Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Kantitatif RT-PCR ile Bireysel İnsan Embriyonik Kök Hücreleri profilleme

Published: May 29, 2014 doi: 10.3791/51408

Summary

Tek hücre gen sentezleme tahlili kök hücre heterojeniteler anlamak için gereklidir.

Abstract

Kök hücre nüfusun heterojenliği gibi farklı soy doğru onların farklılaşma eğilimi gibi, kök hücre biyolojisi ayrıntılı bir anlayış engellemektedir. Tek bir hücre transcriptome tahlil bireysel farklılık diseksiyon için yeni bir yaklaşım olabilir. Biz tek hücre Mah-PCR yöntemi geliştirdi ve bu yöntem, birkaç gen ekspresyon profilleri iyi çalıştığını doğruladı. Tek hücre düzeyinde, Oct4 olanlar her insan embriyonik kök hücre, :: EGFP pozitif hücreler, Oct4 yüksek ifade, ama Nanog bir ifade farklı bir düzeye sahiptir. Bizim tek bir hücre gen ekspresyon tahlil nüfus heterojenliklerin sorgulamak için yararlıdır olmalıdır.

Introduction

En yüksek ökaryot nüfus toplanmış nüfus analizi dolayısıyla heterojen, onların hücresel özelliklerini yorumlamak zordur. Bir nüfus içinde, tek tek hücrelerin kurnazca farklı olabilir, ve bu farklılıklar tüm nüfusu 1, 2 özelliği ve fonksiyonu için önemli sonuçlar doğurabilir. Özellikle, insan embriyonik kök hücreleri (hESC) hassas bir şekilde ayırt edici 3, 4 içinde soy spesifikasyonuna pluripotensin farklı düzeylerde ve çeşitli potansiyelleri neden olan, heterojen olduğu bilinmektedir. Örneğin, farklı hücre yüzeyi antijenleri farklılaşmamış pluripotent kök hücreleri sınıflandırmak için kullanılabilir, 5 ve Austin Smith grup, morfoloji, farklılaşma yolu eğilimi ve 6 sinyal bağımlı bir göre, fare embriyonik kök hücreleri pluripotensin farklı düzeylerde önerdi. Bu olgu insan embriyosunda hipotezinic kök hücreler 7. Genel çalışmalar, farklı kök hücre hatları, bireysel değil tek bir kök hücreler arasında tülürken, potansiyel tüm somatik hücre soylarının doğru onların farklılaşma kapasitelerini etkileyen tek hücre düzeyinde pluripotensin farklı düzeylerde analiz etmek çok ilginç olabilir.

Hücresel ve moleküler heterojenite 'tek hücreli transcriptome' denir, transkripsiyon profilleme tarafından dikte ve gen ekspresyon düzeyleri 8-10 ölçülmesi için yeni yaklaşımlar vurguluyor olabilir. Tek tek hücrelerin gen ekspresyonu seviyesini ölçmek için, tek bir hücre nicel RT-PCR, basit, ancak güçlü bir protokol geliştirilmiştir. Bu asgari teknik varyasyonlar ve farklar ile sonuçlanan, her bir hücre lizatlarının yarısı gibi hESC seri olarak seyreltildi, toplam RNA karşılaştırarak eden protokol etkinliğini ve uygulanabilirliğini doğruladı. Ayrıca, biz homojen p izole etmek için genetik bir muhabir hattı kullanılırGen hedefleme sistemi kullanılarak hESC opulation. Oct4 lokusunu (Oct4-2A-EGFP-PGK-Puro yapı) ve TALEN plasmidlerin bir çift hedeflenmesi için verici vektör 11 kullanılmıştır. Donör vektör ve TALEN plasmitler bir çift bizim nucleofection ve klonal seleksiyon protokol ve HESC bizim rutin protokolüne 12 dayanılarak yapılmıştır bakım kullanılarak hESC (H9, WA09) girmiştir. Biz bu genetik muhabir hat Oct4 içinde Oct4 ifade EGFP ifade :: EGFP hESC doğruladı.

Bizim sonuç (Oct4 olanlar :: EGFP kuvvetli pozitif hücreler) bireysel HESC Oct4 ifade yüksek düzeyde, ama Nanog ifade farklı düzeylerde sahip olduğunu göstermektedir. Yani, bizim tek bir hücre gen ekspresyon tahlil pluripotent kök hücrelerin nüfus heterojenliklerin incelemek yararlı olacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bir 96-yuvalı plaka içinde 1. Hazırlanması

  1. 9 ul Tek Hücre Çözme Çözüm Tek Hücre DNase1 1 ul karıştırın.
  2. 96 çukurlu PCR plakanın her çukuruna 10 ul karıştırılmış çözeltisi koyun.

FACS Arıtma 2. Ayrılmakta HESC

  1. Insan ES ortam ile nötralize edildi, 37 ° C'de 20 dakika boyunca 1 ml Accutase ile 60 mm tabak, ikinci Oct4 :: EGFP ES hücre hattı çıkarın.
  2. FACS tampon 1 ml hücre popülasyonu hazırlayın ve 1 x 10 6 hücre / ml hücre ayarlayın.
  3. Bir 35 um hücre filtresi kapak tüp aracılığıyla hücre örneği geçirin.
  4. Hücre sıralama önce buz içinde tüpü saklayın.

96 oyuklu plakanın her bir FACS-arıtıldı Tek Hücre 3. Lysis

  1. Eğitimli bir operatör ile bir hücre sıralayıcı EGFP pozitif hücreler için örnek sıralayın. 96 oyuklu bir plaka içerisinde PCR tek hücre Lysis/DNase1 çözeltisi içine tek bir hücre koyun. Gerekirse, 9Örnek 6 oyuklu plaka bir aydan daha kısa bir -80 ° C derin dondurucuda saklanabilir.
  2. Hücre lizizi, oda sıcaklığında numuneleri 5 dakika inkübe edin.
  3. Parçalama reaksiyonu durdurmak için Stop Çözüm 1 ul ekleyin.
  4. Oda sıcaklığında 2 dakika inkübe edin.

4. Ters Transkripsiyon

  1. 20 uM SMA-T15, SMA-A, her bir kısım için 0.5 ul ekle.
  2. Her bir oyuğa 4 ul 5X tampon maddesi, 2 ul DTT, 1 ul ters transkriptaz ve 1 ul dNTP ekleyin.
  3. , Bir termal döngü içinde, ters transkripsiyon yapın.
    1. 90 dakika × 42 ° C 'de termal programı ayarlamak ve 85 ° C x 5 dak ters transkriptaz etkisiz hale getirirler.

5. Amplifikasyon

  1. Her ters transkripsiyonu örnek ExoSAP-IT reaktif 4 ul ekleyin.
    1. ExoSAP-IT reaktif inaktive edilmesi, 15 dakika, 15 dakika ve 80 ° C'de, 37 ° C'de inkübe edin.
  2. PCR reaksiyon karışımı w hazırlayınith SMA-p2 (2 nM)
  3. Her bir ters transkripsiyonu örnek PCR reaksiyon karışımı 10 ul ekle.
  4. Denatürasyon 20 döngü (30 saniye için 94 ° C), tavlama (30 saniye boyunca 57 ° C) ve uzatma (68 ° C 10 dakika süre ile) 'dan oluşan, amplifikasyon yapın.

6. Mah-PCR Performans

  1. Her bir oyuğa 2X SYBR Green PCR Master Mix, 1 ul büyütülmüş cDNA, 2 nM primerler ve 7 ul su içinde 10 ul ekle.
    1. 3 saniye boyunca 95 ° C'de, ardından bir program ayarlama, 30 saniye x 40 döngü için 60 ° C.
  2. Teknik hatalar için çift olarak gerçekleştirin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Verimli ve güvenilir bir hücre RNA amplifikasyonu

HESC arasında kopyalanma değişimini en aza indirmek için, kullanılan :: Oct4 FACS arıtma için EGFP HESC klonu. 96 oyuklu bir plaka içerisine Oct4 :: EGFP pozitif hücreler sıralama sonra, her bir hücre parçalama tamponu içinde lize edildi ve SMA-T15 (GACATGTATCCGGATGTTTTTTTTTTTTTTTT) primeri kullanılarak ve SMA-A (ACATGTATCCGGATGTGGG ile sabitleme tam uzunlukta cDNA'ya poli (A) + RNA dönüştürülmüş ) SMART şablon anahtarlama teknolojisini kullanarak. Oligonükleotitler, daha sonra fazla SMA-p2 (GACATGTATCCGGATGT) 13, cDNA'nın PCR amplifikasyonu 18-20 devir ile takip olunan, ExoSAP-IT maddesi ile sindirildi. Biz, qRT-PCR için bir şablon (Şekil 1) için yükseltilmiş cDNA kullanılmıştır. Hücrelerin düşük miktarlarda ve tek hücreleri 3, 14, 15 ile tam uzunlukta RNA sıralanması ve RNA değişkenlik ölçümü için çeşitli çalışmalar vardır. Için our bilgi, biz nano ve piko-gram seviyeleri aşağı hESC toplam RNA (miktarları mikrogram) seyreltilmiş ve toplam RNA düşük tutarlar farkı teknik değişkenliğini ve algılama değerlendirmek için bizim protokol uygulandı. Bu seyreltilmiş RNA ve tek tek hücreler üretilen gen ekspresyon seviyelerindeki tekrarlanabilirlik belirlenmiştir. Seyreltilmiş RNA analizi seri olarak, her numune arasında bir korelasyon olduğunu göstermektedir ve çok sayıda tek hücre ile QRT-PCR sonuçları GAPDH geni Ct değerleri benzer (Şekil 2) gösterir.

Tek bir hücre gen profilleri kantitatif değerlendirmesi

Ters transkripsiyon reaksiyonları, farklı partiler arasındaki tutarlılığın doğrulamak için, devre içine FACS-saflaştırılarak, tek bir hücre lizatları ayrılır ve toplu karşılaştırmalar için lizatları her yarı ayrı ayrı bizim protokol uygulanmıştır. Biz FACS sıralayıcı (Şekil 3) kullanarak güçlü EGFP pozitif hücrelerini kriteri, yani Oct4 ifade seviyesi EGFP'nin yüksek oldupozitif hücreler, ancak Nanog ifade seviyesi çeşitli olduğunu. Sonuç olarak, tek bir hücre lizatlarının her bir yarısı (Şekil 4) Oct4 Ct değerleri arasında anlamlı bir korelasyon olduğunu göstermektedir.

Embriyonik kök hücre gen profillerinin analizi

Biz bireysel hESC sıralanır ve Oct4 ifade tutarlı düzeyini gösterir bizim protokol, kullanarak gen ekspresyon düzeyini analiz, ve sonra biz HESC başka kök hücre işaretleyici gen Nanog kontrol etti. Bunun bir sonucu olarak, Oct4 gen ekspresyon düzeyi her bir hücrede yüksek, ama Nanog farklı örnek (Şekil 5) göstermektedir.

Şekil 1
Şekil 1.. FACS arıtma sonrası tek insan embriyonik kök hücre Mah-PCR şematik bakış.

Şekil 2,
Şekil 2,. Toplanmış insan embriyonik kök hücreleri seri halinde seyreltilmiş GAPDH mRNA kullanılarak, gerçek zamanlı RT-PCR. Her nokta, seri halinde seyreltilmiş mRNA Ct değeri ve FACS ile kriteri tek hücre mRNA gösterir. Toplam RNA'lar, 10 ng / ul 0.1 ug / ul 'ye kadar seyreltildi. Biz karşılaştırma ve yapılan doğrusal arsa için aynı deneyleri tekrarladı.

Şekil 3,
Şekil 3. OCT pozitif hücrelerinin FACS analizi. Biz FACS sıralayıcı kullanılarak EGFP pozitif hücre sınıflandırılmaktadır. Oct4 :: EGFP muhabiri HESC hattı negatif nüfus (B) ile karşılaştırıldığında yaklaşık% 60 EGFP pozitif nüfus gösterir. Biz güçlü EGFP pozitif hücreler (A) seçilir.

Şekil 4,
Tek hücre lizatlarının her yarım gen ekspresyon seviyesi Şekil 4.. Karşılaştırması. Ters transkripsiyon ve amplifikasyon reaksiyonları, farklı gruplar arasında tutarlılık doğrulamak için, ikiye bölünmüş bir hücre lizatları ve toplu karşılaştırma için protokol uygulanmıştır.

Şekil 5,
Şekil 5,.60;. FACS ile arıtılmış tek insan embriyonik kök hücre gen ekspresyon Isı haritası sunumu Tek hücre gen ekspresyon analizi Oct4 sağlam ifadesini gösterir, ancak Nanog farklı ekspresyon seviyesi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Tek hücre gen profilleme tek bir hücrenin işlevini veya tüm nüfusu tahmin etmek için önemli bir araç olabilir. Nedeniyle teknik sınırlaması, bütün gen profili analizi nüfus ortalamasına sınırlı olmuştur. Gen ekspresyonu ve tek tek hücreler ile alt grupları arasında seviyelerindeki varyasyonlar yanlış yorumlanmasına yol açtığı önerilmiştir. Gibi çeşitli hücresel yönleri HESC bulunabilir ve bunların heterojenite pluripotensini ve kader şartname sürecini korumak için kurnazca farklı yeteneği neden olur.

Biz, geliştirilmiş ve tek tek hücrelerin gen ekspresyonu çalışma için basit, ancak güçlü bir yöntem de sağlar, tek bir hücre nicel RT-PCR için, valide. Bizim protokol doğrulamak için, FACS ile saflaştırılmış tek bir hücrenin lizatları yarıya bölünür ve doğrulukları kontrol etmek için bu yöntem uygulandı. Tek hücre ile sonuç seri seyreltilmiş toplam RNA örnekleri ile desteklendi ve biz tutarlı sonuçlar b bulunduetween hücre lizatının her yarım (Şekil 4). Ancak, bizim protokolü ile, birkaç sınırlamalar vardır. Ölçemeyebilirler Biz 40 genlerin ekspresyon seviyesi, ancak belirli transkripsiyon bilgileri (örneğin sigara poliadenile mRNA'ları, miRNA, bilinmeyen transkript, vb) tespit olabilir. Aynı zamanda, hedef gen için primerler optimize etmek için bir fırsat bulunmaktadır. Kabul primer uzunluğu genellikle 18-22 baz çifti. Primerlerin tavlama sıcaklıkları genel olarak 50-60 ° C aralığında çalışabilir Primerin GC içeriği primerin bağlanma yeteneği ile etkilenebilir. Bu yazıda, primer tavlama hatayı azaltmak için QPCR olarak tavlama adımı kaldırıldı. Sadece bir kontrol olarak GAPDH geni gösterdi, ancak genleri tutan diğer ev, bir kontrol olarak yararlı olabilir. Şu anda yakın gelecekte izole edilmiş tek hücreler daha ayrıntılı transcriptome ortaya çıkarmak, hangi RNA sıralama yaklaşımı için bizim protokol optimize edilir. Diğer sınırlama pil olduğunuTek hücrelerin izole edilmesi için FACS arıtma canlı. FACS makine çoğunlukla her bir kuyunun içine tek hücreleri ayırır, ama biz her iyi FACS arıtma sistemi teknik ilerleme ile anladım olabilir, birden fazla hücre, içerebileceği olasılığını gözardı edilemez. Yine de, bizim protokol minimal çabaları ile herhangi bir laboratuvara doğrudan uygulanabilir olması ve tek bir hücre gen ekspresyon profili için etkin bir şekilde mal olabilir.

Sıralanan FACS ile Şekil 5, Oct4 :: 'de gösterildiği üzere EGFP pozitif tek hücre Oct4 gen ifadesinin seviyesini korumak benzer ama Nanog kudreti HESC veya yeniden programlama işleminin pluripotensin farklı durumunu göstermektedir çeşitli ekspresyon modelini gösterdi 1 . Bir farklı hücre yüzeyi markerleri (TRA-1-60, SSEA3, ICAM-1, CD44) ve / veya genetik raportör sistemi (Nanog, RE kullanılarak hESC tek hücreler Diğer pluripotency gen ifadesini profil olabilirX1, STELLA, ESRRB, vb) 5-7 . Bu protokolü kullanarak, tek bir hücre gen ekspresyon yaklaşımı böyle HESC veya kök hücrelerinin diğer türleri gibi heterojen toplumlarda kolay ve güçlü bir yöntemdir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgments

Biz el yazması değerli tartışmalar için Lee laboratuar üyelerine teşekkür etmek istiyorum. Lee laboratuarda çalışma Hücre Araştırma Fonu (Tedco) Kök New York Kök Hücre Vakfı Robertson Araştırmacı Ödülü ve Maryland hibe tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well PCR Plate USA scientific 1402-8900
Ambion Cell Lysis Kit Life Technologies 4458235
SMARTScribe Reverse Transcriptase Clonetech 639536
ExoSAP-IT USB 78200
Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity Invitrogen 11304
10 mM dNTP Mix, PCR Grade Invitrogen 18427
SYBR Universal 2X Master Mix Kapa biosystem KR0389
Accutase Innovative Cell Tech S-1100-1
FACS buffer 45 ml PBS, 5 ml a-MEM, 100 μl DNase, filter sterilized
35 μm cell strainer cap tubes BD Biosciences 352235

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Miyanari, Y., Torres-Padilla, M. E. Control of ground-state pluripotency by allelic regulation of Nanog. Nature. 483, 470-473 (2012).
  2. Leitch, H. G., et al. Embryonic germ cells from mice and rats exhibit properties consistent with a generic pluripotent ground state. Development. 137, 2279-2287 (2010).
  3. Ramskold, D., et al. Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells. Nat Biotechnol. 30, 777-782 (2012).
  4. Stewart, M. H., et al. Clonal isolation of hESCs reveals heterogeneity within the pluripotent stem cell compartment. Nat Methods. 3, 807-815 (2006).
  5. O'Malley, J., et al. High-resolution analysis with novel cell-surface markers identifies routes to iPS cells. Nature. 499, 88-91 (2013).
  6. Nichols, J., Smith, A. Naive and primed pluripotent states. Cell Stem Cell. 4, 487-492 (2009).
  7. Kim, H., et al. miR-371-3 expression predicts neural differentiation propensity in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 8, 695-706 (2011).
  8. Mortazavi, A., Williams, B. A., Mccue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nat Methods. 5, 621-628 (2008).
  9. Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, J., Blencowe, B. J. Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing. Nat Genet. 40, 1413-1415 (2008).
  10. Wang, E. T., et al. Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes. Nature. 456, 470-476 (2008).
  11. Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nat Biotechnol. 29, 731-734 (2011).
  12. Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Derivation of neural crest cells from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 5, 688-701 (2010).
  13. Zhu, Y. Y., Machleder, E. M., Chenchik, A., Li, R., Siebert, P. D. Reverse transcriptase template switching: A SMART (TM) approach for full-length cDNA library construction. Biotechniques. 30, 892-897 (2001).
  14. Pan, X. H., et al. Two methods for full-length RNA sequencing for low quantities of cells and single cells. P Natl Acad Sci USA. 110, 594-599 (2013).
  15. Tang, F. C., et al. RNA-Seq analysis to capture the transcriptome landscape of a single cell. Nat Protoc. 5, 516-535 (2010).

Tags

Moleküler Biyoloji Sayı 87 Tek hücre heterojenite Amplifikasyon Mah-PCR Reverse transkriptaz insan embriyonik kök hücre FACS
Kantitatif RT-PCR ile Bireysel İnsan Embriyonik Kök Hücreleri profilleme
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lim, H., Choi, I. Y., Lee, G.More

Lim, H., Choi, I. Y., Lee, G. Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR. J. Vis. Exp. (87), e51408, doi:10.3791/51408 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter