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Biology

정량적 RT-PCR에 의해 개별 인간 배아 줄기 세포를 프로파일 링

Published: May 29, 2014 doi: 10.3791/51408

Summary

단일 세포 유전자 발현 분석은 줄기 세포 이질성을 이해하는데 필요하다.

Abstract

줄기 세포 인구의 이질성은 다른 계통쪽으로 분화 성향으로, 줄기 세포 생물학에 대한 자세한 이해를 방해한다. 단일 세포 사체 분석은 개인차를 해부하기위한 새로운 접근 방식이 될 수 있습니다. 우리는 하나의 셀 QRT-PCR 방법을 개발하고,이 방법은 여러 유전자 발현 프로파일에서 잘 작동하는지 확인했다. 단일 세포 수준에서 OCT4으로 분류되어 각각의 인간 배아 줄기 세포, :: EGFP 양성 세포는 OCT4 높은 표현하지만, NANOG 표현의 다른 수준이 있습니다. 우리의 단일 세포 유전자 발현 분석은 인구의 이질성을 심문하는 것이 유용 할 것이다.

Introduction

가장 높은 진핵 생물의 인구가 풀링 인구의 분석에 따라서 이기종 있으며, 그것은 자신의 휴대 전화 기능을 해석하는 것이 어렵습니다. 인구 내의 개별 세포가 미묘하게 다를 수 있습니다, 그리고 이러한 차이는 전체 인구의 1, 2의 속성과 기능에 중요한 영향을 미칠 수 있습니다. 특히, 인간 배아 줄기 세포 (hESCs)는 섬세 독특한 방법으로 3, 4의 혈통 사양을 능성의 서로 다른 수준의 다양한 잠재력을 일으키는 이기종 것으로 알려져있다. 예를 들어, 다른 세포 표면 항원이 미분화 다 능성 줄기 세포를 분류하기 위해 사용될 수있다, (5) 및 오스틴 스미스 그룹은 그들의 형태, 감별 성향 및 통로 6 시그널링 종속성에 기초하여, 마우스 배아 줄기 세포의 다 능성의 상이한 레벨을 제안 하였다. 이러한 현상은 인간의 배아에 가설 된NIC 줄기 세포 12. 전체적인 연구는 다른 줄기 세포가 아닌 개별 단일 줄기 세포 사이에 수행 된 반면, 잠재적으로 모든 체세포 계통쪽으로 분화 능력에 영향을 단일 세포 수준에서 다 능성의 상이한 레벨을 분석하는 것은 매우 흥미로운 일 수 있었다.

세포 및 분자 이질성은 '단일 세포의 사체'라고하는 전사 프로파일에 의해 결정 및 유전자 발현 수준 8-10 정량화에 대한 새로운 접근 방식을 강조 할 수있다. 각각의 세포에서 유전자 발현 수준의 분석을 위해, 우리는 하나의 셀 정량적 RT-PCR의 간단하지만 강력한 프로토콜을 개발했다. 우리는 최소한의 기술적 변화와 차이의 결과로, 각각의 단일 세포 용 해물의 절반뿐만 아니라 인간 배아 줄기 세포의 희석 한 총 RNA를 비교하여 우리의 프로토콜의 효과와 가능성을 확인했다. 또한, 우리는 동질적인 (P)를 분리하는 유전자 기자 라인을 사용유전자 타겟팅 시스템을 이용하여 인간 배아 줄기 세포의 opulation. OCT4 궤적 (OCT4-2A-EGFP-PGK - 푸로가 구성) 및 TALEN 플라스미드의 한 쌍을 대상으로 대한 기증자 벡터 (11)를 사용 하였다. 기증자 벡터와 TALEN 플라스미드 한 쌍의 우리의 nucleofection 및 클론 선택 프로토콜과 인간 배아 줄기 세포는 우리의 일상적인 프로토콜 12을 기준으로 수행 된 유지 보수를 이용하여 인간 배아 줄기 세포 (H9, WA09)에 소개되었다. 우리는이 유전자 기자 라인 OCT4에 OCT4의 표현 EGFP을 표현 :: EGFP 인간 배아 줄기 세포를 확인했다.

우리의 결과는 (OCT4으로 분류 :: EGFP 강하게 양성 세포) 각각의 인간 배아 줄기 세포는 OCT4 표현의 높은 수준,하지만, NANOG 식의 다른 수준을 유지 것을 보여줍니다. 따라서, 우리의 단일 세포 유전자 발현 분석은 다 능성 줄기 세포의 인구 이질성을 연구하는 것이 유용 할 것이다.

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Protocol

96 - 웰 플레이트의 1. 준비

  1. 9 μL 하나의 세포 용해 용액에 하나의 세포 DNase1 1 μl를 섞는다.
  2. 96 - 웰 PCR 플레이트의 각 웰에 10 ㎕를 혼합 용액을 넣어.

FACS 정화 2. 분리 및 인간 배아 줄기 세포

  1. 인간 ES 매체와 중화 된 37 ° C에서 20 분간 1 ㎖ Accutase와 60mm 접시,에서 OCT4 :: EGFP ES 세포주를 분리합니다.
  2. FACS는 버퍼 1 ML에 세포 인구를 준비하고 1 X 10 6 세포 / ml로 셀을 조정합니다.
  3. 35 μm의 셀 스트레이너 캡 튜브를 통해 세포 샘플을 전달합니다.
  4. 셀 정렬하기 전에 얼음에 튜브를 저장합니다.

96 - 웰 플레이트의 각 웰에 FACS 정제 된 단일 셀의 3. 용해

  1. 숙련 된 운전자와 셀 분류기에 EGFP 양성 세포의 샘플을 정렬합니다. 96 - 웰 PCR 플레이트에 하나의 세포 Lysis/DNase1 솔루션으로 단일 셀을 넣습니다. 필요한 경우, 구샘플 6 - 웰 플레이트 한 달 미만 -80 ° C 냉동고에 저장 될 수 있습니다.
  2. 세포 용해 실온에서 시료에게 5 분을 품어.
  3. 용해 반응을 중지하려면 중지 솔루션 1 μl를 추가합니다.
  4. RT에서 2 분을 품어.

4. 역전사

  1. 20 μM SMA-T15, SMA-A의 각각 0.5 ㎕의 분취 량을 추가 할 수 있습니다.
  2. 물론 각 4 μL 배 버퍼, 2 μL DTT, 1 μL 역전사, 1 μL의의 dNTP를 추가합니다.
  3. 열 자전거 타는 사람에 역전사를 수행합니다.
    1. 90 분 × 42 ° C에서 열 프로그램을 설정하고 85 ° C × 5 분에 역전사을 비활성화.

5. 증폭

  1. 각 역 전사 샘플 ExoSAP-IT 시약의 4 μl를 추가합니다.
    1. ExoSAP-IT 시약을 비활성화하는 15 분 15 분 80 ° C, 37 ° C에서 샘플을 품어.
  2. PCR 반응 혼합물을 제조 wi 번째 SMA-P2 (2 NM)
  3. 각 역 전사 샘플 PCR 반응 혼합물의 10 μl를 추가합니다.
  4. 변성의 20주기 (30 초 94 ° C), 어닐링 (30 초 57 ° C) 및 확장 (68 ° C 10 분)로 구성된 증폭을 수행합니다.

6. QRT-PCR 성능

  1. 물론 각 2X SYBR 녹색 PCR 마스터 믹스, 1 μL 증폭 된 cDNA, 2 nm의 프라이머, 7 μL의 물 10 μl를 추가합니다.
    1. 3 초 동안 95 ° C 다음에 프로그램을 설정, 30 초 × 40주기 동안 60 ° C에서.
  2. 기술적 인 오류에 대한 중복 수행합니다.

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Representative Results

효율적이고 강력한 단일 세포의 RNA 증폭

인간 배아 줄기 세포 사이의 전사 변화를 최소화하기 위해, 우리는 OCT4을 사용 :: FACS 정화용 EGFP hESC의 클론. 96 - 웰 플레이트에 OCT4 :: EGFP 양성 세포를 선별 한 후, 각 세포는 용해 버퍼에 용해하고 SMA-T15 (GACATGTATCCGGATGTTTTTTTTTTTTTTTT) 프라이머를 사용하고 SMA-A (ACATGTATCCGGATGTGGG로 고정 된 전체 길이의 cDNA에 폴리 (A) + RNA를 변환 ) SMART 템플릿 스위칭 기술을 사용함으로써. 과량의 올리고 뉴클레오티드는 다음 SMA-P2 (GACATGTATCCGGATGT) 13의 cDNA의 PCR 증폭의 18-20 회 반복, ExoSAP-IT 시약으로 분해 하였다. 우리는 QRT-PCR에 대한 템플릿 (그림 1) 확인하기 위해 증폭 된 cDNA를 사용했습니다. 세포의 낮은 수량 및 단일 세포 3, 14, 15을 사용하여 전체 길이의 RNA 염기 서열과 RNA의 변화를 측정하는 여러 연구가있다. O를UR 지식, 우리는 나노 및 피코 그램 수준까지 인간 배아 줄기 세포의 총 RNA (마이크로 그램의 양)로 희석하고, 총 RNA의 낮은 금액에 차이의 기술 변화 및 ​​검출을 평가하기 위해 우리의 프로토콜을 적용했다. 우리는 희석 RNA 및 개별 세포로부터 생성 된 유전자 발현 수준에서 재현성을 결정. 희석 된 RNA의 분석은 순차적으로 각각의 샘플들 사이의 상관 관계를 보여주고 여러 단일 세포와 QRT-PCR 결과는 GAPDH 유전자의 유사한 캐럿 값 (그림 2)를 보여줍니다.

단일 세포 유전자 프로파일의 정량 평가

역전사 반응의 다른 배치 사이의 일관성을 확인하기 위해, 우리는 절반으로 FACS 정제 된 하나의 세포 용 해물을 나누어 배치 비교를 위해 해물 각 반에 별도로 우리의 프로토콜을 적용했다. 우리는 FACS 분류기 (그림 3)를 사용하여 강력한 EGFP 양성 세포를 분류, 그래서 OCT4 발현 수준은 EGFP에서 높았다양성 세포는 있지만 NANOG 발현 수준은 다양하다. 결과는 단일 세포 용 해물의 각 반 (그림 4)의 OCT4 캐럿의 값과 유의 한 상관 관계를 보여줍니다.

배아 줄기 세포의 유전자 정보 분석

우리는 각각의 인간 배아 줄기 세포를 분류하고 OCT4 표현의 일관된 수준을 보여줍니다 우리의 프로토콜을 사용하여 유전자 발현의 수준을 분석하고, 그 때 우리는 인간 배아 줄기 세포에서 또 다른 줄기 세포 표지 유전자 NANOG를 확인. 결과적으로, OCT4 유전자 발현 수준은 모든 단일 셀에 높은 이었지만 NANOG는 다른 패턴 (도 5)를 나타낸다.

그림 1
그림 1. FACS 정화 후 하나의 인간 배아 줄기 세포 QRT-PCR의 개요도.

그림 2
그림 2. 풀링 된 인간 배아 줄기 세포의 희석 한의 mRNA를 사용하여 GAPDH의 실시간 RT-PCR. 각 점은 희석 한 mRNA의 코네티컷 값과 FACS으로 분류 단일 세포의 mRNA를 보여줍니다. 총 RNA를 10 NG / UL에서 0.1 PG / UL에 희석 하였다. 우리는 비교 만든 선형 플롯에 대해 같은 실험을 반복했다.

그림 3
그림 3. 10월 양성 세포의 FACS 분석. 우리는 FACS 분류기를 사용하여 EGFP 양성 세포를 분류. OCT4 :: EGFP 기자의 hESC 라인은 음의 인구 (B)에 비해 약 60 % EGFP 긍정적 인 인구를 보여줍니다. 우리는 강한 EGFP 양성 세포 (A)를 선택했다.

그림 4
하나의 세포 용해 액을 각각 절반의 유전자 발현 수준의 그림 4. 비교. 역전사 증폭 반응의 다른 배치 사이의 일관성을 확인하기 위해, 우리는 반으로 하나의 세포 용해 액을 분할 및 배치 비교를 위해 우리의 프로토콜을 적용했다.

그림 5
그림 5.60;. FACS로 정제 한 인간 배아 줄기 세포의 유전자 발현의 열지도 프레젠테이션 단일 세포 유전자 발현 분석은 OCT4에서 강력한 발현을 보여 주지만 NANOG 다른 발현 수준.

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Discussion

단일 세포 유전자 프로파일은 단일 세포의 기능이나 전체 인구를 예측할 수있는 중요한 도구가 될 수 있습니다. 기술적 인 제한으로 전체 유전자 프로파일 분석은 인구의 평균으로 제한하고있다. 유전자 발현 패턴 및 개별 세포 모집단 사이 수준의 변화는 잘못된 해석을 일으키는 것으로 제안되어왔다. 이러한 다양한 셀룰러 양태는 인간 배아 줄기 세포에서 발견 될 수 있고, 그들의 이질성 능성 운명 특정 처리를 유지하기위한 미묘한 차이를 유발 능력.

우리가 개발 한 개별 세포의 유전자 발현 연구를 위해 간단하지만 강력한 방법을 제공한다 단세포 정량적 RT-PCR에 대해 검증. 우리의 프로토콜의 유효성을 검사하려면, FACS 정제 된 단일 세포의 용해 액은 절반으로 나누어 정확도를 확인하기 위해이 방법을 적용 하였다. 하나의 세포와 우리의 결과는 희석 한 총 RNA 샘플을 뒷받침하고, 우리는 일관된 결과 B 발견etween 세포 용 해물의 각 반 (그림 4). 그러나, 우리의 프로토콜, 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 검출되지 않을 수 있습니다 우리는 40 개 이상의 유전자의 발현 수준,하지만 특정 전사 정보 (예를 들면 비 폴리아 데 닐화의 mRNA, miRNA의 알 수없는 성적 증명서 등)를 감지 할 수 있습니다. 또한, 표적 유전자에 대한 프라이머를 최적화 할 수있는 몇 가지 기회가있다. 허용되는 프라이머 길이는 보통 18 ~ 22 염기쌍이다. 프라이머의 어닐링 온도는 일반적으로 50 ~ 60 ° C.의 범위에서 작동 프라이머의 GC 함량은 프라이머 어닐링 능력에 의해 영향을받을 수있다. 이 논문에서, 우리는 프라이머 어닐링의 오류를 줄이기 위해 qPCR에의 어닐링 단계를 제거했습니다. 우리는 대조군으로 GAPDH 유전자를 보였으 나, 유전자를 유지하는 다른 집은 컨트롤로 유용 할 수 있습니다. 현재 우리는 가까운 장래에 고립 된 단일 세포의 자세한 사체를 발견되는, RNA 서열 분석 방법에 대한 우리의 프로토콜을 최적화 할 수 있습니다. 다른 제한은 ACCU입니다단일 세포를 분리하기위한 FACS 정화의 정확성. FACS 기계는 주로 각 우물에 하나의 셀을 할당하지만 우리는 각 웰은 FACS 정화 시스템의 기술 사전에 파악 할 수있는 하나 이상의 셀을 포함 할 수있는 가능성을 배제 할 수 없다. 그럼에도 불구하고, 우리의 프로토콜은 최소한의 노력의 일환으로 모든 실험실에 직접 적용 할 수 및 단일 세포 유전자 발현 프로파일 링을위한 효과적인 방법을 비용이 있습니다.

정렬 FACS에 의해 그림 5, OCT4 ::에 나타낸 바와 같이 EGFP 긍정적 인 하나의 세포는 OCT4 유전자 발현과 비슷한 수준을 유지하지만, NANOG은 힘이 인간 배아 줄기 세포 또는 프로그래밍 과정의 다 능성의 서로 다른 상태 제안 다양한 발현 패턴을 보여 주었다 1 . 하나는 다른 세포 표면 마커 (TRA-2-60 SSEA3, ICAM1, CD44), 및 / 또는 유전 기자 시스템 (NANOG, RE를 사용하여 인간 배아 줄기 세포의 단일 세포에서 다른 능성의 유전자 발현 프로파일 링 할 수 있습니다X1, STELLA, ESRRB 등) 5-7 . 이 프로토콜을 이용하여, 단일 세포 유전자 발현 방법은 인간 배아 줄기 세포 또는 줄기 세포의 다른 유형과 같은 이종 집단에 대한 쉽고 강력한 방법이다.

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Disclosures

저자가 공개하는 게 없다.

Acknowledgments

우리는 원고에 대한 가치있는 토론을위한 이명박 실험실의 구성원을 감사드립니다. 이명박 실험실에서 작업 세포 연구 기금 (TEDCO를) 줄기 뉴욕 줄기 세포 재단의 로버트슨 조사자 포상에서 메릴랜드에서 교부금에 의해 지원되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well PCR Plate USA scientific 1402-8900
Ambion Cell Lysis Kit Life Technologies 4458235
SMARTScribe Reverse Transcriptase Clonetech 639536
ExoSAP-IT USB 78200
Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity Invitrogen 11304
10 mM dNTP Mix, PCR Grade Invitrogen 18427
SYBR Universal 2X Master Mix Kapa biosystem KR0389
Accutase Innovative Cell Tech S-1100-1
FACS buffer 45 ml PBS, 5 ml a-MEM, 100 μl DNase, filter sterilized
35 μm cell strainer cap tubes BD Biosciences 352235

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References

  1. Miyanari, Y., Torres-Padilla, M. E. Control of ground-state pluripotency by allelic regulation of Nanog. Nature. 483, 470-473 (2012).
  2. Leitch, H. G., et al. Embryonic germ cells from mice and rats exhibit properties consistent with a generic pluripotent ground state. Development. 137, 2279-2287 (2010).
  3. Ramskold, D., et al. Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells. Nat Biotechnol. 30, 777-782 (2012).
  4. Stewart, M. H., et al. Clonal isolation of hESCs reveals heterogeneity within the pluripotent stem cell compartment. Nat Methods. 3, 807-815 (2006).
  5. O'Malley, J., et al. High-resolution analysis with novel cell-surface markers identifies routes to iPS cells. Nature. 499, 88-91 (2013).
  6. Nichols, J., Smith, A. Naive and primed pluripotent states. Cell Stem Cell. 4, 487-492 (2009).
  7. Kim, H., et al. miR-371-3 expression predicts neural differentiation propensity in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 8, 695-706 (2011).
  8. Mortazavi, A., Williams, B. A., Mccue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nat Methods. 5, 621-628 (2008).
  9. Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, J., Blencowe, B. J. Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing. Nat Genet. 40, 1413-1415 (2008).
  10. Wang, E. T., et al. Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes. Nature. 456, 470-476 (2008).
  11. Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nat Biotechnol. 29, 731-734 (2011).
  12. Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Derivation of neural crest cells from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 5, 688-701 (2010).
  13. Zhu, Y. Y., Machleder, E. M., Chenchik, A., Li, R., Siebert, P. D. Reverse transcriptase template switching: A SMART (TM) approach for full-length cDNA library construction. Biotechniques. 30, 892-897 (2001).
  14. Pan, X. H., et al. Two methods for full-length RNA sequencing for low quantities of cells and single cells. P Natl Acad Sci USA. 110, 594-599 (2013).
  15. Tang, F. C., et al. RNA-Seq analysis to capture the transcriptome landscape of a single cell. Nat Protoc. 5, 516-535 (2010).

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분자 생물학 제 87 단일 셀 이질,​​ 증폭 QRT-PCR 역전사 인간 배아 줄기 세포 FACS
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Lim, H., Choi, I. Y., Lee, G.More

Lim, H., Choi, I. Y., Lee, G. Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR. J. Vis. Exp. (87), e51408, doi:10.3791/51408 (2014).

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