Summary
وتفيد التقارير ان طريقة quantitating العدلات التصاق. هذا الأسلوب يخلق بيئة ديناميكية تدفق مماثلة لتلك التي واجهتها في أحد الاوعية الدموية. لأنها تتيح التحقيق في العدلات التصاق إما جزيئات الالتصاق المنقى (يجند) أو البطانية الركيزة الخلية (HUVEC) في سياق مماثل على البيئة في الجسم الحي مع الإجهاد الهائل.
Abstract
التصاق شركة العدلة إلى الخلايا البطانية يلعب دورا حاسما في التهاب في كل من الصحة والمرض. عملية التصاق شركة العدلة ينطوي على كثير من جزيئات الالتصاق مختلفة بما في ذلك أفراد الأسرة إنتغرين β 2 وبها مستقبلات لمكافحة الأسرة ICAM. في الآونة الأخيرة، والتي تحدث بشكل طبيعي المتغيرات الجينية في كل من β 2 لل integrins وذكرت ايكامس أن تترافق مع أمراض المناعة الذاتية. وبالتالي، فإن قدرة لاصقة كمية من العدلات من الأفراد مع اختلاف أشكال أليلية هذه جزيئات الالتصاق المهم دراسة فيما يتعلق الآليات الكامنة وراء تطور المناعة الذاتية. يمكن التصاق الدراسات في النظم غرفة التدفق خلق بيئة مع إجهاد القص السائل مماثلة لتلك التي لوحظت في البيئة الأوعية الدموية في الجسم الحي. هنا، نقدم طريقة استخدام نظام مقايسة غرفة التدفق لدراسة خصائص لاصقة كمية من الدم المحيطي الإنسان العدلةق الإنسان إلى الوريد السري البطانية الخلية (HUVEC) وركائز يجند المنقى. مع هذا الأسلوب، وقدرات لاصقة العدلة من الجهات المانحة مع المتغيرات أليلية مختلفة في مستقبلات الالتصاق يمكن تقييم ومقارنة. ويمكن أيضا أن يتم تعديل هذا الأسلوب لتقييم التصاق غيرها من أنواع الخلايا الأولية أو خطوط الخلية.
Introduction
يتم التعرف على المتغيرات الجينية في كل من β 2 لل integrins وبروابط ICAM الآن لتترافق مع تطور 1،2 أمراض المناعة الذاتية. تحديد العواقب الوظيفية لهذه المتغيرات في الخلايا المشتقة من الأفراد مع هذه المتغيرات ضروري لفهمنا لكيفية مساهمة هذه المتغيرات إلى المرضية أمراض المناعة الذاتية. مثل هذه الدراسات وظيفية تسمح لتحديد الآليات التي تحدث بشكل طبيعي المتغيرات الجينية تشكل الاستجابة المناعية في كل من الصحة والمرض. في مثال محدد من SLE، ونحن نعلم الآن أن المتغيرات في ITGAM (CD11b) ويجند لها، ICAM-1، ربط بقوة مع تطور مرض 1،2. لأن العدلات هي الحاسمة في الاستجابات الالتهابية، ودراسة كمية من العدلات التصاق قد تقدم أفكارا الآلية في كيفية المتغيرات الجينية في ITGAM / ICAM تغيير الالتهاب.
NeutropHIL التصاق الخلايا البطانية لشركة (EC) هي عملية منظمة للغاية ويلعب دورا أساسيا في الاستجابات الالتهابية 3،4. التصاق شركة من العدلات يلي الأولي المتداول العدلة والقبض على المفوضية الأوروبية وفي نهاية المطاف يمكن أن يؤدي إلى التهجير في الجسم الحي. هذه العمليات تنطوي على العديد من أنواع مختلفة من جزيئات الالتصاق، بما في ذلك ICAM-1، ICAM-2، ف selectin، E-Selectin على الخلايا البطانية وβ 2 لل integrins على العدلة 5-9. وبالتالي، فإن القياس الكمي الدقيق للالعدلات التصاق من الجهات المانحة مع المتغيرات أليلية مختلفة من جزيئات الالتصاق يكون من المهم أن نفهم العواقب الوظيفية والمرضية لهذه المتغيرات الجينية.
استخدام تجريبي لغرفة تدفق يمكن أن تخلق بيئة في المختبر مع إجهاد القص السائل مماثلة لتلك التي لوحظت في البيئة الأوعية الدموية في الجسم الحي 10-12. في الواقع، مقايسة غرفة التدفق إلى جانب umbili الإنسانكال الخلايا البطانية الوريد (HUVEC) يمكن أن تحاكي البيئة في الجسم الحي في أحد الاوعية الدموية. باستخدام هذا الأسلوب، يمكن للمرء أن دراسة خصائص لاصقة الخلوية مال نحو الخلايا البطانية. بالإضافة إلى ذلك، البيئة رقابة شديدة من غرفة تدفق كما يسمح بتقييم خلية ملزمة لبروابط التصاق النقية مثل ICAM-1 لتسهيل دراسة التفاعلات مستقبلات يجند محددة.
نقدم هنا طريقة استخدام نظام مقايسة غرفة التدفق التصاق لدراسة خصائص لاصقة من العدلات الدم المحيطي الإنسان إلى HUVEC وركائز يجند المنقى. باستخدام هذا الأسلوب مع الخلايا من الجهات المانحة التعبير عن مختلف المتغيرات جزيء التصاق أليلية يسمح لنا لتقييم كيف يمكن لهذه المتغيرات الجينية يمكن أن يغير الإنسان التصاق شركة العدلة.
Protocol
أعطى جميع الجهات المانحة المعينين لهذه الدراسة الموافقة المسبقة الخطية وتمت الموافقة على الدراسة من جامعة ألاباما في برمنغهام مجلس المراجعة المؤسسية.
1. HUVEC الثقافة الأولية وثقافة ثانوية
- ثقافة الوريد السري الخلايا البشرية البطانية (HUVEC) في المختبر في المتوسط كاملة النمو التي تتكون من الخلايا البطانية المتوسطة القاعدية (انظر قائمة المواد) تستكمل مع عوامل نمو الخلايا البطانية.
ملاحظة: إن عوامل النمو المستخدمة في هذه الدراسة ما يلي: 5 نانوغرام / مل الإنسان المؤتلف عامل نمو البشرة (hEGF)، 1.0 ملغ / مل الهيدروكورتيزون، 50 ملغ / مل جنتاميسين و 50 نانوغرام / مل الأمفوتريسين-B (GA-1000)، 2 ٪ مصل بقري جنيني (FBS)، و 0.5 نانوغرام / مل الأوعية الدموية غشائي عامل نمو (VEGF)، و 10 نانوغرام / مل عامل نمو الخلايا الليفية-Basic مع الهيبارين (hFGF-B)، و 20 نانوغرام / مل المؤتلف عامل نمو الإنسان الإنسان الذي يشبه الانسولين ( R 3-IGF-1)، 1 ميكروغرام / مل حمض الاسكوربيك، و 22.5 ميكروغرام / مل الهيبارين. المتوسط كاملةوقد أعد في البداية عند 37 درجة مئوية ويمكن بعد ذلك تخزينها في 4 درجة مئوية لاستخدامها في غضون شهر 1 من التحضير. - لإعداد قارورة للخلايا، يتم إضافة كامل متوسطة النمو إلى 75 سم 2 نسيج الثقافة قارورة (1 مل / 5 سم 2) ومن ثم يتم السماح القارورة لكي تتوازن إلى 37 درجة مئوية / 5٪ CO 2 في حاضنة مرطب لل لا يقل عن 30 دقيقة. سيتم المصنفة HUVEC الإنسان مباشرة في هذه القارورة الثقافة معايرتها في كثافة 2،500-5،000 خلية / سم 2.
- في حين أن وسائل الإعلام وتوازنه، ذوبان الجليد بسرعة cryovial الأسهم HUVEC في حمام مائي 37 ° C. تفريق الخلايا في قارورة التخزين الأصلي من قبل vortexing ثم إضافتها مباشرة إلى قارورة الثقافة التي تحتوي على معايرتها قبل HUVEC المتوسطة النمو الكامل لتحقيق كثافة 2،500-5،000 خلية / سم 2. صخرة بلطف القارورة لتوزيع بالتساوي الخلايا ومن ثم العودة القارورة إلى حاضنة. وتمثل هذه الخلايا الآن مرور 1 الحادي والعشرين. <لى> متوسطة يجب تغيير كل يومين حتى الخلايا هي 70-80٪ متموجة.
- وHUVECs ويمكن الآن أن تحصد من قارورة الثقافة مع التربسين / EDTA. ويستنشق وسائل الإعلام والثقافة من قوارير الثقافة يعقبه شطف برنامج تلفزيوني لإزالة أي البروتين المتبقية والكالسيوم من الخلايا. يتم إضافة 0.25٪ التربسين EDTA-حل وضمن 2-6 دقيقة خلية مفرزة يجب أن يكون واضحا وفقا لتقييم بواسطة المجهر الضوئي.
- عندما يتم تقريب 90٪ من الخلايا قبالة لوحة، وقف trypsinization بإضافة حجم مساو من 2X مثبط التربسين. لتسهيل الحصاد من الخلايا، إضافة كمية متساوية من أخرى كاملة متوسطة النمو. نقل الخلايا إلى فصل العقيمة 15 مل أنبوب الطرد المركزي.
- أجهزة الطرد المركزي لفصل الخلايا في 225 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. نضح طاف، ثم resuspend الخلايا في 2-3 مل من المتوسط كاملة النمو. تحديد تركيز الخلية وقدرتها على البقاء باستخدام عدادة الكريات والتريبان الأزرق.
- للاستفادة من اله حصاد الخلايا لدراسة وإعادة البذور إضافية 75 سم 2 قوارير مع الخلايا في مناطق ذات كثافة من 10،000 خلية / سم 2 وانتقل إلى الخطوة 2.2. بدلا من ذلك، يمكن تجميد الخلايا في هذه المرحلة للدراسات المستقبلية. لتجميد الخلية، بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 225 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. نضح قبالة طاف و resuspend بيليه خلية في FBS تحتوي على 10٪ DMSO بتركيز 1 × 10 6 خلية / مل. ثم يتم نقل تعليق خلية إلى cryovials وتخزينها في -80 درجة مئوية بعد تجميد الخلايا في وعاء تجميد الخلية.
2. إعداد طبقة HUVEC
- استخدام المجمدة HUVECs 2 الثانية المقطع: إحياء والثقافة. إذا باستخدام الخلايا بنشاط متزايد، انتقل إلى الخطوة 2.2.
- ذوبان الجليد في cryovial تحتوي على 2 HUVECs الثانية مرور من الخطوة 1.8 بسرعة في حمام مائي 37 ° C. نقل الخلايا من cryovial إلى 15 مل العقيمة أنبوب الطرد المركزي وإضافة 10 مل النمو ميديأم.
- الطرد المركزي الخلايا في 200 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، ونضح طاف لإزالة DMSO المتبقية.
- resuspend الكرية خلية كاملة مع النمو المتوسطة ونقل الخلايا إلى 75 سم 2 القارورة. إضافة إلى النمو متوسطة الحجم الكلي حوالي 20-25 مل واحتضان عند 37 درجة مئوية / 5٪ CO 2.
- بصريا دراسة زراعة الخلايا لالتقاء كل يوم مع التغييرات وسائل الاعلام كل يومين. عادة في غضون 2-4 أيام، سوف تصل إلى خلايا 80-90٪ التقاء في الوقت الذي سيكون جاهزا للاستخدام في مقايسة غرفة التدفق.
- لتحضير الطبق الثقافة التي سيتم استخدامها في غرفة التدفق (انظر القسم 5)، إضافة 1 مل من 10 ميكروغرام / مل فبرونيكتين و 0.05٪ (ث / ت) الجيلاتين إلى 35 ملم الأنسجة طبق الثقافة وماصة عدة مرات لجعل تأكد من المغلفة لوحة السطح كله. إزالة فبرونيكتين والجيلاتين حل المفرطة والهواء الجاف لوحة لمدة 30 دقيقة على الأقل لتحسين تشكيل مصفوفة البروتين. وويمكن إعادة استخدامها ibronectin والجيلاتين حل حتى 10x.
- حصاد الخلايا HUVEC من الخطوة 2.2 باستخدام التربسين EDTA-كما هو موضح في الخطوات 1،5-1،7. البذور 500،000 الخلايا في كل طبق زراعة الأنسجة المغلفة. إضافة 2 مل متوسطة النمو في كل طبق واحتضان عند 37 درجة مئوية / 5٪ CO 2.
- تسمح للخلايا أن تنمو إلى نقطة التقاء كما في الخطوة 2.2. الخلايا يجب فحص البصر يوميا مع التغيرات المتوسطة كل يومين. قبل مقايسة غرفة التدفق، رئيس HUVEC مع 20 نانوغرام / مل الإنسان TNF-α لمدة 4-6 ساعة إلى upregulate وتحفيز التصاق جزيء التعبير.
3. تنقية يجند طلاء
- رسم دائرة قطرها 0.5 سم مع علامة أو القلم في مركز 35 ملم الأنسجة طبق الثقافة.
- لوحة 20 ميكرولتر من 20 ميكروغرام / مل البروتين (أ) في منطقة ملحوظ. استخدام غيض ماصة لنشر البروتين حل لتغطية المنطقة كلها داخل دائرة قطرها 0.5 سم. من المهم أن لا تلمس أو تخدش سطح دإيش. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
- غسل البروتين-A 3X لوحة المغلفة مع 1 مل من برنامج تلفزيوني (الرقم الهيدروجيني 8.0).
- لوحة 50 ميكرولتر 1٪ BSA في مجال ملحوظ لمنع ملزم غير محددة على لوحة. احتضان لمدة 2 ساعة في 4 درجات مئوية.
- غسل 3X لوحة سدت مع 1 مل من برنامج تلفزيوني كما في الخطوة 3.3.
- إعداد FC-التصاق مستقبلات البروتين يجند حلول خيالية لطلاء. في هذه التجربة، حلا ICAM-1/Fc الوهم في 25 ميكروغرام / مل والوهم P-Selectin/Fc عند 0.5 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني كان يستخدم (درجة الحموضة 8.0).
- معطف منطقة ملحوظ مع 50 ميكرولتر من الركيزة. احتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. يجب استخدام طبق في غضون يومين، وينبغي ألا يسمح للمنطقة المغلفة لتجف. إضافة PBS إذا لزم الأمر للحفاظ على حل 50 ميكرولتر على لوحة.
4. فصل العدلات (جميع الخطوات المنجزة في درجة حرارة الغرفة)
- بعد الحصول على الموافقة المسبقة، وجمع مشارك في الدم عن طريق الفصد فين تخثر جمع الدم أنبوب أو vacutainer (EDTA أو الهيبارين). بعد جمع الدم، يخفف الدم 1:1 مع برنامج تلفزيوني قبل الانفصال.
- إعداد اثنين من طبقة Ficoll لفصل PBMC والعدلات في 50 مل أنابيب الطرد المركزي. أولا إضافة 15 مل Ficoll الثقيلة (قائمة المواد، ρ = 1،118-1،120 نرى)، ثم طبقة بعناية 10 مل ضوء Ficoll (قائمة المواد، ρ = 1،077-1،080 نرى) على رأس Ficoll الثقيلة. يجب أن يكون هناك حدود حادة بين Ficoll الخفيفة والثقيلة طبقات Ficoll. أخيرا، طبقة بعناية 25 مل من عينة من الدم المخفف على رأس Ficoll ضوء من دون إزعاج طبقة Ficoll.
- أجهزة الطرد المركزي في أنبوب 250 x ج لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ملاحظة: يجب أن يكون الطرد المركزي الفرامل الدوار قبالة لهذه يدور للحد من تعطيل محتمل لفصل الخلايا أثناء الدوار التباطؤ في نهاية الطرد المركزي. بعد الطرد المركزي، والطبقات التالية (من الأعلى إلى الأسفل) موجودة: الطبقة العليا هي البلازما فولو فوتبال شيالأربعاء قبل طبقة PBMC على رأس طبقة Ficoll ضوء، وطبقة العدلة مع عدد قليل من خلايا الدم الحمراء (RBC) هو بين الخفيفة والثقيلة Ficoll تليها طبقة Ficoll الثقيلة وكرات الدم الحمراء في الجزء السفلي من الأنبوب.
- الحصاد ونقل طبقة جديدة العدلة في أنبوب 50 مل مع ماصة نقل، إضافة إلى برنامج تلفزيوني الحجم النهائي من 50 مل وأجهزة الطرد المركزي في 225 x ج لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- بعد الطرد المركزي، قد تكون هناك كرات الدم الحمراء مختلطة مع العدلات. نضح طاف وصولا الى علامة 10 مل. resuspend الكرية العدلة-RBC بواسطة الإثارة لطيف من الأنبوب (أو سرعة منخفضة وجيزة vortexing ل) ثم يغسل مرة أخرى مع 50 مل من برنامج تلفزيوني.
- بعد غسل الثاني، نضح طاف. لإزالة تلويث كرات الدم الحمراء، resuspend الخلايا مكعبات في برنامج تلفزيوني المتبقية عن طريق التحريض (أو vortexing لقصير)، إضافة 25 مل H 2 O ودوامة بلطف لمدة 10 ثانية إلى ليز RBC.
- إضافة 25 مل من 1.8٪ كلوريد الصوديوم وتخلط على الفوربواسطة الطرد المركزي في 225 x ج لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. وRBC تلويث ينبغي الآن هي lysed ترك العدلة الأبيض الخلية بيليه.
- غسل بيليه الخلية العدلة مع برنامج تلفزيوني.
- resuspend والعدلات المعزولة في RPMI المتوسطة مع FBS 10٪ وتحديد تركيز الخلية تحت المجهر الخفيفة مع عدادة الكريات.
- ضبط كثافة الخلية إلى 500،000 خلية / مل مع RPMI كاملة 10٪ FBS المتوسطة.
5. تدفق غرفة التصاق الفحص
- تجميع غرفة تدفق. وضع 35 مم طبق يحتوي على HUVECs متموجة أو المنقى بروابط التصاق مستقبلات على الطاولة المجهر. ربط غرفة تدفق موازية لوحة مع ضخ حقنة، ونظام الفراغ وترك سطر واحد مفتوح للمساهمة العدلة. إدراج غرفة التدفق على الجزء العلوي من لوحة وربط التجمع غرفة التدفق 13. (انظر الشكل 1)
- بدء برنامج تسجيل الفيديو على جهاز كمبيوتر متصل رس المجهر. ضبط الميدان والتركيز المجهر حتى حقل واضحة مع الخلايا HUVEC نمت بشكل كامل أو حقل داخل المنطقة يجند طلاء مرئيا.
- باستخدام مضخة المحاقن، وشطف غرفة التدفق مع RPMI المتوسطة. تأكد من عدم وجود فقاعات هواء داخل غرفة أو سطر الإدخال العدلة.
- إذا رغبت في ذلك، يمكن معبي العدلات مع جرعة منخفضة (10 -8 M) fMLP لمدة 10 دقيقة. وهذا سوف يسمح لمطابقة مستوى القاعدية من تفعيل العدلات بين مختلف الجهات المانحة 14.
- استخدام مضخة لحقن حقنة العدلات في غرفة التدفق بسرعات محددة (بسرعة 350 ميكرولتر / دقيقة، وهو ما يعادل 1.5 من إجهاد القص dynes / سم 2 يتم استخدامه في هذه الدراسة). تسجيل الفيديو. يمكن أن يحدث لأن العدلات التصاق بسرعة، شريط فيديو بطول 4-5 دقيقة وعادة ما يكفي ل quantitate الأحداث التصاق لتحليلها.
- يتم تعريف الخلايا الملتصقة باعتبارها الخلية التي تتحرك قطر الخلية أقل من واحدخلال 5 ثوانى على HUVEC أو يجند المغلفة سطح 15،16. عد عدد من الخلايا الملتصقة في مجال موجودة في الفيديو المسجل باستخدام هذه القاعدة. من خلال تسجيل مقاطع الفيديو طول مماثلة مع العدلات مختلف الجهات المانحة "، يمكن للمرء حساب الخلايا الملتصقة / دقيقة لمقارنة خصائص الالتصاق بين مختلف الجهات المانحة.
Representative Results
أمثلة من العدلات ملزمة ليجند المنقى (ICAM-1/P-Selectin) غرفة تدفق المغلفة (الشكل 2) أو من العدلات ملزمة لHUVEC المغلفة غرفة تدفق مقايسة (الشكل 3) وترد. كما هو مبين في الأرقام، لا تزال تتراكم العدلات / التمسك السطح المطلي أو HUVEC في ظل ظروف تدفق مستمر. تحت ظروفنا تجربة نموذجية، يمكننا أن نلاحظ 50-70 العدلات الإنسان التمسك بقوة إلى السطح المطلي أو HUVEC خلال فترة تسجيل اربع دقائق. ومع ذلك، من المتغيرات أليلية جزيئات الالتصاق العدلة، أو المتغيرات أليلية في الركيزة (يجند تنقيته أو HUVEC)، يمكن أن يغير بشكل كبير كمية العدلات التصاق 14.
قمنا بتقييم أيضا الاعتماد وقت الأحداث التصاق العدلة لوحظ في دراساتنا. في حين أننا الحفاظ على ظروف تدفق مستمر، فمن الممكن أن خصائص لاصقة من الخلايا تتغير مع مرور الوقت. However، خلال دورات زمنية قصيرة نسبيا في دراساتنا، ونحن لا نلاحظ أي خلافات متسقة في معدل التصاق مع مرور الوقت. على سبيل المثال، تقييم التصاق في 1-2 نقاط زمنية دقيقة مقارنة مع التصاق لوحظ بين 3-4 نقاط زمنية دقيقة لا تختلف باستمرار. بطبيعة الحال، إذا كان يتم تحفيز الخلايا خلال التجربة التصاق، ثم يغير في خصائص لاصقة مع مرور الوقت يمكن أن يتوقع.
في دراساتنا، ونحن الخاضعة للرقابة لعزل تفعيل العدلات الناجم عن فتيلة عمدا الخلايا مع جرعة منخفضة fMLP (10 -8 م) لمدة 10 دقيقة قبل الدراسة. الخلايا البطانية (HUVEC في دراساتنا) يتطلب أيضا تفعيل قبل upregulate التصاق جزيء التعبير الأمثل للالتصاق شركة الكرية البيضاء. في غياب ما قبل المعالجة، سوف الخلايا البطانية (HUVECs) دعم القليل جدا من العدلات التصاق. في دراساتنا، استخدمنا 10 نانوغرام / مل العلاج TNFα لمدة 4-6 ساعة قبل استخدامها. IL-1β (10 نانوغرام / مل) و ويمكن أيضا LPS (0.5-1 ميكروغرام / مل) أن تستخدم ما قبل تفعيل الخلايا البطانية. الأهم من ذلك، غير المعالجة HUVEC يمكن استخدامها لمكافحة السلبية لضمان التصاق الخلية يسببه محددة (بوساطة مستقبلات) العدلة البطانية التفاعلات الخلية. بدلا من ذلك، الأجسام المضادة للمستقبلات يمكن استخدامها لمنع مستقبلات محددة لتقييم خصوصية الالتصاق.
الشكل 1. تدفق التكوين غرفة على المسرح المجهر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
oad/51410/51410fig2.jpg "/>
طلقات الشكل 2 الشاشة من شريط فيديو عينة من العدلات التمسك ICAM-1/P-Selectin السطح المطلي في نقاط زمنية مختلفة (A: 0 نقطة زمنية، B: 1 نقطة زمنية دقيقة، C: 2 نقطة زمنية دقيقة، وD: 4 نقطة زمنية دقيقة). تركيز ICAM-1 هو 25 ميكروغرام / مل و ف selectin هو 0.5 ميكروغرام / مل. سرعة تدفق العدلات هو 350 ميكرولتر / دقيقة مع الكثافة العدلة في 500،000 خلية / مل.
طلقات الرقم 3 الشاشة من شريط فيديو عينة من العدلات التمسك السطح HUVEC المغلفة في نقاط زمنية مختلفة (A: 0 نقطة زمنية، B: 1 دقيقة نقطة زمنية، C: 2 نقطة زمنية دقيقة، وD: 4 دقيقة نقطة زمنية).سرعة تدفق العدلات هو 350 ميكرولتر / مل مع كثافة العدلة في 500،000 خلية / مل.
| نوع | موقع | إجهاد القص (dynes / سم 2) |
| بشري | الشريان caroid المشتركة | 11.6 |
| بشري | الشريان خيشومي | 6.5 |
| بشري | الشريان الفخذي المشتركة | 4.3 |
| بشري | الأبهر الكظرية | 7.3 |
| بشري | الأبهر Supraceliac | 4.2 |
| بشري | الشريان fermoral سطحية | 4.4 |
| بشري | الوريدات | 0.5-5.0 |
| بشري | أول الشرايين في شبكية العين | 40.2 |
| بشري | الشرايين الثانية الشبكية | 0.001 |
| بشري | أول الأوردة الشبكية | 23.2 |
| بشري | الأوردة الشبكية الثاني | 0.43 |
| الكلب | الشريان caroid المشتركة | 15.8 |
| أرنب | الشريان caroid المشتركة | 23.3 |
| فأر | الشريان caroid المشتركة | 46.6 |
| فأر | الشريان caroid المشتركة | 64.8 |
| الكلب | الشريان الفخذي المشتركة | 9.8 |
| أرنب | الشريان الفخذي المشتركة | 156.8 |
| فأر | الشريان الفخذي المشتركة | 65.9 |
الجدول 1. إجهاد القص عينة في مختلف الأجهزة والأنواع المختلفة.
* تلخيص من المراجع 13، 16، 19، و 20.
Discussion
هذا البروتوكول توجه الانفصال والعزلة من العدلات تنشيط الحد الأدنى للتقدير الدقيق للالعدلات التصاق تحت ظروف الإجهاد الهائل. العدلات التصاق هو عملية حاسمة في الالتهاب. لأن أثبتت المتغيرات الجينية في جزيئات متعددة في هذه العملية ليؤهب لتطوير أمراض المناعة الذاتية 1،2، مطلوب نظام مقايسة قادرة على تقييم كمي الإنسان التصاق شركة العدلة. الطريقة الموصوفة في هذا البروتوكول يسمح لتحديد الدقيق وكمية من إمكانات لاصقة شركة العدلات في بيئة تسيطر عليها في المختبر تحت الضغط الهائل. وبالتالي هذا الأسلوب يسمح للمقارنة مباشرة لالتصاق العدلة الكمية بين الأفراد مرمزة بالجينات لتحديد أهمية الاختلاف الجيني في جزيئات الالتصاق 14.
العديد من الخطوات في هذا الأسلوب تستحق دراسة متأنية لتحقيقهنتائج ه الكمي للغاية وقابلة للتكرار. في إعداد HUVEC، فمن الأهمية بمكان لتحقيق 100٪ التقاء خلية قبل استخدامها في غرفة التدفق. لاستخدام أسطح مغطاة يجند النقي، لا ينبغي أبدا أن يسمح للمنطقة الركيزة طلاء لتجف لتجنب تغيير طبيعة يجند. بالإضافة إلى ذلك، إعداد العدلات الإنسان أمر بالغ الأهمية لنجاح التجربة. القضايا الرئيسية في عزل العدلات من الدم وتشمل التعامل مع بلطف عن طريق تقليل vortexing لتجنب التنشيط، والحفاظ على الخلايا في درجة حرارة الغرفة (أي لا يجب أن يتم تخزين الدم على الجليد والطرد المركزي الخطوات التي ينبغي القيام بها في درجة حرارة الغرفة) واستكمال العزلة والتجربة في أقل قدر من الوقت ممكن. هناك طرق إضافية العدلة العزلة التي يمكن أيضا أن تستخدم لإعداد الخلايا لهذه المقايسات 17،18.
من العملية المقايسات المنظور، التصاق باستخدام العدلات الإنسان طازجة معزولة يجب أن تبدأ في غضون 3-6 ساعة بعد مشارك الفصد. كما العدلات حساسة للغاية للمناولة ويمكن الأزمنة المتطاولة بين سحب الدم والاستخدام تؤثر نتائج الفحص. تقرير دقيق للتركيز الخلية العدلة قبل مقايسة غرفة التدفق الضروري أيضا لتحقيق نتائج دقيقة وقابلة للتكرار.
خلال مقايسة غرفة التدفق، فمن المهم رصد وتسجيل الفيديو بدقة لضمان سرعة تدفق ثابت وليس هناك اضطرابات في جميع أنحاء طول التجربة. أن التغيرات في سرعات التدفق أو وجود اضطرابات تستلزم أن التجربة تتكرر. بعد التجربة، فإنه من المهم أيضا لتقييم العدلات المتبقية مجهريا للتأكد من أن العدلات لا التثاقل. سوف التثاقل عند هذه النقطة تشير إلى أن العدلات أصبحت تنشيط التي يمكن أن يغير بشكل كبير كثافة العدلات أثناء التجربة.
المحتويات "> وغرفة التدفق يخلق التوتر بالقرب متجانسة الهائل داخل غرفة (τ = 6Qμ / (ملحق 2)، حيث س = معدل التدفق، μ = اللزوجة الديناميكية، وث = العرض من غرفة التدفق، ح = ارتفاع غرفة تدفق 15). في دراساتنا، استخدمنا معدل تدفق 350 ميكرولتر / دقيقة لالعدلات التصاق، مما يخلق التوتر الهائل من 1.5 dynes / سم 2 (ث = 0.25 سم، ح = 0.01 بوصة، لزوجة الماء عند 37 درجة مئوية (0.007 اتزان) كانت تستخدم تقريبي لزوجة RMPI وسائل الإعلام). للحصول على غرفة تدفق محددة، يمكن للمرء تغيير معدل التدفق لتحقيق مستويات مختلفة من الإجهاد الهائل لمحاكاة الظروف الفسيولوجية المختلفة. نموذجي إجهاد القص فيزيولوجي في الأوعية الدموية يمكن أن يتراوح بين الإنسان 0.5-5.0 dynes / سم 13،16. القص التوتر في الأوعية الدموية الأخرى، وكانت الحيوانات الأخرى المدرجة في الجدول 1 113،16،19 20.في حين ركزت أسلوبنا على دراسة التصاق neutrophi الإنسانليرة سورية، وهذه الطريقة لا يقتصر على العدلات ويمكن بسهولة أن تطبق على التصاق أو دراسات المتداول من أنواع الخلايا الأخرى مع تعديلات بسيطة. أيضا، وركائز في هذا الأسلوب يمكن أن تتغير لأغراض مختلفة.
على الرغم من أن هذا البروتوكول هو قابل للتكيف بسهولة إلى دراسات مختلفة، وهناك بعض القيود. البروتوكول كما نفذت هنا يتطلب عدد كبير من الخلايا الأولية للتحليل. وهذا قد يحول دون تحليل الخلايا الأولية من الحيوانات الصغيرة. بالإضافة إلى ذلك، فإن الحاجة إلى شل بروابط التصاق المنقى في التشكل النشطة / المتوفرة قد تحد من مدى بروابط. استخدام البروتينات FC-الانصهار يعزز كثيرا من فرص تحقيق التشكل يجند المناسبة على سطح اللوحة. ومع ذلك، لدينا وسيلة لديه مرونة كبيرة للسماح للتحليل الكمي للالتصاق الأحداث. هذه الدراسات سوف يعزز إلى حد كبير فهمنا للالتصاق مستقبلات يجند أزواج، وظيفة الأهمية المحتملة من المتغيرات الجينيةفي هذه البروتينات، في التسبب في الأمراض التي تصيب الإنسان.
Disclosures
والكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
وترعى هذا العمل من قبل معهد أبحاث مرض الذئبة (نيويورك، نيويورك)، NIH P01-AR49084، NIH-R21 DA026956 والمعاهد الوطنية للصحة UL1-TR00165. نشكر الدكتور روبرت P. كيمبرلي على دعمه المتواصل.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Life technologies | 25200-056 | with Phenol Red |
| 2x Trypsin inhibitor | Life technologies | R-002-100 | |
| 35 mm tissue culture dish | Corning Inc. | 430165 | Standard Tissue Culture Treated Surface |
| 75 cm2 tissue culture flask | Corning Inc. | 430641 | Standard Tissue Culture Treated Surface |
| CCD camera | Dage-MTI | Model 300T-RC | |
| Cell freezing container | Biocision | BCS-045 | |
| EBM-2 | Lonza Inc. | CC-3156 | HUVEC growth basal medium |
| EGM-2 Bulletkit | Lonza Inc | CC-4176 | HUVEC growth factors for basal medium |
| FBS | Life technologies | 10082-147 | Certified, Heat Inactivated |
| Gelatin | Sigma | G9391 | from bovine skin |
| Hemacytometer | Fisher scientific | 02-671-51B | |
| Fibronectin | Sigma | F2006 | from human plasma |
| Flow chamber | Glyco Tech | 31-001 | Circular flow chamber for 35 mm dishes |
| fMLP | Sigma | 47729 | |
| Histopaque-11191 | Sigma | 11191 | Heavy Ficoll |
| HUVEC | Lonza Inc. | CC-2517A | |
| ICAM-1 | R&D Systems | 720-IC | Fc chimera |
| Lymphocyte separation medium | Mediatech Inc. | 25072CV | Light Ficoll |
| Microscope | Zeiss | Axiovert 100 | |
| RPMI 1640 medium | Life technologies | 11875 | with L-glutamine and Phenol Red |
| Protein A | Sigma | P6031 | resuspend in PBS |
| P-Selectin | R&D Systems | 137-PS | Fc chimera |
| Syringe pump | KD Scientific | KDS270 | |
| TNF-α | Life technologies | PHC3015 | Recombinant Human Protein |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Life technologies | 15250-061 |
References
- Harley, J. B., et al. Genome-wide association scan in women with systemic lupus erythematosus identifies susceptibility variants. in ITGAM, PXK, KIAA1542 and other. 40, 204-210 (2008).
- Kim, K., et al. Variation in the ICAM1-ICAM4-ICAM5 Locus Is Associated with Systemic Lupus Erythematosus Susceptibility in Multiple Ancestry Populations. Ann. Rheum. Diseases. 71 (11), 1809-1814 (2012).
- Ley, K. Molecular mechanism of leukocyte recruitment in the inflammatory process. Cardiovasc. Res. 32 (4), 733-742 (1996).
- Korthuls, R. J., Anderson, D. C., Granger, D. N. Role of neutrophil-endothelial cell adhesion in inflammatory disorders. J. Crit. Care. 9 (1), 47-71 (1994).
- Albelda, S. M., Smith, C. W., Ward, P. A. Adhesion molecules and inflammatory injury. FASEB J. 8 (8), 504-512 (1994).
- Smith, C. W., Marlin, S. D., Rothlein, R., Toman, C., Anderson, D. C. Cooperative interactions of LFA-1 and Mac-1 with intercellular adhesion molecule-1 in facilitating adherence and transendothelial migration of human neutrophils in vitro. J. Clin. Invest. 83 (6), 2008-2017 (1989).
- Marlin, S. D., Springer, T. A. Purified intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) is a ligand for lymphocyte function-associated antigen. Cell. 51 (5), 813-819 (1987).
- Lawrence, M. B., Springer, T. A. Leukocytes roll on a selectin at physiologic flow rates: Distinction from and prerequisite for adhesion through integrins. Cell. 65 (5), 859-873 (1991).
- Smith, C. W. Possible steps involved in the transition to stationary adhesion of rolling neutrophils: A brief review. Microcirculation. 7, 385-394 (2000).
- Usami, S., Chen, H. H., Zhao, Y., Chien, S., Skalak, R. Design and construction of a linear shear stress flow chamber. Ann. Biomed. Eng. 21 (1), 77-83 (1993).
- van Kooten, T. G., Schakenraad, J. M., Vander Mei, H. C., Busscher, H. J. Development and use of a parallel-plate flow chamber for studying cellular adhesion to solid surfaces. J. Biomed. Mater. Res. 26 (6), 725-738 (1992).
- Munn, L. L., Melder, R. J., Jain, R. K. Analysis of cell flow in the parallel plate flow chamber: Implications for cell capture studies. Biophys. J. 67, 889-895 (1994).
- Kucik, D. F. Measurement of Adhesion Under Flow Conditions. Current Protocols in Cell Biology. , 9.6.1-9.6.10 (2003).
- Zhou, Y., et al. Multiple Lupus Associated ITGAM Variants Alter Mac-1 Function on Neutrophils. Arthritis. Rheum. , (2013).
- Bacabac, R. G., et al. Dynamic shear stress in parallel-plate flow chambers. J. Biomech. 38 (1), 159-167 (2005).
- Kucik, D. F., Wu, C. Cell-Adhesion Assay. Methods in Molecular Biology. 294, 43-54 (2005).
- Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed,, Goosmann, U., C,, Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them. J Vis Exp. 36 (36), (2010).
- Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. J Vis Exp. (17), 745 (2008).
- Cheng, C., et al. Large variations in absolute wall shear stress levels within one species and between species. Atherosclerosis. 195 (2), 225-235 (2007).
- Nagaoka, T., Yoshida, A. Noninvasive evaluation of wall shear stress on retinal microcirculation in humans. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (3), 1113-1119 (2006).
