Summary
Einzelzell-Genexpression Test wird für das Verständnis der Stammzell Heterogenitäten benötigt.
Abstract
Heterogenität der Stammzellpopulation erschwert detailliertes Verständnis der Stammzellbiologie, wie ihre Neigung zur Differenzierung verschiedener Linien. Eine einzelne Zelle Transkriptom-Test kann ein neuer Ansatz zum Präparieren individuelle Variation sein. Wir haben die Einzelzelle qRT-PCR-Verfahren entwickelt und bestätigt, dass diese Methode funktioniert auch in mehreren Genexpressionsprofilen. In Einzelzellebene, die jeweils mit menschlichen embryonalen Stammzellen, sortiert nach OCT4 :: EGFP-positiven Zellen, hat eine hohe Expression in OCT4, aber eine andere Ebene der NANOG Ausdruck. Unsere Einzelzell Genexpression Test sollte sinnvoll, Heterogenitäten Bevölkerung zu befragen sein.
Introduction
Meisten höheren Eukaryonten sind heterogene Populationen somit Analyse einer gepoolten Population, ist es oft schwierig, ihre zellulären Funktionen interpretiert. Einzelnen Zellen in einer Population kann leicht unterschiedliche sein, und diese Unterschiede können wichtige Konsequenzen für die Eigenschaft und Funktion der gesamten Population 1 und 2 haben. Insbesondere werden humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) bekannt heterogene, die verschiedenen Ebenen der Pluripotenz und vielfältige Potenziale zur Linie Spezifikation in zart unterschiedlichen Wegen 3, 4 verursacht sein. Zum Beispiel können verschiedene Zelloberflächenantigene verwendet, um undifferenzierte pluripotente Stammzellen zu kategorisieren, 5 und der Austin Smith Gruppe vorgeschlagenen verschiedenen Ebenen der Pluripotenz in embryonalen Stammzellen der Maus anhand ihrer Morphologie, Differenzierung Neigung und Abhängigkeit von Signalwegs 6. Dieses Phänomen wurde in menschlichen Embryo Hypothese aufgestellt,nic Stammzellen 7. Während die Gesamt Studien wurden zwischen verschiedenen Stammzelllinien, nicht individuelle Einzel Stammzellen durchgeführt wird, könnte es sehr interessant sein, verschiedene Ebenen der Pluripotenz auf Einzelzellebene, die möglicherweise Auswirkungen auf ihre Differenzierungsmöglichkeiten gegenüber allen somatischen Zelllinien zu analysieren.
Zelluläre und molekulare Heterogenität könnte durch Transkriptionsprofilierung diktiert werden, die aufgerufen wird, die "einzelne Zelle Transkriptom" und betont, neue Ansätze zur Quantifizierung der Genexpression 10.08. Für die Analyse der Genexpression in einzelnen Zellen, wir eine einfache, aber robuste Protokoll von Einzelzell quantitative RT-PCR entwickelt. Wir bestätigten die Wirksamkeit und Durchführbarkeit von unserem Protokoll, indem jeder die Hälfte der Einzel Zelllysaten sowie seriell verdünnt Gesamt-RNAs von HES, was zu minimalen technischen Variationen und Unterschiede. Ferner haben wir eine genetische Linie Reporter homogene p isolierenEVÖLKERUNG von HES mit Gen-Targeting-System. Der Donor-Vektor für die Ausrichtung OCT4 Locus (OCT4-2A-EGFP-PGK-Puro-Konstrukt) und ein Paar von TALEN Plasmide wurden verwendet, 11. Der Spender Vektor und ein Paar TALEN Plasmide wurden in hESCs (H9, WA09) mit unserem Nukleofektion und klonalen Protokoll und Wartung von HES wurde auf der Grundlage unserer Routine-Protokoll 12 durchgeführt wird eingeführt. Wir bestätigten diese genetische Reporter Linie exprimieren EGFP für OCT4 Ausdruck in OCT4 :: EGFP hESCs.
Unser Ergebnis zeigt, dass die einzelnen HES (sortiert nach OCT4 :: EGFP stark positive Zellen) halten hohe OCT4 Ausdruck, aber verschiedene Ebenen der NANOG Ausdruck. Also, sollten Sie unsere Einzelzelle Genexpression Test sinnvoll, Bevölkerung Heterogenitäten von pluripotenten Stammzellen zu studieren.
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Protocol
1. Herstellung einer Platte mit 96 Vertiefungen
- Mischen Sie 1 ul Single Cell DNase1 bis 9 ul Single Cell Lysis Solution.
- Setzen Sie die 10 ul Mischlösung in jede Vertiefung der 96-Well-PCR-Platte.
2. Abnehmen hESCs für die FACS-Reinigung
- Nehmen OCT4 :: EGFP ES-Zelllinie aus der 60-mm-Schale mit 1 ml Accutase für 20 min bei 37 ° C, die mit menschlichen ES-Medien neutralisiert wurden.
- Vorbereitung Zellpopulation in 1 ml FACS-Puffer und Einstellen der Zelle auf 1 x 10 6 Zellen / ml.
- Übergeben Sie die Zellprobe durch eine 35 um Zellsieb Kappe Röhre.
- Lagern Sie das Röhrchen in Eis vor der Zellsortierung.
3. Lyse der FACS-gereinigte Single Cell in jeder Vertiefung der 96-Well-Platte
- Sortieren Sie die Probe für die EGFP-positiven Zellen auf einem Zellsortierer mit einem geschulten Bediener. Setzen Sie die einzelne Zelle in Einzelzell Lysis/DNase1 Lösung in 96-Well-PCR-Platte. Wenn nötig, die 96-Well-Platte mit der Probe in einem -80 ° C Gefrierschrank weniger als einen Monat aufbewahrt werden.
- Inkubiere die Proben 5 min bei RT Zelllyse.
- 1 ul-Stop-Lösung, um die Lyse Reaktion zu stoppen.
- Inkubation 2 min bei RT.
4. Reverse Transkription
- In den jeweils einer 0,5 ul Aliquot von 20 uM SMA-T15, SMA-A.
- In 4 ul 5X-Puffer, 2 ul DTT, 1 ul Reverse Transkriptase und 1 ul dNTP in jede Vertiefung.
- Führen reverse Transkription in einem Thermocycler.
- Stellen Sie die thermische Programm bei 42 ° C × 90 min inaktiviert und Reverse Transkriptase bei 85 ° C × 5 min.
5. Amplification
- In 4 ul ExoSAP-IT-Reagenz zu jedem umkehren transkribiert Probe.
- Proben bei 37 ° C für 15 min und 80 ° C für 15 min, um die ExoSAP IT-Reagenz zu inaktivieren.
- Bereiten PCR-Reaktionsmischung with SMA-p2 (2 nM)
- In 10 ul PCR-Reaktionsmischung zu jedem Reverse Transkription Probe.
- Führen die Verstärkung, bestehend aus 20 Zyklen von Denaturierung (94 ° C für 30 Sekunden), Annealing (57 ° C für 30 Sekunden) und Verlängerung (68 ° C für 10 min).
6. QRT-PCR Leistungs
- In 10 ul 2X SYBR Green PCR Master Mix, 1 ul amplifizierte cDNA, 2 nM Primer und 7 ul Wasser in jede Vertiefung.
- Stellen Sie das Programm, gefolgt von 95 ° C für 3 Sekunden, 60 ° C für 30 sec x 40 Zyklen.
- Führen Sie in zweifacher Ausfertigung für technische Fehler.
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Representative Results
Effiziente und robuste Einzelzelle RNA-Amplifikation
Um die Unterschiede zwischen den Transkriptions hESCs zu minimieren, haben wir OCT4 :: EGFP hES-Klon für FACS Reinigung. Nach dem Sortieren OCT4 :: EGFP positive Zellen in eine 96-Well-Platte wird jede Zelle in Lysepuffer lysiert, und konvertiert die Poly (A) + RNA zu cDNA voller Länge unter Verwendung von SMA-T15 (GACATGTATCCGGATGTTTTTTTTTTTTTTTT) Primer und Verankerung mit SMA-A (ACATGTATCCGGATGTGGG ) unter Verwendung von SMART-Vorlage Schalttechnik. Die überschüssigen Oligonukleotide wurden mit ExoSAP-IT Reagenz verdaut, dann mit 18-20 Zyklen der PCR-Amplifikation von cDNA mit SMA-p2 (GACATGTATCCGGATGT) 13 gefolgt. Wir nutzten die amplifizierte cDNA, um die Vorlage für qRT-PCR (Abbildung 1) zu machen. Es gibt mehrere Studien für Volllängen-RNA-Sequenzierung und Messung von RNA-Variabilität durch die geringe Mengen von Zellen und Einzelzellen 3, 14, 15. Um our Wissen, Gesamt-RNA von HES (Mikrogramm beträgt) verdünnt wir uns an die Nano-und Pico-Gramm-Ebenen und angewandte unser Protokoll technische Variabilität und Erkennung von Differenz auf geringe Mengen an Gesamt-RNA zu beurteilen. Wir bestimmten die Reproduzierbarkeit der Genexpression von RNA verdünnt und einzelne Zellen erzeugt. Analyse der verdünnten RNA zeigt seriell Korrelation zwischen jeder Probe und qRT-PCR-Ergebnisse mit mehreren Einzelzellen zeigen die ähnliche Ct-Werte in GAPDH-Gen (Abbildung 2).
Quantitative Bewertung der einzelnen Zelle Gen-Profile
Um die Konsistenz zwischen verschiedenen Chargen der reversen Transkription Reaktionen bestätigen, teilten wir FACS-gereinigte Einzel Zelllysate in die Hälfte und angewandte unser Protokoll separat auf jeder Hälfte der Lysate für Batch-Vergleiche. Wir sortiert starke EGFP-positiven Zellen unter Verwendung von FACS-Sorter (Bild 3), so OCT4 Expressionsniveau war hoch in EGFPpositiven Zellen, aber NANOG Expressionsniveau ist verschieden. Das Ergebnis zeigt eine signifikante Korrelation zwischen dem Ct-Wert OCT4 jeder Hälfte des Einzel Zelllysaten (Abbildung 4).
Analyse der embryonalen Stammzell Gen-Profile
Wir sortiert einzelnen hESCs und analysiert ihre Genexpressionsebene mit unserem Protokoll, die gleichbleibende OCT4 Ausdruck zeigt, und dann werden wir in hESCs überprüft eine andere Stammzellmarker-Gen NANOG. Als Ergebnis war OCT4 Genexpressionsniveau hoch in jeder einzelnen Zelle, aber NANOG zeigt verschiedene Muster (Abbildung 5).
Abbildung 1. Schematische Darstellung der einzelnen menschlichen embryonalen Stammzellen qRT-PCR nach FACS Reinigung.
Abbildung 2. Real-time RT-PCR von GAPDH mit seriell verdünnt mRNA von gepoolten menschlichen embryonalen Stammzellen. Jeder Punkt zeigt die Ct-Wert seriell verdünnt mRNA und mRNA einzelne Zelle sortiert nach FACS. Gesamt-RNAs wurden von 10 ng / ul auf 0,1 pg / ul verdünnt. Wir wiederholten gleichen Experimente zum Vergleich und machte lineare Handlung.
Abbildung 3. FACS Analyse der Oktober-positiven Zellen. Wir sortiert EGFP-positive Zelle mit Hilfe eines FACS-Sorter. OCT4 :: EGFP Reporter hESC Linie zeigt rund 60% EGFP positive Bevölkerung verglichen mit negativen Bevölkerung (B). Wir haben uns stark EGFP-positiven Zellen (A).
Abbildung 4. Vergleich der Gen-Expressionsniveau in jeder Hälfte des Einzel Zelllysaten. Um die Konsistenz zwischen verschiedenen Chargen von reverse Transkription und Amplifikation Reaktionen bestätigen, teilten wir Einzel Zelllysate in der Hälfte, und der angewandten unserem Protokoll für Batch-Vergleich.
5.60;. Einzelzell-Genexpressionsanalyse durch FACS gereinigt Wärmekartendarstellung von einzelnen menschlichen embryonalen Stammzellen Genexpression zeigt robuste Ausdruck in OCT4, aber unterschiedliche Expressionsniveau in NANOG.
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Discussion
Einzelzell-Gen-Profiling könnte ein wichtiges Instrument, um die Funktionalität einer einzelnen Zelle oder eine ganze Bevölkerung vorherzusagen. Aufgrund technischer Einschränkung, hat ganze Gen-Profiling-Analyse wurde die Bevölkerungsdurchschnittswerte beschränkt. Variationen in Genexpressionsmustern und Ebenen zwischen den einzelnen Zellen und den Subpopulationen wurden vorgeschlagen, um Fehlinterpretationen führen. Solche vielfältigen zellulären Aspekte in hESCs gefunden werden und ihre Heterogenität verursacht leicht unterschiedliche Fähigkeit zur Aufrechterhaltung der Pluripotenz und Schicksal Spezifikationsprozess.
Wir entwickelten und Einzelzell quantitative RT-PCR, die eine einfache, aber robuste Methode zur Untersuchung der Genexpression in einzelnen Zellen ermöglicht validiert. Um unser Protokoll validiert wurde Lysaten von FACS-gereinigte einzelne Zelle in zwei Hälften geteilt und auf diese Methode zur Überprüfung Genauigkeiten. Unser Ergebnis mit einzelnen Zellen wurde mit seriell verdünnt Gesamt-RNA-Proben bestätigt und wir fanden konsistente Ergebnisse bwischen jede Hälfte Zelllysat (Fig. 4). Jedoch mit unserem Protokoll gibt es einige Einschränkungen. Wir konnten Expressionsniveau von über 40 Genen, aber spezifische Transkriptions Informationen (z. B. nicht-polyadenylierten mRNAs, miRNA, unbekannter Transkripte, etc.) erkennen kann nicht nachweisbar sein. Auch gibt es einige Möglichkeiten, die Primer für die Ziel-Gene zu optimieren. Die akzeptierte Primerlänge ist in der Regel 18 bis 22 Basenpaaren. Die Annealing-Temperaturen von Primern in der Regel im Bereich von 50-60 ° C arbeiten Die GC-Gehalt der Primer kann durch das Glühen Fähigkeit des Primers beeinträchtigt werden. In diesem Papier, das Glühschritt in qPCR entfernt wir den Fehler des Primer-Annealing zu reduzieren. Wir zeigten nur das GAPDH-Gen als Kontrolle, aber die andere Housekeeping Gene können nützlich als Kontrolle. Derzeit optimieren wir unsere Protokoll für RNA-Sequenzierung Ansatz, die detailliertere Transkriptom von isolierten Einzelzellen in naher Zukunft enthüllen werden. Die andere Einschränkung ist Akkurassig FACS Reinigung zur Isolierung von Einzelzellen. FACS-Maschine meist ordnet einzelne Zellen in jede Vertiefung, aber wir können die Möglichkeit, dass jeder gut kann mehr als eine Zelle, die mit technischen Fortschritt der FACS-Reinigungssystem abgebildet werden können, enthalten nicht aus. Trotzdem kann unser Protokoll direkt auf jedem Labor mit minimalem Aufwand und kostengünstige Möglichkeit zur Profilierung von Einzelzellen-Gen-Expression.
Wie in Abbildung 5 dargestellt OCT4 :: EGFP positive Einzelzellen durch FACS sortierten halten ähnliches Niveau der OCT4 Genexpression, aber NANOG zeigte diverse Expressionsmuster, die Macht schlägt die unterschiedlichen Status der Pluripotenz von hES-oder Umprogrammierung ein . Man kann andere Pluripotenz Genexpression in Einzelzellen von HES mit verschiedenen Zelloberflächenmarker (TRA-1-60 SSEA3, ICAM1, CD44) und / oder genetische Reportersystem (NANOG, RE ProfilX1, STELLA, ESRRB, etc.) 5-7 . Durch die Verwendung dieses Protokoll, Einzelzelle Genexpression Ansatz einfache und leistungsfähige Methode für heterogene Bevölkerungsgruppen wie hESCs oder andere Arten von Stammzellen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Wir möchten den Mitgliedern des Lee-Labor für wertvolle Diskussionen zum Manuskript danken. Die Arbeit im Labor Lee wurde durch Zuschüsse von Robertson Investigator Award der New York Stem Cell Foundation und von Maryland Stem Cell Research Fund (TEDCO) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well PCR Plate | USA scientific | 1402-8900 | |
| Ambion Cell Lysis Kit | Life Technologies | 4458235 | |
| SMARTScribe Reverse Transcriptase | Clonetech | 639536 | |
| ExoSAP-IT | USB | 78200 | |
| Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity | Invitrogen | 11304 | |
| 10 mM dNTP Mix, PCR Grade | Invitrogen | 18427 | |
| SYBR Universal 2X Master Mix | Kapa biosystem | KR0389 | |
| Accutase | Innovative Cell Tech | S-1100-1 | |
| FACS buffer | 45 ml PBS, 5 ml a-MEM, 100 μl DNase, filter sterilized | ||
| 35 μm cell strainer cap tubes | BD Biosciences | 352235 |
References
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