Summary
Enda cell genuttryck analys behövs för att förstå stamcellsheterogeniteter.
Abstract
Heterogenitet av stamceller befolkningen försvårar detaljerad förståelse av stamcellsbiologi, såsom deras differentiering benägenhet mot olika härstamningar. En enstaka cell transkriptom-analys kan vara en ny metod för att dissekera individuell variation. Vi har utvecklat den enda cell QRT-PCR-metoden, och bekräftade att denna metod fungerar bra i flera genuttrycksprofilerna. I en enda cell nivå har varje mänskliga embryonala stamceller, sorterade efter Oct4 :: EGFP positiva celler, högt uttryck i Oct4, men en annan nivå av NANOG uttryck. Vår enda cell genuttryck analys bör vara användbart för att förhöra befolkningsheterogeniteter.
Introduction
De flesta högre eukaryota populationer är heterogena således med analys av integrerade populationsdata, är det ofta svårt att tolka deras cellulära funktioner. Individuella celler i en population kan vara subtilt annorlunda, och dessa skillnader kan få betydande konsekvenser för fastigheten och funktionen av hela befolkningen 1, 2. Speciellt är mänskliga embryonala stamceller (hESCs) kända för att vara heterogent, vilket orsakar olika nivåer av pluripotens och olika potentialer för härstamning specifikation i fint distinkta sätt 3, 4. Exempelvis kan olika cellyteantigener användas för att kategorisera odifferentierade pluripotenta stamceller, 5 och Austin Smith gruppen föreslagit olika nivåer av pluripotens i mus embryonala stamceller, baserat på deras morfologi, differentiering benägenhet och beroendet av signalväg 6. Detta fenomen hypotes i mänskligt embryonic stamceller 7. De generella studier utfördes bland olika stamcellslinjer, inte enskilda enstaka stamceller, kan det vara mycket intressant att analysera olika nivåer av pluripotens på enskild cellnivå, som eventuellt påverkar deras differentieringskapacitet mot alla somatiska cellinjer.
Cellulär och molekylär heterogenitet kan dikteras av transkriptionsprofilering, som kallas den "enda cell transcriptome" och betonar nya metoder för att kvantifiera genuttryck nivåer 8-10. För analys av genuttryck nivåer i enskilda celler, utvecklade vi en enkel, men robust protokoll för enskild cell kvantitativ RT-PCR. Vi bekräftade effektiviteten och genomförbarheten av våra protokoll genom att jämföra varje halva av enstaka cellysater samt serieutspädda total RNA av hESCs, vilket resulterar i minimala tekniska variationer och skillnader. Vidare använde vi en genetisk reporter linje att isolera homogen pBefolknings av hESCs hjälp av riktad genmodifiering systemet. Donator vektor för måls Oct4 lokus (Oct4-2A-EGFP-PGK-Puro konstruera) och ett par Talen plasmider användes 11. Donatorvektor och ett par talen plasmider infördes i hESCs (H9, WA09) med hjälp av vår nucleofection och klonurvalet protokoll och underhåll av hESCs utförts baserat på vår rutin protokoll 12. Vi bekräftade detta genetiska reporter linje uttrycker EGFP för Oct4 uttryck i Oct4 :: EGFP hESCs.
Vårt resultat visar att enskilda hESCs (sorterade efter Oct4 :: EGFP starkt positiva celler) håller hög Oct4 uttryck, men olika nivåer av NANOG uttryck. Så ska vår enda cell genuttryck analys vara intressant att studera befolkningsheterogeniteter av pluripotenta stamceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Framställning av en 96-brunnars platta
- Blanda 1 l av Single Cell DNase1 till 9 l Single Cell Lysis Solution.
- Sätt 10 | il blandade lösningen i varje brunn i 96-brunnars PCR-platta.
2. Demontering hESCs för FACS Rening
- Drag av Oct4 :: EGFP ES cellinje från 60 mm skål med en ml Accutase under 20 min, vid 37 ° C, vilket neutraliserades med human ES medier.
- Förbered cellpopulationen i en ml FACS-buffert och justera cellen till en x 10 6 celler / ml.
- Passera cellprovet genom ett 35 ìm cell sil mössa röret.
- Förvara röret i is före cellsortering.
3. Lys av FACS-renade enskild cell i varje brunn i 96-brunnars platta
- Sortera provet för EGFP positiva celler i ett cellsorterare med en utbildad operatör. Sätt enda cell in Single Cell Lysis/DNase1 lösning i 96-brunnars PCR-platta. Om det behövs, de 96-brunnar med prov kan lagras i en -80 ° C frys mindre än en månad.
- Inkubera proverna 5 min vid RT för cell-lys.
- Tillsätt 1 l av stopplösning för att stoppa lys reaktion.
- Inkubera 2 min vid rumstemperatur.
4. Omvänd transkription
- Lägg till vardera ett 0,5 pl alikvot av 20 ^ M SMA-T15, SMA-A.
- Lägg 4 il 5X-buffert, 2 | il DTT, 1 ^ il omvänt transkriptas och 1 | il dNTP till varje brunn.
- Genomför omvänd transkription i en termocykler.
- Ställ in värmeprogrammet vid 42 ° C X 90 min och inaktivering av omvänt transkriptas vid 85 ° C x 5 min.
5. Förstärkning
- Lägg 4 pl ExoSAP-IT-reagens till varje omvänd transkriberad prov.
- Inkubera proverna vid 37 ° C under 15 min och 80 ° C under 15 minuter för att inaktivera ExoSAP-IT-reagens.
- Bered PCR-reaktionsblandningen with SMA-p2 (2 nM)
- Tillsätt 10 | il av PCR-reaktionsblandningen till varje omvänd transkriberad prov.
- Utför amplifiering består av 20 cykler av denaturering (94 ° C under 30 sek), annealing (57 ° C under 30 sek) och förlängning (68 ° C under 10 min.)
6. QRT-PCR Performance
- Tillsätt 10 pl av 2X SYBR Green PCR Master Mix, 1 ^ il amplifierat cDNA, 2 nM primrar och 7 | il vatten till varje brunn.
- Ställ in programmet följt av 95 ° C under 3 sek, 60 ° C under 30 sek x 40 cykler.
- Utför i två exemplar för tekniska fel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Effektiv och robust enda cell RNA-förstärkning
För att minimera den transkription variationen bland hESCs, använde vi Oct4 :: EGFP hESC klon för FACS rening. Efter sortering Oct4 :: EGFP-positiva celler i en 96-brunnsplatta är varje cell lyserades i lysbuffert och omvandlades poly (A) + RNA till fullängds-cDNA med användning av SMA-T15 (GACATGTATCCGGATGTTTTTTTTTTTTTTTT)-primer och förankring med SMA-A (ACATGTATCCGGATGTGGG ) med hjälp av SMART mall byta teknik. Överskottet av oligonukleotiderna digererades med ExoSAP-IT-reagens, sedan följt av 18-20 cykler av PCR-amplifiering av cDNA med SMA-p2 (GACATGTATCCGGATGT) 13. Vi använde det amplifierade cDNA göra mallen för QRT-PCR (Figur 1). Det finns flera studier för fullängds-RNA-sekvensering och mätning av RNA-variationer med hjälp av små mängder av celler och enstaka celler 3, 14, 15. För att oUR kunskap, utspätt vi total RNA av hESCs (mikrogrammängder) ner till nano-och pico-gramnivåer och tillämpas våra protokoll för att bedöma den tekniska variabilitet och upptäcka skillnaden på små mängder av total-RNA. Vi bestämde reproducerbarhet i genuttryck nivåer genereras från utspätt RNA och enskilda celler. Analys av det utspädda RNA visar seriellt korrelationen mellan varje prov och QRT-PCR-resultat med flera enskilda celler visar liknande Ct-värdena i GAPDH-genen (Figur 2).
Kvantitativ bedömning av enstaka cell genen profiler
För att validera konsekvens mellan olika partier av omvänd transkription reaktioner, vi delat FACS-renade enstaka cellysater i hälften och tillämpas våra protokoll separat till varje halva av lysat för sats jämförelser. Vi sorterade stark EGFP positiva celler med hjälp av FACS sorterare (Figur 3), så Oct4 uttrycksnivån var hög i EGFPpositiva celler, men NANOG expressionsnivån är olika. Resultatet visar signifikant korrelation mellan Oct4 Ct-värdet för varje halv av enstaka cellysat (figur 4).
Analys av embryonala stamceller gen profiler
Vi sorterade enskilda hESCs och analyserade deras genuttryck nivå med hjälp av våra protokoll, som visar jämn Oct4 uttryck, och då vi kontrollerat en annan stamceller markörgen NANOG i hESCs. Som ett resultat var Oct4 genuttryck nivå hög i varje enskild cell, men NANOG visar olika mönster (Figur 5).
Figur 1. Schematisk översikt av enstaka mänskliga embryonala stamceller QRT-PCR efter FACS rening.
Figur 2. Realtid RT-PCR av GAPDH använda serieutspädd mRNA av poolade humana embryonala stamceller. Varje punkt visar Ct värde serieutspädd mRNA och enda cell mRNA sorterade efter FACS. Totala RNA späddes från 10 ng / ul till 0,1 pg / ul. Vi upprepade samma experiment för jämförelse och gjorde linjär kurva.
Figur 3. FACS-analys av oktober positiva celler. Vi sorterade EGFP positiva cell genom att använda en FACS sorterare. Oct4 :: EGFP reporter hESC linje visar ca 60% EGFP positiva befolkningen jämfört med negativ befolknings (B). Vi valde starka EGFP positiva celler (A).
Figur 4. Jämförelse av genuttryck nivå i varje halva av enstaka cellysat. För att validera konsekvens mellan olika partier av omvänd transkription och amplifieringsreaktionerna, vi delat enstaka cellysat på mitten, och ansökte våra protokoll för sats jämförelse.
Figur 5.60;. Heat map presentation av enstaka mänskliga embryonala stamceller genuttryck Single cell genuttrycksanalys renas genom FACS visar robust uttryck i Oct4, men olika uttrycksnivå i NANOG.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Enda cell genen profilering kan vara ett viktigt verktyg för att förutsäga funktionaliteten i en enda cell eller en hel befolkning. På grund av tekniska begränsningar, har hela gen profilanalys begränsats till medelvärden befolkningen. Variationer i genuttryck mönster och nivåer mellan enskilda celler och subpopulationer har föreslagits för att orsaka felaktig tolkning. Sådana olika cellulära aspekter finns i hESCs och deras heterogenitet orsakar subtilt annorlunda förmåga att bibehålla pluripotens och öde specifikationsprocessen.
Vi utvecklas och valideras för enskild cell kvantitativ RT-PCR, som ger enkel, men robust metod för genuttryck studier i enskilda celler. För att validera våra protokoll, var lysat av FACS-renade enda cell delas i hälften och tillämpas på denna metod för att kontrollera noggrannhet. Vårt resultat med enskilda celler bekräftades med serieutspädda totala RNA-prover och vi hittade konsekventa resultat between varje halva av cellysat (figur 4). Men med våra protokoll, finns det några begränsningar. Vi kunde påvisa uttrycksnivå på över 40 gener, men specifik transkriptions information (t.ex. icke-polyadenylerade mRNA, miRNA, okända avskrifter, etc.) får inte vara detekterbara. Också, finns det vissa möjligheter att optimera primrarna för målgener. Den accepterade primer längd är vanligen 18-22 baspar. De glödgningstemperaturer av primrar arbetar i allmänhet i intervallet från 50 till 60 ° C. GC-innehållet i primem kan påverkas av glödgningen förmåga av primern. I detta papper, vi bort glödgningssteget i qPCR att minska felaktiga primerhybridisering. Vi visade endast GAPDH-genen som en kontroll, men den andra kammaren hålla gener kan vara användbart som en kontroll. Just nu är vi optimerar våra protokoll för RNA-sekvensering strategi, som kommer att avslöja mer detaljerad transcriptome av isolerade enskilda celler i en nära framtid. Den andra begränsningen är ackukrati av FACS rening för att isolera enstaka celler. FACS maskin allokerar mestadels enstaka celler i varje brunn, men vi kan inte utesluta att varje brunn kan innehålla mer än en cell, som kan räknat med tekniskt framsteg av FACS reningssystem. Ändå kan våra protokoll vara direkt tillämplig på alla labb med minimal ansträngning och kostnadseffektivt sätt för profilering enda cell genuttryck.
Såsom visas i figur 5, Oct4 :: EGFP positiva enskilda celler från källsorterat FACS upprätthålla liknande nivå av Oct4 genuttryck, men NANOG visade varierande uttrycksmönster, vilket kan antyder olika status för pluripotens av hESCs eller omprogrammering process 1 . Man kan profilen annan pluripotens genuttryck i enskilda celler av hESCs med användning av olika markörer på cellytan (TRA-1-60, SSEA3, ICAM1, CD44) och / eller genetiskt reportersystem (NANOG, REX1, Stella, ESRRB etc) 5-7 . Genom att använda detta protokoll, är enda cell genuttryck strategi enkel och kraftfull metod för heterogena populationer såsom hESCs eller andra typer av stamceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Vi vill tacka medlemmarna i Lees lab för värdefulla diskussioner om manuskriptet. Arbetet i Lee labbet har finansierats med bidrag från Robertson Investigator Award i New York Stem Cell Foundation och från Maryland Stem Cell Research Fund (TedCo).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well PCR Plate | USA scientific | 1402-8900 | |
| Ambion Cell Lysis Kit | Life Technologies | 4458235 | |
| SMARTScribe Reverse Transcriptase | Clonetech | 639536 | |
| ExoSAP-IT | USB | 78200 | |
| Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity | Invitrogen | 11304 | |
| 10 mM dNTP Mix, PCR Grade | Invitrogen | 18427 | |
| SYBR Universal 2X Master Mix | Kapa biosystem | KR0389 | |
| Accutase | Innovative Cell Tech | S-1100-1 | |
| FACS buffer | 45 ml PBS, 5 ml a-MEM, 100 μl DNase, filter sterilized | ||
| 35 μm cell strainer cap tubes | BD Biosciences | 352235 |
References
- Miyanari, Y., Torres-Padilla, M. E. Control of ground-state pluripotency by allelic regulation of Nanog. Nature. 483, 470-473 (2012).
- Leitch, H. G., et al. Embryonic germ cells from mice and rats exhibit properties consistent with a generic pluripotent ground state. Development. 137, 2279-2287 (2010).
- Ramskold, D., et al. Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells. Nat Biotechnol. 30, 777-782 (2012).
- Stewart, M. H., et al. Clonal isolation of hESCs reveals heterogeneity within the pluripotent stem cell compartment. Nat Methods. 3, 807-815 (2006).
- O'Malley, J., et al. High-resolution analysis with novel cell-surface markers identifies routes to iPS cells. Nature. 499, 88-91 (2013).
- Nichols, J., Smith, A. Naive and primed pluripotent states. Cell Stem Cell. 4, 487-492 (2009).
- Kim, H., et al. miR-371-3 expression predicts neural differentiation propensity in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 8, 695-706 (2011).
- Mortazavi, A., Williams, B. A., Mccue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nat Methods. 5, 621-628 (2008).
- Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, J., Blencowe, B. J. Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing. Nat Genet. 40, 1413-1415 (2008).
- Wang, E. T., et al. Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes. Nature. 456, 470-476 (2008).
- Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nat Biotechnol. 29, 731-734 (2011).
- Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Derivation of neural crest cells from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 5, 688-701 (2010).
- Zhu, Y. Y., Machleder, E. M., Chenchik, A., Li, R., Siebert, P. D. Reverse transcriptase template switching: A SMART (TM) approach for full-length cDNA library construction. Biotechniques. 30, 892-897 (2001).
- Pan, X. H., et al. Two methods for full-length RNA sequencing for low quantities of cells and single cells. P Natl Acad Sci USA. 110, 594-599 (2013).
- Tang, F. C., et al. RNA-Seq analysis to capture the transcriptome landscape of a single cell. Nat Protoc. 5, 516-535 (2010).
