Summary
Одноместный ген клеток выражение анализ необходим для понимания стволовых клеток неоднородности.
Abstract
Неоднородность популяции стволовых клеток затрудняет детальное понимание биологии стволовых клеток, таких, как их дифференциации склонности к различных линий. Одна ячейка транскриптома анализ может быть новый подход к рассекает индивидуальные различия. Мы разработали метод Single Cell Qrt-PCR, и подтвердил, что этот метод хорошо работает в нескольких профилей экспрессии генов. В уровне одной клетки, каждый человек эмбриональных стволовых клеток, отсортировано по OCT4 :: EGFP-положительные клетки, обладает высокой выражение в OCT4, но другой уровень экспрессии NANOG. Наш единственный ген клеток выражение анализ должен быть полезным, чтобы допросить неоднородности населения.
Introduction
Самые высокие популяции эукариот являются гетерогенными, таким образом, с анализом объединенной популяции, часто бывает трудно интерпретировать их клеточных функций. Отдельные клетки внутри популяции может быть немного отличается, и эти различия могут иметь важные последствия для свойства и функции всего населения 1, 2. Тем более, человеческие эмбриональные стволовые клетки (ЭСК), как известно, неоднородны, что вызывает различные уровни плюрипотентности и разнообразные потенциалы в спецификации клонов в деликатно отличительных способов 3, 4. Например, различные антигенов клеточной поверхности могут быть использованы для категоризации недифференцированные плюрипотентные стволовые клетки, 5 и группа Austin Smith предложены различные уровни в плюрипотентности мышиных эмбриональных стволовых клеток, в зависимости от их морфологии, дифференцировки склонности и зависимости от пути передачи сигналов 6. Это явление было предположение, в человеческом эмбрионеNIC стволовые клетки 7. В то время как были выполнены исследования общей среди различных линий стволовых клеток, а не отдельные единичные стволовых клеток, это может быть очень интригующим для анализа различных уровней плюрипотентности на уровне одной клетки, которые потенциально влияет на их дифференциации возможностей в направлении всех соматических клеточных клонов.
Клеточная и молекулярная гетерогенность может быть продиктовано транскрипции профилирования, которая называется «единого транскриптома клеток" и подчеркивает, новые подходы к количественной уровни экспрессии гена 8-10. Для анализа уровня экспрессии гена в отдельных клетках, мы разработали простой, но надежный протокол одного клеток количественного RT-PCR. Мы подтвердили эффективность и целесообразность нашего протокола путем сравнения каждую половину отдельных клеточных лизатов, а также серийно разбавленных тотальную РНК из ЭСК, в результате чего минимальных технических изменений и различий. Кроме того, мы использовали генетический репортер линию, чтобы изолировать однородной рopulation из ЭСК, использующих систему таргетинга генов. Вектор донором для ориентации OCT4 локус (OCT4-2A-EGFP-ПГК-Puro построить) и пару Talen плазмид были использованы 11. Вектор доноров и пара Talen плазмид были введены в ЭСК (Н9, WA09) с помощью нашего nucleofection и клональную протокол выбора и поддержания ЭСК была выполнена на основе нашей повседневной протокола 12. Мы подтвердили этот генетический репортер линия выразить EGFP для выражения OCT4 в OCT4 :: EGFP ЭСК.
Наш результат показывает, что отдельные ЭСК (Начиная с OCT4 :: EGFP сильно положительные клетки) занимают высокие уровни экспрессии OCT4, но разные уровни экспрессии NANOG. Итак, наш единственный ген клеток выражение анализ должен быть полезен для изучения населения неоднородностей плюрипотентных стволовых клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка плиты в 96-луночный
- Смешайте 1 мкл одной клетки DNase1 до 9 мкл Одноместный лизиса клеток Solution.
- Положите 10 мкл смешанного раствора в каждую лунку 96-луночный ПЦР планшет.
2. Снятие ЭСК для FACS очистки
- Отделить Oct4 :: клеточной линии EGFP ES от 60 мм чашку с 1 мл Accutase в течение 20 мин, при 37 ° С, которые были нейтрализованы с человеческим ES средств массовой информации.
- Подготовить популяцию клеток в 1 мл FACS буфера и настроить ячейку до 1 х 10 6 клеток / мл.
- Передайте образец клеток через клеточный фильтр крышкой трубки 35 мкм.
- Храните трубку во льду до сортировки клеток.
3. Лизис СУИМ очищенного одну ячейку в каждую лунку 96-луночного планшета
- Сортировать образец для EGFP-позитивных клеток по мобильному сортировщика с обученным оператором. Положите одну ячейку в одной ячейке решения Lysis/DNase1 в 96-луночный ПЦР планшет. Если необходимо, 96-луночный планшет с образцом могут быть сохранены в -80 ° C морозильная камера меньше, чем один месяц.
- Инкубируйте образцы 5 мин при комнатной температуре для лизиса клеток.
- Добавить 1 мкл стоп раствора для остановки реакции лизиса.
- Инкубировать 2 мин при комнатной температуре.
4. Обратной транскрипции
- Добавить в каждой 0,5 мкл аликвоты 20 мкм SMA-T15, SMA-A.
- Добавить 4 мкл 5X буфера, 2 мкл DTT, 1 мкл обратной транскриптазы и 1 мкл дНТФ в каждую лунку.
- Выполните обратную транскрипцию в термоциклере.
- Установка тепловой программу при 42 ° С × 90 мин и инактивировать обратной транскриптазы при 85 ° С × 5 мин.
5. Усиление
- Добавить 4 мкл ExoSAP-IT реагента в каждую обратной транскрипции образца.
- Инкубируйте образцы при 37 ° С в течение 15 мин и 80 ° С в течение 15 мин для инактивации ExoSAP-IT реагента.
- Подготовка ПЦР реакции смесь жIth SMA-P2 (2 нМ)
- Добавить 10 мкл ПЦР реакционную смесь до каждого обратной транскрипции образца.
- Выполнение амплификацию, состоящий из 20 циклов денатурации (94 ° С в течение 30 сек), отжига (57 ° С в течение 30 сек), и расширения (68 ° C в течение 10 мин).
6. Производительность Qrt-ПЦР
- Добавить 10 мкл 2X SYBR Green PCR Master Mix, 1 мкл амплифицированной кДНК, 2 нм праймеров и 7 мкл воды в каждую лунку.
- Установите программу с последующим 95 ° С в течение 3 сек, 60 ° C в течение 30 сек х 40 циклов.
- Выполните в двух экземплярах для технических ошибок.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Эффективная и надежная одного усиления сотового РНК
Чтобы свести к минимуму транскрипции разброс между ЭСК, мы использовали OCT4 :: EGFP чЭСК клон для очистки FACS. После сортировки Oct4 :: EGFP-положительных клеток в 96-луночный планшет, каждая ячейка лизировали в буфере для лизиса и преобразуется поли (А) + РНК в кДНК полной длины с использованием SMA-T15 (GACATGTATCCGGATGTTTTTTTTTTTTTTTT)-праймера и закрепления с SMA-A (ACATGTATCCGGATGTGGG ) с использованием технологии SMART переключения шаблон. Избыточные олигонуклеотиды расщепляли ExoSAP-IT реагента, затем следуют 18-20 циклов ПЦР-амплификации кДНК с SMA-P2 (GACATGTATCCGGATGT) 13. Мы использовали усиленный кДНК сделать шаблон для Qrt-ПЦР (рис. 1). Есть несколько исследований, для полной длины РНК последовательности и измерения изменчивости РНК с помощью низкие количества клеток и отдельные клетки 3, 14, 15. Чтобы оур знания, мы разводили общей РНК из ЭСК (микрограммовых количеств) до нано-и пико-грамм уровнях и прикладных наш протокол для оценки технического изменчивости и выявление разницы на малых количеств суммарной РНК. Мы определили воспроизводимость уровня экспрессии генов, полученных от разбавленного РНК и отдельных клеток. Анализ разбавленного РНК последовательно показывает корреляцию между каждой пробы и результаты Qrt-ПЦР с несколькими отдельных клеток показывают сходные значения Ct в геном GAPDH (рис. 2).
Количественная оценка отдельных профилей генов клеток
Для проверки согласованности между различными партиями обратных реакций транскрипции, мы разделили СУИМ-очищенные лизаты одноклеточные пополам и прикладных наш протокол отдельно к каждой половине лизатов для сравнения партий. Мы отсортировали сильные EGFP положительных клеток с помощью FACS сортировщик (рис. 3), так что уровень экспрессии OCT4 была высокой в EGFPположительных клеток, но уровень экспрессии NANOG различна. Результат показывает существенную корреляцию между значением OCT4 Ct каждой половины одиноких клеточных лизатов (рис. 4).
Анализ эмбриональных профилей генов стволовых клеток
Мы отсортировали индивидуальные ЭСК и проанализированы их уровень экспрессии генов с помощью нашего протокола, который показывает стабильный уровень экспрессии OCT4, а затем мы проверили еще один стволовых клеток маркера гена Nanog в ЭСК. В результате OCT4 уровень экспрессии гена была высокой в каждую клетку, но NANOG показывает различные модели (рис. 5).
Рисунок 1. Принципиальная обзор одного человека эмбриональных стволовых клеток Qrt-PCR после очистки FACS.
Рисунок 2. Реального времени RT-PCR из GAPDH использованием серийно разводили мРНК объединенных человеческих эмбриональных стволовых клеток. Каждая точка показывает значение КТ серийно разведенной мРНК и один мРНК клеток отсортированных по FACS. Всего РНК разводили от 10 нг / мкл до 0,1 пг / ул. Мы повторили те же эксперименты для сравнения и сделал линейного участка.
Рисунок 3. FACS анализ октября положительных клеток. Мы сортируются EGFP положительный клетку с помощью FACS сортировщик. OCT4 :: EGFP репортер чЭСК линия показывает около 60% населения EGFP положительный по сравнению с отрицательным населения (B). Мы выбрали сильные EGFP-положительных клеток (A).
Рисунок 4. Сравнение уровня экспрессии генов в каждой половине одиночных клеточных лизатов. Для проверки согласованности между различными партиями обратной транскрипции и амплификации реакций, мы разделили одиночные лизатов клеток в два раза, и применили наш протокол для сравнения партии.
Рисунок 5.60;. Тепло карту презентация одного выражения эмбриона человека гена стволовых клеток Одноместный анализ экспрессии генов клеток очищают FACS показывает сильную экспрессию в OCT4, но отличается уровень экспрессии в NANOG.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Одноместный ген клеток профилирование может быть основным инструментом для прогнозирования функциональность одной клетки или все население. Из-за технических ограничений, весь анализ гена профилирование было ограничено средних населенных пунктов. Вариации паттернов экспрессии генов и уровней между отдельными клетками и субпопуляций были предложены, чтобы привести к неправильной интерпретации. Такие различные клеточные аспекты можно найти в ЭСК и их неоднородность вызывает тонко различной способностью для поддержания плюрипотентности и процесс спецификации судьбы.
Мы разработаны и утверждены для одного количественного клеток RT-PCR, который обеспечивает простой, но надежный метод для изучения экспрессии генов в отдельных клетках. Чтобы подтвердить наш протокол, лизаты FACS-очищенного одной ячейке была разделена пополам и применяется к этому методу для проверки точности. Наш результат с одиночных клеток было подтверждено с серийно разведенными общего образцов РНК, и мы нашли устойчивые результаты бetween каждая половина клеточного лизата (рис. 4). Тем не менее, с нашей протокола, есть несколько ограничений. Мы могли бы обнаружить уровень экспрессии более 40 генов, но конкретной информации транскрипции (например, не-полиаденилированных мРНК, микроРНК, неизвестные стенограммы и т. д.) не могут быть обнаружены. Кроме того, есть некоторые возможности для оптимизации праймеров для генов-мишеней. Принятая грунт длина, как правило, 18-22 пар оснований. Температуры отжига праймеров обычно работают в диапазоне 50-60 ° С. В GC содержание грунтовки может зависеть от способности отжига праймера. В этой статье, мы удалили шаг отжига в кПЦР уменьшить погрешность отжига праймеров. Мы показали только ген GAPDH в качестве контроля, а другой уборки гены могут быть полезны в качестве контроля. В настоящее время мы оптимизируем наш протокол для РНК секвенирования подхода, который будет раскрытия более подробной транскриптома изолированных одиночных клеток в ближайшем будущем. Другим ограничением является точколоритный очистки FACS для изоляции отдельных клеток. СУИМ машина в основном выделяет отдельные клетки в каждую лунку, но мы не можем исключить возможность того, что каждый вполне может содержать более одной ячейки, которая может быть просчитан с технического уровня FACS системы очистки. Тем не менее, наш протокол может быть непосредственно применимы к любой лаборатории с минимальными усилиями и экономически эффективный способ для профилирования экспрессии одного гена клеток.
Как показано на рисунке 5, OCT4 :: EGFP положительные отдельные клетки по отсортированных СУИМ поддерживать подобный уровень экспрессии генов OCT4, но NANOG показал разнообразную паттерн экспрессии, что может предполагает различный статус плюрипотентности ЭСК или перепрограммирования процесса 1 . Можно профиль Другие экспрессию генов плюрипотентности в одиночных клетках ЭСК с использованием различных маркеры клеточной поверхности (TRA-1-60, SSEA3, ICAM1, CD44), и / или генетический репортер системы (NANOG, REX1, Стелла, Esrrb и т.д.) 5-7 . Используя этот протокол, один ген клетки подход выражение легкий и мощный метод для гетерогенных популяций, таких как ЭСК или других типов стволовых клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить членов лаборатории Ли за ценные обсуждения по рукописи. Работа в лаборатории Ли была поддержана грантами от Robertson следователь премии Нью-Йорк Фонда стволовых клеток и из Мэриленда Исследования стволовых клеток фонд (TEDCO).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well PCR Plate | USA scientific | 1402-8900 | |
| Ambion Cell Lysis Kit | Life Technologies | 4458235 | |
| SMARTScribe Reverse Transcriptase | Clonetech | 639536 | |
| ExoSAP-IT | USB | 78200 | |
| Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity | Invitrogen | 11304 | |
| 10 mM dNTP Mix, PCR Grade | Invitrogen | 18427 | |
| SYBR Universal 2X Master Mix | Kapa biosystem | KR0389 | |
| Accutase | Innovative Cell Tech | S-1100-1 | |
| FACS buffer | 45 ml PBS, 5 ml a-MEM, 100 μl DNase, filter sterilized | ||
| 35 μm cell strainer cap tubes | BD Biosciences | 352235 |
References
- Miyanari, Y., Torres-Padilla, M. E. Control of ground-state pluripotency by allelic regulation of Nanog. Nature. 483, 470-473 (2012).
- Leitch, H. G., et al. Embryonic germ cells from mice and rats exhibit properties consistent with a generic pluripotent ground state. Development. 137, 2279-2287 (2010).
- Ramskold, D., et al. Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells. Nat Biotechnol. 30, 777-782 (2012).
- Stewart, M. H., et al. Clonal isolation of hESCs reveals heterogeneity within the pluripotent stem cell compartment. Nat Methods. 3, 807-815 (2006).
- O'Malley, J., et al. High-resolution analysis with novel cell-surface markers identifies routes to iPS cells. Nature. 499, 88-91 (2013).
- Nichols, J., Smith, A. Naive and primed pluripotent states. Cell Stem Cell. 4, 487-492 (2009).
- Kim, H., et al. miR-371-3 expression predicts neural differentiation propensity in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 8, 695-706 (2011).
- Mortazavi, A., Williams, B. A., Mccue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nat Methods. 5, 621-628 (2008).
- Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, J., Blencowe, B. J. Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing. Nat Genet. 40, 1413-1415 (2008).
- Wang, E. T., et al. Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes. Nature. 456, 470-476 (2008).
- Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nat Biotechnol. 29, 731-734 (2011).
- Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Derivation of neural crest cells from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 5, 688-701 (2010).
- Zhu, Y. Y., Machleder, E. M., Chenchik, A., Li, R., Siebert, P. D. Reverse transcriptase template switching: A SMART (TM) approach for full-length cDNA library construction. Biotechniques. 30, 892-897 (2001).
- Pan, X. H., et al. Two methods for full-length RNA sequencing for low quantities of cells and single cells. P Natl Acad Sci USA. 110, 594-599 (2013).
- Tang, F. C., et al. RNA-Seq analysis to capture the transcriptome landscape of a single cell. Nat Protoc. 5, 516-535 (2010).
