Oct4 :: EGFP חיוביים אחת על ידי FACS הממוין לשמור על רמה דומה של ביטוי גני Oct4, אבל Nanog הראה דפוס ביטוי מגוון, אשר עשוי מצביע על מעמדו של pluripotency של hESCs או תהליך תכנות מחדש שונה 1. אפשר פרופיל ביטוי גני pluripotency אחר בתאים בודדים של hESCs באמצעות סמנים פני תא שונים (TRA-1-60, SSEA3, ICAM1, CD44), ו / או מערכת כתב גנטי (Nanog, ריX1, סטלה, ESRRB, וכו ') 5-7. באמצעות פרוטוקול זה, גישת ביטוי גני תא בודדת היא שיטה קלה וחזקה לאוכלוסיות הטרוגניות כגון hESCs או סוגים אחרים של תאי גזע.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנו רוצים להודות לחברים במעבדה לי לדיונים חשובים על כתב היד. עבודה במעבדה לי נתמכה על ידי מענקים מרוברטסון פרס חוקר של קרן לתאי גזע בניו יורק וממרילנד לתאי גזע למחקר קרן (TEDCO).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well PCR Plate | USA scientific | 1402-8900 | |
| Ambion Cell Lysis Kit | Life Technologies | 4458235 | |
| SMARTScribe Reverse Transcriptase | Clonetech | 639536 | |
| ExoSAP-IT | USB | 78200 | |
| Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity | Invitrogen | 11304 | |
| 10 mM dNTP Mix, PCR Grade | Invitrogen | 18427 | |
| SYBR Universal 2X Master Mix | Kapa biosystem | KR0389 | |
| Accutase | Innovative Cell Tech | S-1100-1 | |
| FACS buffer | 45 ml PBS, 5 ml a-MEM, 100 μl DNase, filter sterilized | ||
| 35 μm cell strainer cap tubes | BD Biosciences | 352235 |
References
- Miyanari, Y., Torres-Padilla, M. E. Control of ground-state pluripotency by allelic regulation of Nanog. Nature. 483, 470-473 (2012).
- Leitch, H. G., et al. Embryonic germ cells from mice and rats exhibit properties consistent with a generic pluripotent ground state. Development. 137, 2279-2287 (2010).
- Ramskold, D., et al. Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells. Nat Biotechnol. 30, 777-782 (2012).
- Stewart, M. H., et al. Clonal isolation of hESCs reveals heterogeneity within the pluripotent stem cell compartment. Nat Methods. 3, 807-815 (2006).
- O'Malley, J., et al. High-resolution analysis with novel cell-surface markers identifies routes to iPS cells. Nature. 499, 88-91 (2013).
- Nichols, J., Smith, A. Naive and primed pluripotent states. Cell Stem Cell. 4, 487-492 (2009).
- Kim, H., et al. miR-371-3 expression predicts neural differentiation propensity in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 8, 695-706 (2011).
- Mortazavi, A., Williams, B. A., Mccue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nat Methods. 5, 621-628 (2008).
- Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, J., Blencowe, B. J. Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing. Nat Genet. 40, 1413-1415 (2008).
- Wang, E. T., et al. Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes. Nature. 456, 470-476 (2008).
- Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nat Biotechnol. 29, 731-734 (2011).
- Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Derivation of neural crest cells from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 5, 688-701 (2010).
- Zhu, Y. Y., Machleder, E. M., Chenchik, A., Li, R., Siebert, P. D. Reverse transcriptase template switching: A SMART (TM) approach for full-length cDNA library construction. Biotechniques. 30, 892-897 (2001).
- Pan, X. H., et al. Two methods for full-length RNA sequencing for low quantities of cells and single cells. P Natl Acad Sci USA. 110, 594-599 (2013).
- Tang, F. C., et al. RNA-Seq analysis to capture the transcriptome landscape of a single cell. Nat Protoc. 5, 516-535 (2010).
