Summary
सिंगल सेल जीन अभिव्यक्ति परख स्टेम सेल विषमताओं को समझने के लिए आवश्यक है.
Abstract
स्टेम सेल जनसंख्या की विविधता ऐसी विभिन्न प्रजातियों की ओर उनके भेदभाव प्रवृत्ति के रूप में, स्टेम कोशिका जीव विज्ञान के विस्तृत समझ बाधित. एक एकल कक्ष transcriptome परख व्यक्तिगत परिवर्तन विदारक के लिए एक नया दृष्टिकोण हो सकता है. हम एकल कक्ष QRT-पीसीआर विधि विकसित की है, और इस विधि कई जीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल में अच्छी तरह से काम करता है कि इस बात की पुष्टि की है. एकल कोशिका के स्तर में, Oct4 के अनुसार क्रमबद्ध प्रत्येक मानव भ्रूण स्टेम सेल, :: EGFP सकारात्मक कोशिकाओं, Oct4 में उच्च अभिव्यक्ति, लेकिन Nanog अभिव्यक्ति का एक अलग स्तर पर है. हमारे एकल कोशिका जीन अभिव्यक्ति परख आबादी विषमताओं पूछताछ के लिए उपयोगी होना चाहिए.
Introduction
अधिकांश उच्च यूकेरियोट आबादी जमा आबादी के विश्लेषण के साथ इस प्रकार विषम रहे हैं, यह उनके सेलुलर सुविधाओं की व्याख्या करने के लिए अक्सर मुश्किल होता है. आबादी के भीतर व्यक्ति की कोशिकाओं आसानी से अलग किया जा सकता है, और इन मतभेदों को पूरी आबादी 1, 2 की संपत्ति और समारोह के लिए महत्वपूर्ण परिणाम हो सकते हैं. विशेष रूप से, मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (hESCs) नाजुक विशिष्ट तरीके 3, 4 में वंश विनिर्देश के pluripotency के विभिन्न स्तरों और विविध क्षमता का कारण बनता है, जो विषम हो जाना जाता है. उदाहरण के लिए, विभिन्न कोशिका की सतह एंटीजन undifferentiated pluripotent स्टेम कोशिकाओं को वर्गीकृत करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, 5 और ऑस्टिन स्मिथ समूह उनकी आकृति विज्ञान, भेदभाव प्रवृत्ति और मार्ग 6 सिगनल की निर्भरता पर आधारित, माउस भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं में pluripotency के विभिन्न स्तरों का प्रस्ताव रखा. यह घटना मानव भ्रूण में धारणा थीएनआईसी स्टेम कोशिकाओं 7. समग्र पढ़ाई अलग स्टेम सेल लाइनों, न कि व्यक्तिगत एकल स्टेम कोशिकाओं के बीच प्रदर्शन किया गया है, जबकि यह संभवतः सभी दैहिक सेल प्रजातियों की ओर उनके भेदभाव क्षमता को प्रभावित करता है जो एकल कोशिका के स्तर पर pluripotency के विभिन्न स्तरों का विश्लेषण करने के लिए बहुत पेचीदा हो सकता है.
सेलुलर और आणविक विविधता 'एकल कक्ष transcriptome' कहा जाता है, जो प्रतिलेखन रूपरेखा तय करती है और जीन अभिव्यक्ति के स्तर 8-10 बढ़ाता के लिए नए तरीकों पर जोर दिया जा सकता है. व्यक्ति की कोशिकाओं में जीन की अभिव्यक्ति के स्तर के विश्लेषण के लिए, हम एकल कक्ष मात्रात्मक RT-पीसीआर की एक सरल, लेकिन मजबूत प्रोटोकॉल विकसित की है. हम कम से कम तकनीकी विविधताओं और मतभेद में जिसके परिणामस्वरूप, प्रत्येक एकल कक्ष lysates के आधे के साथ ही hESCs के क्रमानुसार पतला कुल RNAs तुलना करके हमारे प्रोटोकॉल की प्रभावकारिता और व्यवहार्यता की पुष्टि की. इसके अलावा, हम समरूप पी अलग करने के लिए एक आनुवंशिक संवाददाता लाइन का इस्तेमाल कियाजीन लक्ष्यीकरण प्रणाली का उपयोग hESCs के opulation. Oct4 ठिकाना (Oct4-2A-EGFP-PGK-Puro निर्माण) और talen plasmids के एक जोड़ी को निशाना बनाने के लिए दाता वेक्टर 11 इस्तेमाल किया गया. दाता वेक्टर और talen plasmids के एक जोड़ी हमारे nucleofection और प्रतिरूप चयन प्रोटोकॉल और hESCs हमारी दिनचर्या प्रोटोकॉल 12 के आधार पर प्रदर्शन किया गया था के रखरखाव का उपयोग hESCs (H9, WA09) में शुरू किए गए थे. हम इस आनुवंशिक संवाददाता लाइन Oct4 में oct4 अभिव्यक्ति के लिए EGFP व्यक्त :: EGFP hESCs की पुष्टि की.
हमारे परिणाम (Oct4 के अनुसार क्रमबद्ध :: EGFP दृढ़ता से सकारात्मक कोशिकाओं) व्यक्तिगत hESCs Oct4 अभिव्यक्ति के उच्च स्तर पर है, लेकिन Nanog अभिव्यक्ति के विभिन्न स्तरों कि पकड़ को दर्शाता है. तो, हमारी एकल कोशिका जीन अभिव्यक्ति परख pluripotent स्टेम सेल की आबादी विषमताओं के अध्ययन करने के लिए उपयोगी होना चाहिए.
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Protocol
एक 96 अच्छी तरह से थाली के 1. तैयारी
- 9 μl सिंगल सेल lysis समाधान एकल कक्ष DNase1 की 1 μl मिलाएं.
- 96 अच्छी तरह से पीसीआर प्लेट की हर अच्छी तरह से में 10 μl मिश्रित समाधान रखो.
FACS शोधन के लिए 2. Detaching hESCs
- मानव ES मीडिया के साथ निष्प्रभावी थे जो 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 1 मिलीलीटर Accutase साथ 60 मिमी पकवान, से Oct4 :: EGFP ES सेल लाइन को अलग करें.
- FACS बफर 1 मिलीलीटर में सेल की आबादी को तैयार है और 1 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल सेल समायोजित करें.
- एक 35 माइक्रोन सेल झरनी टोपी ट्यूब के माध्यम से सेल नमूना गुजरती हैं.
- सेल छँटाई से पहले बर्फ में ट्यूब की दुकान.
96 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुएं में FACS शुद्ध एकल कोशिका के 3. Lysis
- एक प्रशिक्षित ऑपरेटर के साथ एक सेल सॉर्टर पर EGFP सकारात्मक कोशिकाओं के लिए नमूना तरह. 96 अच्छी तरह से पीसीआर थाली में एकल कक्ष Lysis/DNase1 समाधान में एकल कक्ष रखो. यदि आवश्यक हो, 9नमूने के साथ 6 अच्छी तरह से थाली में एक महीने से भी कम समय में एक -80 डिग्री सेल्सियस डीप फ्रीजर में संग्रहीत किया जा सकता है.
- सेल के लिए आरटी पर नमूने 5 मिनट सेते हैं.
- सेल प्रतिक्रिया को रोकने के लिए बंद करो समाधान के 1 μl जोड़ें.
- आरटी पर 2 मिनट सेते हैं.
4. रिवर्स प्रतिलेखन
- 20 माइक्रोन SMA-T15, SMA-A के प्रत्येक एक 0.5 μl विभाज्य जोड़ें.
- अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए 4 μl 5X बफर, 2 μl डीटीटी, 1 μl रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस, और 1 μl dNTP जोड़ें.
- एक थर्मल cycler में रिवर्स प्रतिलेखन प्रदर्शन करना.
- 90 मिनट × 42 डिग्री सेल्सियस पर थर्मल प्रोग्राम सेट और 85 डिग्री सेल्सियस × 5 मिनट में रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस निष्क्रिय.
5. प्रवर्धन
- प्रत्येक रिवर्स लिखित नमूने के ExoSAP आईटी अभिकर्मक के 4 μl जोड़ें.
- ExoSAP आईटी अभिकर्मक निष्क्रिय करने के लिए 15 मिनट के लिए 15 मिनट और 80 डिग्री सेल्सियस के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर नमूने सेते हैं.
- पीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण डब्ल्यू तैयार करेंith SMA-P2 (2 एनएम)
- प्रत्येक रिवर्स लिखित नमूना के लिए पीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण के 10 μl जोड़ें.
- विकृतीकरण के 20 चक्र (30 सेकंड के लिए 94 डिग्री सेल्सियस), annealing (30 सेकंड के लिए 57 डिग्री सेल्सियस), और एक्सटेंशन (68 डिग्री सेल्सियस 10 मिनट के लिए) से मिलकर, प्रवर्धन प्रदर्शन करना.
6. QRT-पीसीआर प्रदर्शन
- अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए 2X SYBR ग्रीन पीसीआर मास्टर मिक्स, 1 μl परिलक्षित सीडीएनए, 2 एनएम प्राइमरों, और 7 μl पानी के 10 μl जोड़ें.
- 3 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के द्वारा पीछा प्रोग्राम सेट, 30 सेकंड एक्स 40 चक्र के लिए 60 डिग्री सेल्सियस.
- तकनीकी त्रुटियों के लिए दो प्रतियों में प्रदर्शन करते हैं.
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Representative Results
कुशल और मजबूत एकल कक्ष आरएनए प्रवर्धन
HESCs के बीच transcriptional भिन्नता को कम करने के लिए, हम Oct4 इस्तेमाल किया :: FACS शुद्धि के लिए EGFP hESC क्लोन. एक 96 अच्छी तरह से थाली में oct4 :: EGFP सकारात्मक कोशिकाओं छंटाई के बाद, प्रत्येक सेल बफर में lysed है और SMA-T15 (GACATGTATCCGGATGTTTTTTTTTTTTTTTT) प्राइमर का उपयोग और SMA-A (ACATGTATCCGGATGTGGG के साथ एंकरिंग पूरी लंबाई सीडीएनए के लिए पाली (ए) + आरएनए परिवर्तित ) स्मार्ट टेम्पलेट स्विचिंग प्रौद्योगिकी का उपयोग करके. अतिरिक्त oligonucleotides तो SMA-P2 (GACATGTATCCGGATGT) 13 के साथ सीडीएनए का पीसीआर प्रवर्धन की 18-20 चक्रों के बाद, ExoSAP आईटी अभिकर्मक के साथ पचा गया. हम QRT-पीसीआर के लिए टेम्पलेट (चित्रा 1) बनाने के लिए प्रवर्धित सीडीएनए इस्तेमाल किया. कोशिकाओं का कम मात्रा में और एकल कक्षों 3, 14, 15 का उपयोग करके पूरी लंबाई की शाही सेना अनुक्रमण और आरएनए परिवर्तनशीलता की माप के लिए कई अध्ययन कर रहे हैं. ओउर ज्ञान, हम नैनो और पिको ग्राम स्तर तक नीचे hESCs के कुल शाही सेना (माइक्रोग्राम मात्रा में) पतला और कुल शाही सेना के कम मात्रा पर फर्क की तकनीकी परिवर्तनशीलता और पहचान का आकलन करने के लिए हमारे प्रोटोकॉल लागू होता है. हम पतला शाही सेना और व्यक्ति की कोशिकाओं से उत्पन्न जीन अभिव्यक्ति के स्तर में reproducibility निर्धारित की. पतला शाही सेना के विश्लेषण क्रमानुसार प्रत्येक नमूने के बीच संबंध को दर्शाता है और कई एकल कक्षों के साथ QRT-पीसीआर परिणाम GAPDH जीन में इसी तरह की सीटी मूल्यों (चित्रा 2) दिखा.
एकल कक्ष जीन प्रोफाइल की मात्रात्मक निर्धारण
रिवर्स प्रतिलेखन प्रतिक्रियाओं के विभिन्न बैचों के बीच स्थिरता को मान्य करने के लिए, हम आधे में FACS शुद्ध एकल कक्ष lysates विभाजित और बैच की तुलना के लिए lysates के प्रत्येक आधा करने के लिए अलग से हमारे प्रोटोकॉल लागू होता है. हम FACS सॉर्टर (चित्रा 3) का उपयोग करके मजबूत EGFP सकारात्मक कोशिकाओं को हल है, तो Oct4 अभिव्यक्ति स्तर EGFP में उच्च थासकारात्मक कोशिकाओं, लेकिन Nanog अभिव्यक्ति के स्तर विभिन्न है. परिणाम एकल कक्ष lysates के प्रत्येक आधे (चित्रा 4) के Oct4 सीटी मूल्य के बीच महत्वपूर्ण संबंध को दर्शाता है.
भ्रूण स्टेम सेल जीन प्रोफाइल का विश्लेषण
हम व्यक्तिगत hESCs और हल Oct4 अभिव्यक्ति की संगत स्तर से पता चलता है जो हमारे प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए उनके जीन अभिव्यक्ति के स्तर का विश्लेषण किया है, और फिर हम hESCs में एक और स्टेम सेल मार्कर जीन Nanog जाँच की. नतीजतन, Oct4 जीन अभिव्यक्ति के स्तर हर एक सेल में उच्च था, लेकिन Nanog अलग पैटर्न (चित्रा 5) से पता चलता है.
चित्रा 1. FACS शुद्धि के बाद भी मानव भ्रूण स्टेम सेल QRT-पीसीआर के योजनाबद्ध सिंहावलोकन.
चित्रा 2. जमा मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के क्रमानुसार पतला mRNA का उपयोग GAPDH की वास्तविक समय RT-पीसीआर. प्रत्येक डॉट क्रमानुसार पतला mRNA की सीटी मूल्य और FACS द्वारा क्रमबद्ध एकल कक्ष mRNA से पता चलता है. कुल RNAs 10 एनजी / उल से 0.1 पीजी / उल को पतला कर रहे थे. हम तुलना और बनाया रैखिक साजिश के लिए एक ही प्रयोगों दोहराया.
चित्रा 3. अक्टूबर सकारात्मक कोशिकाओं के FACS विश्लेषण. हम एक FACS सॉर्टर का उपयोग करके EGFP सकारात्मक सेल क्रमबद्ध. Oct4 :: EGFP संवाददाता hESC लाइन नकारात्मक जनसंख्या (बी) के साथ तुलना में 60% के आसपास EGFP सकारात्मक आबादी से पता चलता है. हम मजबूत EGFP सकारात्मक कोशिकाओं (ए) का चयन किया.
एकल कक्ष lysates के प्रत्येक छमाही में जीन अभिव्यक्ति के स्तर का आंकड़ा 4. तुलना करें. रिवर्स प्रतिलेखन और प्रवर्धन प्रतिक्रियाओं के विभिन्न बैचों के बीच स्थिरता को मान्य करने के लिए, हम छमाही में एकल कक्ष lysates विभाजित, और बैच तुलना के लिए हमारे प्रोटोकॉल लागू होता है.
चित्रा 5.60;. FACS द्वारा शुद्ध एकल मानव भ्रूण स्टेम सेल जीन अभिव्यक्ति की गर्मी नक्शा प्रस्तुति एकल कोशिका जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण Oct4 में मजबूत अभिव्यक्ति से पता चलता है, लेकिन Nanog में अलग अभिव्यक्ति के स्तर.
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Discussion
सिंगल सेल जीन रूपरेखा एक एकल कक्ष की कार्यक्षमता या एक पूरी आबादी की भविष्यवाणी करने के लिए एक प्रमुख साधन हो सकता है. कारण तकनीकी सीमा तक, पूरे जीन रूपरेखा विश्लेषण आबादी के औसत के लिए प्रतिबंधित कर दिया गया है. जीन अभिव्यक्ति पैटर्न और व्यक्ति की कोशिकाओं और subpopulations के बीच के स्तर में बदलाव गलत व्याख्या पैदा करने के लिए प्रस्तावित किया गया है. इस तरह के विभिन्न सेलुलर पहलुओं hESCs में पाया जा सकता है और उनकी विविधता pluripotency और भाग्य विनिर्देश प्रक्रिया को बनाए रखने के लिए आसानी से अलग क्षमता का कारण बनता है.
हम विकसित और व्यक्ति की कोशिकाओं में जीन की अभिव्यक्ति के अध्ययन के लिए आसान है, लेकिन मजबूत तरीका प्रदान करता है जो एकल कक्ष मात्रात्मक RT-पीसीआर, के लिए मान्य. हमारे प्रोटोकॉल मान्य करने के लिए, FACS शुद्ध एकल कक्ष की lysates आधे में विभाजित है और accuracies की जाँच के लिए इस पद्धति को लागू किया गया था. एकल कक्षों के साथ हमारे परिणाम क्रमानुसार पतला कुल शाही सेना के नमूनों के साथ की पुष्टि की गई थी और हम अनुरूप परिणाम ख पायाetween सेल lysate के प्रत्येक आधे (चित्रा 4). हालांकि, हमारे प्रोटोकॉल के साथ, कुछ सीमाएं हैं. पता लगाने योग्य नहीं हो सकता है हम 40 से अधिक जीन की अभिव्यक्ति के स्तर, लेकिन विशिष्ट प्रतिलेखन जानकारी (जैसे गैर polyadenylated mRNAs, miRNA, अज्ञात टेप, आदि) का पता लगा सकता है. इसके अलावा, लक्ष्य जीन के लिए प्राइमरों अनुकूलन करने के लिए कुछ अवसर हैं. स्वीकार किए जाते हैं प्राइमर लंबाई आमतौर पर 18-22 आधार जोड़े है. प्राइमरों की annealing तापमान आम तौर पर 50-60 डिग्री सेल्सियस की रेंज में काम प्राइमर की जीसी सामग्री प्राइमर की annealing क्षमता से प्रभावित किया जा सकता है. इस पत्र में, हम प्राइमर annealing की त्रुटि को कम करने के लिए qPCR में annealing कदम हटाया. हम केवल एक नियंत्रण के रूप में GAPDH जीन से पता चला है, लेकिन जीन रखते हुए अन्य घर एक नियंत्रण के रूप में उपयोगी हो सकता है. वर्तमान में हम निकट भविष्य में अलग एकल कक्षों के अधिक विस्तृत transcriptome को उजागर करेंगे, जो शाही सेना अनुक्रमण दृष्टिकोण के लिए हमारे प्रोटोकॉल अनुकूलन कर रहे हैं. अन्य सीमा ACCU हैएकल कोशिकाओं को अलग करने के लिए FACS शुद्धि के कास. FACS मशीन ज्यादातर प्रत्येक कुएं में एकल कक्षों का आवंटन, लेकिन हम एक अच्छी तरह से FACS शोधन प्रणाली की तकनीकी अग्रिम के साथ सोचा जा सकता है, जो एक से अधिक सेल, हो सकती है संभावना को अलग नहीं कर सकते हैं. फिर भी, हमारे प्रोटोकॉल न्यूनतम प्रयासों के साथ किसी भी प्रयोगशाला को सीधे लागू होना और एकल कोशिका जीन अभिव्यक्ति की रूपरेखा के लिए प्रभावी तरीके से खर्च कर सकते हैं.
सॉर्ट किया गया FACS द्वारा चित्रा 5, Oct4 :: में दिखाया गया है EGFP सकारात्मक एकल कक्षों Oct4 जीन अभिव्यक्ति के समान स्तर को बनाए रखने, लेकिन Nanog पराक्रम hESCs या reprogramming प्रक्रिया की pluripotency की अलग स्थिति से पता चलता है जो विविध अभिव्यक्ति पैटर्न से पता चला है 1 . एक अलग सेल सतह मार्कर (टीआरए-1-60, SSEA3, ICAM1, CD44), और / या आनुवंशिक संवाददाता प्रणाली (Nanog, रे का उपयोग hESCs के एकल कक्षों में अन्य pluripotency जीन अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल कर सकते हैंX1, स्टैला, ESRRB, आदि) 5-7 . इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर, एकल कोशिका जीन अभिव्यक्ति दृष्टिकोण ऐसे hESCs या स्टेम कोशिकाओं के अन्य प्रकार के रूप में विषम आबादी के लिए आसान और शक्तिशाली तरीका है.
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
हम पांडुलिपि पर बहुमूल्य विचार विमर्श के लिए ली प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद देना चाहूंगा. ली प्रयोगशाला में काम सेल रिसर्च फंड (TEDCO) स्टेम न्यूयॉर्क स्टेम सेल फाउंडेशन की रॉबर्टसन अन्वेषक पुरस्कार से और मेरीलैंड से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well PCR Plate | USA scientific | 1402-8900 | |
| Ambion Cell Lysis Kit | Life Technologies | 4458235 | |
| SMARTScribe Reverse Transcriptase | Clonetech | 639536 | |
| ExoSAP-IT | USB | 78200 | |
| Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity | Invitrogen | 11304 | |
| 10 mM dNTP Mix, PCR Grade | Invitrogen | 18427 | |
| SYBR Universal 2X Master Mix | Kapa biosystem | KR0389 | |
| Accutase | Innovative Cell Tech | S-1100-1 | |
| FACS buffer | 45 ml PBS, 5 ml a-MEM, 100 μl DNase, filter sterilized | ||
| 35 μm cell strainer cap tubes | BD Biosciences | 352235 |
References
- Miyanari, Y., Torres-Padilla, M. E. Control of ground-state pluripotency by allelic regulation of Nanog. Nature. 483, 470-473 (2012).
- Leitch, H. G., et al. Embryonic germ cells from mice and rats exhibit properties consistent with a generic pluripotent ground state. Development. 137, 2279-2287 (2010).
- Ramskold, D., et al. Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells. Nat Biotechnol. 30, 777-782 (2012).
- Stewart, M. H., et al. Clonal isolation of hESCs reveals heterogeneity within the pluripotent stem cell compartment. Nat Methods. 3, 807-815 (2006).
- O'Malley, J., et al. High-resolution analysis with novel cell-surface markers identifies routes to iPS cells. Nature. 499, 88-91 (2013).
- Nichols, J., Smith, A. Naive and primed pluripotent states. Cell Stem Cell. 4, 487-492 (2009).
- Kim, H., et al. miR-371-3 expression predicts neural differentiation propensity in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 8, 695-706 (2011).
- Mortazavi, A., Williams, B. A., Mccue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nat Methods. 5, 621-628 (2008).
- Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, J., Blencowe, B. J. Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing. Nat Genet. 40, 1413-1415 (2008).
- Wang, E. T., et al. Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes. Nature. 456, 470-476 (2008).
- Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nat Biotechnol. 29, 731-734 (2011).
- Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Derivation of neural crest cells from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 5, 688-701 (2010).
- Zhu, Y. Y., Machleder, E. M., Chenchik, A., Li, R., Siebert, P. D. Reverse transcriptase template switching: A SMART (TM) approach for full-length cDNA library construction. Biotechniques. 30, 892-897 (2001).
- Pan, X. H., et al. Two methods for full-length RNA sequencing for low quantities of cells and single cells. P Natl Acad Sci USA. 110, 594-599 (2013).
- Tang, F. C., et al. RNA-Seq analysis to capture the transcriptome landscape of a single cell. Nat Protoc. 5, 516-535 (2010).
