Summary
Enkele cel genexpressie test is noodzakelijk om inzicht stamcel heterogeniteiten.
Abstract
Heterogeniteit van stamcellen bevolking belemmert gedetailleerd inzicht in stamcel biologie, zoals hun differentiatie neiging tot verschillende geslachten. Een enkele cel transcriptome test kan een nieuwe benadering voor het ontleden van individuele variatie zijn. We hebben de enkele cel qRT-PCR-methode ontwikkeld, en bevestigde dat deze methode werkt goed in verschillende genexpressie profielen. In enkele cel niveau, elke menselijke embryonale stamcellen, gesorteerd per OCT4 :: EGFP positieve cellen, heeft een hoge expressie in OCT4, maar een ander niveau van NANOG expressie. Onze enkele cel genexpressie test moet nuttig zijn om de bevolking heterogeniteit ondervragen zijn.
Introduction
De meeste hogere eukaryote populaties heterogeen derhalve de analyse van gepoolde populatie, is het vaak moeilijk te interpreteren cellulaire functies. Individuele cellen binnen een populatie kan subtiel verschillend zijn, en deze verschillen kunnen belangrijke gevolgen hebben voor het pand en de functie van de gehele bevolking 1, 2. Vooral menselijke embryonale stamcellen (hESCs) bekend heterogene, die verschillende niveaus van pluripotentie en diverse mogelijkheden veroorzaakt geslacht specificatie fijn specifieke wijze 3, 4 zijn. Zo kunnen verschillende celoppervlak antigenen worden gebruikt om gedifferentieerde pluripotente stamcellen categoriseren, 5 en Austin Smith groep voorgesteld verschillende pluripotentie in muis embryonale stamcellen, op basis van hun morfologie, differentiatie neiging en afhankelijkheid van signaalweg 6. Dit fenomeen werd de hypothese in menselijk embryonic stamcellen 7. Overwegende dat de studies werden uitgevoerd tussen de verschillende stamcellijnen, niet individuele enkele stamcellen, kan het zeer intrigerend zijn om verschillende niveaus van pluripotency analyseren op de enkele cel niveau, die mogelijk invloed heeft op hun differentiatie capaciteiten jegens alle somatische cellijnen.
Cellulaire en moleculaire heterogeniteit kan worden gedicteerd door transcriptie profilering, die de 'single cell transcriptome' wordt genoemd en benadrukt nieuwe benaderingen voor de kwantificering van genexpressie niveaus 8-10. Voor de analyse van genexpressie niveaus in individuele cellen ontwikkelden we een eenvoudig maar robuust protocol van eencellige kwantitatieve RT-PCR. We bevestigden de effectiviteit en haalbaarheid van ons protocol door het vergelijken van elke helft van enkele cellysaten evenals serieel verdunde totaal RNA van hESC ', wat resulteert in een minimale technische variaties en verschillen. Verder gebruikten we een genetische reporter lijn homogene p isolerenEVOLKING van hESCs gebruik gene targeting systeem. De donor vector voor targeting OCT4 locus (OCT4-2A-EGFP-PGK-Puro construct) en een paar TALEN plasmiden werden gebruikt 11. De donor vector en een paar TALEN plasmiden werden geïntroduceerd in hESCs (H9, WA09) met behulp van onze nucleofectie en stamselectie protocol en het onderhoud van hESC 'werd uitgevoerd op basis van onze routine protocol 12. We bevestigden deze genetische reporter lijn uiten EGFP voor OCT4 expressie in OCT4 :: EGFP hESCs.
Ons resultaat toont aan dat individuele hESCs (gesorteerd op OCT4 :: EGFP sterk positieve cellen) in het bezit een hoge mate van OCT4 expressie, maar verschillende niveaus van NANOG expressie. Dus moet onze enkele cel genexpressie test nuttig populatie heterogeniteit van pluripotente stamcellen te bestuderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding van een 96-well plaat
- Meng 1 ui van Single Cell DNase1 tot 9 pl Single Cell Lysis Solution.
- Plaats de 10 ul gemengde oplossing in elke well van 96-well PCR plaat.
2. Detaching hESCs voor FACS Zuivering
- Maak OCT4 :: EGFP ES cellijn van 60 mm schaal met 1 ml Accutase gedurende 20 min bij 37 ° C, die werden geneutraliseerd met menselijke ES media.
- Bereid celpopulatie in 1 ml FACS buffer en stel de cel 1 x 10 6 cellen / ml.
- Passeren de cel monster door een 35 um cel zeef cap buis.
- Bewaar de buis in ijs voordat celsorteren.
3. Lysis van FACS-gezuiverde cel in elke well van de 96-well plaat
- Sorteer de steekproef voor EGFP positieve cellen op een cel sorter met een getrainde operator. Zet de cel in Single Cell Lysis/DNase1 oplossing in 96-well PCR-plaat. Indien nodig, de 96-wells plaat met voorbeeld worden opgeslagen in een -80 ° C diepvriezer minder dan een maand.
- Incubeer de monsters 5 minuten bij kamertemperatuur cellysis.
- Voeg 1 ul van Stop Oplossing voor lysis reactie te stoppen.
- Incubeer 2 minuten bij kamertemperatuur.
4. Reverse Transcriptie
- In elk een 0,5 pi aliquot van 20 uM SMA-T15, SMA-A.
- Voeg 4 ui 5X buffer, 2 pl DTT, 1 ui reverse transcriptase en 1 pi dNTP aan elk putje.
- Voeren reverse transcriptie in een PCR-apparaat.
- Stel de thermische programma bij 42 ° C x 90 min. en inactiveren reverse transcriptase bij 85 ° C x 5 minuten.
5. Amplification
- Voeg 4 ul van ExoSAP-IT reagens aan elk reverse getranscribeerd monster.
- Incubeer monsters bij 37 ° C gedurende 15 min en 80 ° C gedurende 15 minuten om de ExoSAP-IT reagens inactiveren.
- Bereid PCR-mix wet SMA-p2 (2 nM)
- Voeg 10 ul PCR reactiemengsel aan elk reverse getranscribeerd monster.
- Voer de versterking, bestaande uit 20 cycli van denaturatie (94 ° C gedurende 30 seconden), annealing (57 ° C gedurende 30 seconden) en verlenging (68 ° C gedurende 10 min).
6. QRT-PCR Prestatie
- Voeg 10 ul van 2X SYBR Green PCR Master Mix, 1 ui cDNA geamplificeerd, 2 nM primers en 7 ui water aan elke well.
- Stel het programma gevolgd door 95 ° C gedurende 3 seconden, 60 ° C gedurende 30 seconden x 40 cycli.
- Voer in tweevoud voor technische fouten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efficiënte en robuuste cel RNA-amplificatie
Om de transcriptie variatie tussen hESCs minimaliseren, gebruikten we OCT4 :: EGFP hESC kloon voor FACS zuivering. Na het sorteren OCT4 :: EGFP-positieve cellen in een 96-well plaat, wordt elke cel gelyseerd in lysis buffer en omgezet poly (A) + RNA van volledige lengte cDNA met SMA-T15 (GACATGTATCCGGATGTTTTTTTTTTTTTTTT) primer en verankering met SMA-A (ACATGTATCCGGATGTGGG ) door SMART template regelende techniek. De overmaat oligonucleotiden werden gedigereerd met ExoSAP IT-reagens, gevolgd door 18-20 cycli van PCR amplificatie van cDNA met SMA-p2 (GACATGTATCCGGATGT) 13. We gebruikten de geamplificeerde cDNA de template voor qRT-PCR (figuur 1) te maken. Er zijn verschillende studies volledige lengte RNA sequentie en meting van RNA variabiliteit met lage hoeveelheden cellen en enkele cellen 3, 14, 15. Our kennis, we verdund totaal RNA van hESCs (microgram bedragen) omlaag naar nano-en pico-gram niveaus en toegepast ons protocol om technische variabiliteit en detectie van verschil beoordelen aan lage hoeveelheden totaal RNA. Wij bepaalden de reproduceerbaarheid in genexpressie niveaus gegenereerd uit verdunde RNA en individuele cellen. Analyse van de verdunde RNA toont serieel correlatie tussen elk monster en qRT-PCR resultaten met verscheidene afzonderlijke cellen vertonen soortgelijke Ct waarden GAPDH gen (Figuur 2).
Kwantitatieve beoordeling van enkele cel genprofielen
Om consistentie tussen verschillende charges van de reverse transcriptie reacties te valideren, verdeelden we FACS-gezuiverd enkele cellysaten in de helft en toegepast ons protocol afzonderlijk aan elke helft van lysaten voor batch-vergelijkingen. We gesorteerd sterke EGFP positieve cellen met behulp van FACS sorter (figuur 3), dus OCT4 expressie niveau was hoog in EGFPpositieve cellen, maar NANOG expressieniveau is divers. Het resultaat toont significante correlatie tussen de OCT4 Ct-waarde van elke helft van cel lysaten (figuur 4).
Analyse van embryonale stamcellen genprofielen
We gesorteerd individuele hESCs en hun genexpressie niveau geanalyseerd met behulp van ons protocol, die consistent niveau van OCT4 expressie toont, en vervolgens gecontroleerd we andere stamcel marker-gen NANOG in hESCs. Hierdoor OCT4 genexpressie was hoog in elke cel, maar NANOG toont verschillende patronen (figuur 5).
Figuur 1. Schematisch overzicht van enkele menselijke embryonale stamcellen qRT-PCR na FACS zuivering.
Figuur 2. Real-time RT-PCR van GAPDH middels serieel verdund mRNA van gepoolde menselijke embryonale stamcellen. Elk punt geeft de Ct-waarde van serieel verdund mRNA en cel mRNA gesorteerd door FACS. Totale RNA's werden verdund van 10 ng / ul tot 0,1 pg / ul. We herhaalden dezelfde experimenten voor vergelijking en maakte lineaire plot.
Figuur 3. FACS analyse van oktober positieve cellen. We naargelang EGFP positieve cel met behulp van een FACS sorter. OCT4 :: EGFP reporter hESC lijn geeft ongeveer 60% EGFP positieve populatie in vergelijking met negatieve bevolking (B). We hebben gekozen voor een sterke EGFP positieve cellen (A).
Figuur 4. Vergelijking van genexpressie niveau op elke helft van cel lysaten. Om consistentie tussen verschillende partijen reverse transcriptie en amplificatie reacties valideren, deelden we enkele cellysaten dubbel en toegepast ons protocol voor batch vergelijking.
Figuur 5.60;. Warmte kaart presentatie van enkele menselijke embryonale stamcellen genexpressie Enkele cel genexpressie analyse gezuiverd door FACS toont robuuste expressie in OCT4, maar verschillend expressieniveau in NANOG.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Enkele cel gen profilering kan een belangrijk instrument om de functionaliteit van een enkele cel of een gehele populatie te voorspellen zijn. Vanwege technische beperking, heeft hele gen profielanalyse beperkt tot gemiddelden bevolking. Variaties in genexpressiepatronen en niveaus tussen individuele cellen en subpopulaties zijn voorgesteld om onjuiste interpretatie veroorzaken. Zulke uiteenlopende cellulaire aspecten zijn te vinden in hESCs en hun heterogeniteit veroorzaakt subtiel verschillende mogelijkheden voor het behoud pluripotency en het lot specificatie proces.
We ontwikkeld en gevalideerd voor enkele cel kwantitatieve RT-PCR, die eenvoudig, maar robuuste methode voorziet genexpressie studie in individuele cellen. Om ons protocol valideren, lysaten van FACS-gezuiverde cel werd verdeeld in de helft en toegepast om deze methode voor het controleren van nauwkeurigheden. Ons resultaat met enkele cellen werd bevestigd met serieel verdund totaal RNA monsters en we vonden consistente resultaten bussen elke helft van cellysaat (figuur 4). Echter, ons protocol er enkele beperkingen. We konden expressie van meer dan 40 genen, maar specifieke transcriptie informatie (bijvoorbeeld niet-gepolyadenyleerde mRNA, miRNA, onbekende transcripties, enz.) op te sporen mag niet aantoonbaar zijn. Ook zijn er een aantal mogelijkheden om de primers voor doelgenen optimaliseren. De aanvaarde primerlengte gewoonlijk 18-22 basenparen. De annealing temperaturen primers algemeen werken in het traject van 50-60 ° C. De inhoud GC primer kan worden beïnvloed door de hechtende vermogen van de primer. In dit artikel hebben we verwijderd van de annealing stap in qPCR om de fout van primerannealing verminderen. We toonden slechts de GAPDH gen als controle, maar het andere huis keeping genen kan nuttig zijn als een controle. Momenteel zijn we het optimaliseren van ons protocol voor RNA sequencing aanpak, die meer gedetailleerde transcriptome van enkele, geïsoleerde cellen in de nabije toekomst zal onthullen. De andere beperking is accuracy van FACS zuivering voor het isoleren van enkele cellen. FACS machine wijst meestal enkele cellen in elk putje, maar we kunnen de mogelijkheid dat elk putje meer dan een cel, die kan worden bedacht met de technische vooruitgang van FACS zuiveringssysteem kan bevatten niet uitsluiten. Toch kan ons protocol rechtstreeks toepasbaar op elk lab met minimale inspanningen en kosten effectieve manier voor het profileren van enkele cel genexpressie.
Zoals getoond in figuur 5, OCT4 :: EGFP positieve enkelvoudige cellen door FACS gesorteerde handhaven gelijk niveau OCT4 genexpressie, maar NANOG bleek divers expressiepatroon, wat zich suggereert de andere status van pluripotentie van hESCs of herprogrammeringsproces 1 . Men kan andere pluripotentie genexpressieprofiel in enkele cellen van hESCs met verschillende celoppervlak markers (TRA-1-60 SSEA3, ICAM1, CD44), en / of genetische reporter systeem (NANOG, REX1, STELLA, ESRRB, etc.) 5-7 . Door dit protocol enkele cel genexpressie aanpak gemakkelijke en krachtige werkwijze voor heterogene populaties zoals hESCs of andere typen stamcellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij willen de leden van de Lee lab bedanken voor waardevolle discussies over het manuscript. Werk in de Lee lab werd ondersteund door subsidies van Robertson Investigator Award van New York Stem Cell Foundation en uit Maryland Stem Cell Research Fund (TEDCO).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well PCR Plate | USA scientific | 1402-8900 | |
| Ambion Cell Lysis Kit | Life Technologies | 4458235 | |
| SMARTScribe Reverse Transcriptase | Clonetech | 639536 | |
| ExoSAP-IT | USB | 78200 | |
| Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity | Invitrogen | 11304 | |
| 10 mM dNTP Mix, PCR Grade | Invitrogen | 18427 | |
| SYBR Universal 2X Master Mix | Kapa biosystem | KR0389 | |
| Accutase | Innovative Cell Tech | S-1100-1 | |
| FACS buffer | 45 ml PBS, 5 ml a-MEM, 100 μl DNase, filter sterilized | ||
| 35 μm cell strainer cap tubes | BD Biosciences | 352235 |
References
- Miyanari, Y., Torres-Padilla, M. E. Control of ground-state pluripotency by allelic regulation of Nanog. Nature. 483, 470-473 (2012).
- Leitch, H. G., et al. Embryonic germ cells from mice and rats exhibit properties consistent with a generic pluripotent ground state. Development. 137, 2279-2287 (2010).
- Ramskold, D., et al. Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells. Nat Biotechnol. 30, 777-782 (2012).
- Stewart, M. H., et al. Clonal isolation of hESCs reveals heterogeneity within the pluripotent stem cell compartment. Nat Methods. 3, 807-815 (2006).
- O'Malley, J., et al. High-resolution analysis with novel cell-surface markers identifies routes to iPS cells. Nature. 499, 88-91 (2013).
- Nichols, J., Smith, A. Naive and primed pluripotent states. Cell Stem Cell. 4, 487-492 (2009).
- Kim, H., et al. miR-371-3 expression predicts neural differentiation propensity in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 8, 695-706 (2011).
- Mortazavi, A., Williams, B. A., Mccue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nat Methods. 5, 621-628 (2008).
- Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, J., Blencowe, B. J. Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing. Nat Genet. 40, 1413-1415 (2008).
- Wang, E. T., et al. Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes. Nature. 456, 470-476 (2008).
- Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nat Biotechnol. 29, 731-734 (2011).
- Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Derivation of neural crest cells from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 5, 688-701 (2010).
- Zhu, Y. Y., Machleder, E. M., Chenchik, A., Li, R., Siebert, P. D. Reverse transcriptase template switching: A SMART (TM) approach for full-length cDNA library construction. Biotechniques. 30, 892-897 (2001).
- Pan, X. H., et al. Two methods for full-length RNA sequencing for low quantities of cells and single cells. P Natl Acad Sci USA. 110, 594-599 (2013).
- Tang, F. C., et al. RNA-Seq analysis to capture the transcriptome landscape of a single cell. Nat Protoc. 5, 516-535 (2010).
