Summary
Werkwijze voor het kwantificeren neutrofieladhesie gerapporteerd. Deze methode een dynamisch omgeving vergelijkbaar met die aangetroffen in een bloedvat. Het maakt het onderzoek neutrofieladhesie ofwel gezuiverd adhesiemoleculen (ligand) of endotheelcel substraat (HUVEC) in een context vergelijkbaar met de in vivo omgeving met afschuifspanning.
Abstract
Stevige adhesie van neutrofielen aan endotheelcellen speelt een kritieke rol in ontsteking in zowel gezondheid en ziekte. Het proces van neutrofielen stevige adhesie zijn vele verschillende adhesiemoleculen waaronder leden van de β 2 integrine familie en hun contra-receptoren van de ICAM familie. Onlangs, natuurlijk voorkomende genetische varianten zowel β 2 integrines en ICAM gemeld geassocieerd met auto-immuunziekte. Zo is de kwantitatieve kleefstof aantal neutrofielen uit individuen met verschillende allelische vormen van deze adhesie moleculen van belang te bestuderen met betrekking tot mechanismen ontwikkeling van auto-immuniteit. Hechting studies stroomkamer systemen kunnen een omgeving met vloeistofschuifspanning vergelijkbaar met dat in het bloedvat in vivo omgeving te creëren. Hier presenteren we een methode waarbij een stroomkamer bepalingssysteem de kwantitatieve hechting van menselijk perifeer bloed neutrofielen bestuderenTussen de menselijke navelstreng endotheel cellen (HUVEC) en gezuiverde ligand substraten. Met deze methode kan de neutrofielen lijm capaciteiten van donoren met verschillende allelvarianten in adhesie receptoren worden beoordeeld en vergeleken. Deze werkwijze kan ook worden gemodificeerd om de hechting van andere primaire cellen of cellijnen te beoordelen.
Introduction
Genetische varianten zowel β 2 integrinen en ICAM liganden nu erkend te worden geassocieerd met de ontwikkeling van auto-immuunziekten 1,2. De bepaling van de functionele gevolgen van deze varianten ervan in cellen van individuen met deze varianten is noodzakelijk voor het begrip van hoe deze varianten bijdragen aan auto-immuunziekte pathogenese. Dergelijke functionele studies oog op het bepalen van het werkingsmechanisme van natuurlijk voorkomende genetische varianten vormen de immuunrespons in zowel gezondheid en ziekte. In het specifieke voorbeeld van SLE, we weten nu dat varianten in ITGAM (CD11b) en zijn ligand, ICAM-1, sterk associëren met de ontwikkeling van de ziekte van 1,2. Omdat neutrofielen zijn kritisch in ontstekingsreacties, kan de kwantitatieve studie van neutrofieladhesie mechanistische inzichten in hoe genetische varianten in ITGAM / ICAM veranderen ontsteking bieden.
NeutropHIL stevige adhesie aan cellen (EC) endotheel is een sterk gereguleerd proces en speelt een essentiële rol bij inflammatoire responsen 3,4. De stevige adhesie van neutrofielen volgt initiële neutrofielen rollen en vast te leggen op de EG en uiteindelijk kan leiden tot transmigratie in vivo. Deze werkwijzen omvatten verschillende soorten adhesiemoleculen, waaronder ICAM-1, ICAM-2, P-selectine, E-selectine op endotheelcellen en β 2 integrines op het neutrofiel 5-9. Zo zorgvuldige kwantificering van neutrofiel adhesie van donors met verschillende allelische varianten van adhesiemoleculen belang de functionele en pathologische gevolgen van deze genetische varianten begrijpen.
Experimenten met een stroomkamer kan een in vitro omgeving met vloeistofschuifspanning vergelijkbaar met dat in het bloedvat milieu in vivo 10-12 creëren. Inderdaad, een stromingskamer assay gekoppeld menselijke umbilical ader endotheelcellen (HUVEC) kan de in vivo omgeving van een bloedvat nabootsen. Met deze methode kan men de studie van de totale cellulaire hechting richting endotheelcellen. Bovendien, het zeer gecontroleerde omgeving van de stroming kamer staat ook beoordeling van celbinding aan gezuiverde adhesie liganden zoals ICAM-1 aan de studie van specifieke receptor-ligand interacties te vergemakkelijken.
We presenteren hier een methode waarbij een stromingskamer adhesietest systeem de hechting van menselijk perifeer bloed neutrofielen studeren om HUVEC en gezuiverde ligand substraten. Met behulp van deze methode met cellen van donors die verschillende adhesie molecuul allelvarianten stelt ons in staat om te beoordelen hoe deze genetische varianten menselijke neutrofielen stevige adhesie kan veranderen.
Protocol
Alle donateurs geworven voor deze studie gaf schriftelijke informed consent en de studie werd goedgekeurd door de Universiteit van Alabama in Birmingham Institutional Review Board.
1. HUVEC Initiële Cultuur en Subculture
- Cultuur humane navelstreng endotheel cellen (HUVEC) in vitro in volledige groeimedium dat bestaat uit endotheelcellen basaal medium (zie lijst van materialen), aangevuld met endotheelcelgroei factoren.
Opmerking: De groeifactoren die in deze studie zijn: 5 ng / ml humane recombinante epidermale groeifactor (hEGF), 1,0 mg / ml hydrocortison, 50 mg / ml gentamicine en 50 ng / ml amfotericine-B (GA-1000), 2 % foetaal runderserum (FBS), 0,5 ng / ml Vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF), 10 ng / ml humaan fibroblast groeifactor-basis met heparine (hFGF-B), 20 ng / ml recombinant humaan insuline-achtige groeifactor ( R3-IGF-1), 1 ug / ml ascorbinezuur en 22,5 ug / ml heparine. Het compleet mediumaanvankelijk bereid bij 37 ° C en kan vervolgens worden opgeslagen bij 4 ° C voor gebruik binnen 1 maand na bereiding. - Aan een kolf van cellen te bereiden, wordt volledig groeimedium toegevoegd aan een 75 cm2 weefselkweek kolf (1 ml / 5 cm2) en de kolf wordt equilibreren tot 37 ° C / 5% CO2 in een bevochtigde incubator ten minste 30 minuten. Menselijke HUVEC gaat rechtstreeks geënt in deze geëquilibreerd kolf met een dichtheid van 2.500-5.000 cellen / cm 2.
- Terwijl de media zich evenwichtsherstellende, snel ontdooien de voorraad HUVEC cryovial in een 37 ° C waterbad. Dispergeer de cellen in de oorspronkelijke opslag vaatje door vortexen en voeg deze dan direct aan de cultuur kolf die het pre-geëquilibreerd HUVEC compleet groeimedium tot een dichtheid van 2.500-5.000 cellen / cm 2 bereiken. Schud de kolf om gelijkmatig te verdelen de cellen en dan terug de kolf naar de incubator. Deze cellen vormen nu de 1e passage. <li> Medium moet om de twee dagen worden gewijzigd totdat de cellen 70-80% confluent.
- De HUVECs kan nu worden geoogst uit de kolf met trypsine / EDTA. De cultuur media wordt opgezogen uit de kweekflessen gevolgd door een PBS spoelen om eventuele resten eiwit en calcium uit de cellen te verwijderen. A 0.25% trypsine-EDTA-oplossing toegevoegd en binnen 2-6 minuten cel loslating moet blijken zoals bepaald met lichtmicroscopie.
- Wanneer 90% van de cellen boven worden afgerond de plaat, stop de trypsine door toevoeging van een gelijk volume van 2x trypsine remmer. Om de oogst van de cellen te vergemakkelijken, voeg nog eens evenveel compleet groeimedium. Breng de losgemaakte cellen naar een steriele 15 ml centrifugebuis.
- Centrifugeer de losgemaakte cellen bij 225 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur geroerd. Zuig het supernatant en resuspendeer de cellen in 2-3 ml compleet kweekmedium. Bepaal de cel concentratie en levensvatbaarheid van het gebruik van een hemacytometer en Trypan Blue.
- Om th gebruikene geoogste cellen te bestuderen, re-seed extra 75 cm2 kolven met cellen bij een dichtheid van 10.000 cellen / cm 2 en verder naar stap 2.2. Als alternatief kunnen de cellen op dit punt worden ingevroren voor toekomstige studies. Voor cellen bevriezen, pellet de cellen door centrifugatie bij 225 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur geroerd. Zuig het supernatant en resuspendeer de celpellet in FBS dat 10% DMSO bij een concentratie van 1 x 10 6 cellen / ml. De celsuspensie wordt vervolgens overgebracht naar cryoflesjes en bewaard bij -80 ° C na bevriezen van de cellen in een cel bevriezing container.
2. HUVEC Layer Voorbereiding
- Gebruik van bevroren 2 e passage HUVECs: revival en cultuur. Bij gebruik van actief groeiende cellen, ga dan naar stap 2.2.
- Ontdooi de cryovial met 2 e passage HUVECs vanaf stap 1.8 al snel in een 37 ° C waterbad. Transfer cellen van de cryovial om een 15 ml steriele centrifugebuis en voeg 10 ml groei medium.
- Centrifugeer de cellen bij 200 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en zuig de supernatant om de resterende DMSO te verwijderen.
- Resuspendeer de celpellet met complete groeimedium en breng de cellen in een 75 cm2 kolf. Voeg groeimedium tot een volume ongeveer 20-25 ml en incubeer bij 37 ° C / 5% CO2.
- Visueel onderzoek van de celcultuur voor samenvloeiing elke dag met de media verandert om de twee dagen. Binnen 2-4 dagen zullen de cellen 80-90% confluentie waarna zij klaar voor gebruik in de stroom kamer assay wordt bereikt.
- De kweekschaal die wordt gebruikt in de stroom kamer bereiden (zie sectie 5), voeg 1 ml van 10 ug / ml fibronectine en 0,05% (w / v) gelatine een 35 mm weefselkweekplaat en pipet enkele malen om dat het gehele plaatoppervlak wordt gecoat. Verwijder het buitensporige fibronectine en gelatine-oplossing en lucht drogen de plaat gedurende tenminste 30 minuten om de vorming van eiwit matrix optimaliseren. De fibronectin en gelatine oplossing kan worden hergebruikt tot 10x.
- Oogst de HUVEC-cellen van stap 2.2 met trypsine-EDTA zoals beschreven in stappen 1.5-1.7. Zaad 500.000 cellen in elk gecoat weefselkweek schotel. Voeg 2 ml kweekmedium per schotel en incubeer bij 37 ° C / 5% CO2.
- Laat cellen om te groeien tot confluentie zoals in stap 2.2. De cellen moeten dagelijks visueel worden geïnspecteerd met medium verandert om de twee dagen. Vóór de stroom kamer assay, vul de HUVEC met 20 ng / ml humaan TNF-α gedurende 4-6 uur te upregulate stimuleren en expressie van adhesiemoleculen.
3. Gezuiverd Ligand Coating
- Teken een cirkel van 0,5 cm diameter met een marker of pen in het midden van een 35 mm weefselkweekplaat.
- Plaat 20 gl 20 ug / ml proteïne A in het aangegeven gebied. Gebruik de pipetpunt om het proteïne te spreiden een oplossing voor het gehele gebied binnen de cirkel van 0,5 cm diameter dekken. Het is belangrijk om niet aanraken of krassen op het oppervlak van de dish. Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur.
- Was de proteïne-A gecoate plaat 3x met 1 ml PBS (pH 8,0).
- Plaat 50 pi 1% BSA in het aangegeven gebied te blokkeren niet-specifieke binding aan de plaat. Incubeer 2 uur bij 4 ° C.
- Was de geblokkeerde plaat 3x met 1 ml PBS zoals in stap 3.3.
- Bereid de Fc-adhesiereceptor ligand chimere eiwit oplossingen voor coating. In dit experiment werd een chimeer ICAM-1/Fc oplossing van 25 ug / ml en een P-Selectin/Fc chimeer bij 0,5 ug / ml in PBS (pH 8,0) werd gebruikt.
- Coat de gemarkeerde gebied met 50 pi substraat. Incubeer overnacht bij 4 ° C. De schotel moet binnen twee dagen en het beklede gebied mag niet uitdrogen. Voeg PBS indien nodig de 50 ul oplossing op de plaat te houden.
4. Neutrofiel Separation (alle stappen uitgevoerd bij kamertemperatuur)
- Na het verkrijgen van informed consent, verzamelen deelnemer bloed door aderlatingen in eenn antistollingsmiddel bloedafname of vacutainer (EDTA of heparine). Na bloedafname, verdunnen het bloed 1:1 met PBS vóór de scheiding.
- Bereid een tweelaags Ficoll voor het scheiden van PBMC en neutrofielen in 50 ml centrifuge buizen. Voeg eerst 15 ml zware Ficoll (zie lijst van materialen, ρ = 1,118-1,120), en vervolgens zorgvuldig laag 10 ml licht Ficoll (zie lijst van materialen, ρ = 1,077-1,080) op de top van de zware Ficoll. Er moet een scherpe grens tussen de lichte en zware Ficoll Ficoll lagen. Tenslotte zorgvuldig laag 25 ml van het verdunde bloedmonster op de top van het licht Ficoll zonder de Ficoll laag.
- Centrifugeer het buisje bij 250 xg gedurende 30 min bij kamertemperatuur geroerd. Opmerking: De rem centrifuge rotor moet uit zijn deze spins mogelijke verstoring van de cel scheiding bij rotor afremmen aan het einde van het centrifugeren te minimaliseren. Na centrifugatie worden de volgende lagen (van boven naar beneden) aanwezig: de toplaag is het volgende op plasmawed de PBMC laag boven op de Ficoll-laag licht, neutrofielen laag met weinig rode bloedcellen (RBC) tussen de lichte en zware Ficoll gevolgd door de zware Ficoll laag en RBCs bij de bodem van de buis.
- Oogst en breng de neutrofielen laag in een nieuwe buis van 50 ml met een transfer pipet PBS tot een eindvolume van 50 ml en centrifugeer bij 225 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur.
- Na centrifugeren, kunnen er nog steeds RBCs gemengd met de neutrofielen. Zuig het supernatant tot aan de 10 ml markering. Resuspendeer de neutrofiel-RBC pellet door voorzichtig schudden van de buis (of een korte lage snelheid vortexen) en opnieuw wassen met 50 ml PBS.
- Na de tweede wasbeurt, zuig het supernatant. Om de verontreinigende rode bloedcellen te verwijderen, resuspendeer de gepelleteerde cellen in de resterende PBS door roeren (of kort vortexen), voeg 25 ml H2O en voorzichtig vortex gedurende 10 seconden te lyseren RBC.
- Voeg 25 ml 1,8% NaCl en meng onmiddellijkdoor centrifugatie bij 225 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur. De besmetting van RBC moet nu worden gelyseerd verlaten van een witte neutrofielen cel pellet.
- Was de neutrofielen cel pellet met PBS.
- Resuspendeer de geïsoleerde neutrofielen in RPMI-medium met 10% FBS en bepaal de celconcentratie onder lichtmicroscoop met een hemocytometer.
- Pas de celdichtheid 500.000 cellen / ml met compleet RPMI-10% FBS-medium.
5. Flow Kamer adhesietest
- Monteer de stroom kamer. Plaats de 35 mm schotel met de samenvloeiing HUVECs of gezuiverde adhesie receptor liganden op de microscoop tafel. Sluit de parallelle plaat stroom kamer met injectiepomp, vacuümsysteem en laat een lijn geopend voor de neutrofielen ingang. Steek de stroom kamer op de bovenkant van de plaat en zet de stroom kamer montage 13. (Zie figuur 1)
- Start de video-opname programma op de computer is aangesloten to de microscoop. Stel het veld en focus van de microscoop totdat een heldere veld met volgroeide HUVEC cellen of een veld in het ligand coatinggebied zichtbaar.
- Met behulp van de injectiepomp, spoel de stroom kamer met RPMI medium. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de kamer of de neutrofielen lijningang.
- Desgewenst kan de neutrofielen worden gegrond met lage dosis (10 -8 M) fMLP gedurende 10 minuten. Dit zal zorgen voor een afstemming van het basale niveau van neutrofielen activering tussen verschillende donoren 14.
- De spuit pomp neutrophils injecteren in de stroming kamer bij bepaalde snelheden (een snelheid van 350 pl / min, waarbij een afschuifspanning van 1,5 dyne / cm 2 gelijk wordt gebruikt in deze studie). Noteer de video. Omdat neutrofieladhesie snel optreden, een video met een lengte van 4-5 minuten is meestal voldoende om hechting gebeurtenissen voor analyse kwantificeren.
- Een hechtende cel wordt gedefinieerd als een cel die minder dan een celdiameter beweegtbinnen 5 seconden op de HUVEC of ligand gecoate oppervlak 15,16. Tel het aantal hechtende cellen in het gebied in de opgenomen video met deze regel. Door het opnemen van vergelijkbare lengte van video's met neutrofielen verschillende donoren ', kan men de hechtende cellen / min berekenen van de hechting tussen de verschillende donoren te vergelijken.
Representative Results
Voorbeelden van neutrofiel binding aan een gezuiverde ligand (ICAM-1/P-Selectin) beklede wervelkamer (figuur 2) of neutrofiel binding aan een HUVEC beklede stromingskamer assay (figuur 3) worden getoond. Zoals getoond in de figuren, neutrofielen blijven ophopen / hechten aan het gecoate oppervlak of HUVEC bij continu stroom. Onder onze typisch experiment voorwaarden, kunnen we 50-70 humane neutrofielen stevig vast te houden aan het gecoate oppervlak of HUVEC tijdens een vier-minuten durende opname periode observeren. Echter, allelvarianten van neutrofieladhesie moleculen, of allelvarianten in het substraat (gezuiverd ligand of HUVEC), aanzienlijk zou kunnen veranderen kwantitatieve neutrofieladhesie 14.
We hebben tevens de tijdsafhankelijkheid van de neutrofieladhesie gebeurtenissen waargenomen in onze studies. Terwijl we het voortdurende stroming, is het mogelijk dat de hechtende eigenschappen van de cellen veranderen in de tijd. However, over de relatief korte tijd cursussen in onze studies hebben we geen consistente verschillen in de mate van hechting in de tijd te observeren. Bijvoorbeeld, de beoordeling van de hechting aan de 1-2 minuten tijd punten in vergelijking met hechting waargenomen tussen de 3-4 min tijdstippen zijn niet consequent verschillend. Natuurlijk, als cellen tijdens de adhesie experiment worden gestimuleerd, dan verandert in hechting in de tijd te verwachten.
In onze studies hebben we gecontroleerd voor isolatie geïnduceerd neutrofiel activatie door opzettelijk het vullen van de cellen met een lage dosis fMLP (10 -8 M) gedurende 10 minuten voorafgaand aan de studie. Endotheelcellen (HUVEC in onze studies) heeft ook voorafgaande activering naar expressie van adhesiemoleculen upregulate voor optimale leukocyten stevige adhesie. Aangezien voorbehandeling wordt endotheelcellen (HUVEC) weinig neutrofieladhesie ondersteunen. In onze onderzoeken, gebruikten we 10 ng / ml TNFa behandeling van 4-6 uur vóór gebruik. IL-1β (10 ng / ml) en LPS (0,5-1 ug / ml) kan ook worden gebruikt om vooruit te activeren endotheelcellen. Belangrijk is dat onbehandeld HUVEC worden gebruikt als negatieve controle opdat celadhesie wordt veroorzaakt door specifieke (receptor gemedieerde) neutrofiel-endotheliale cel interacties. Als alternatief kunnen anti-receptor-antilichamen worden gebruikt voor specifieke receptoren blokkeren Het specifieke hechting te beoordelen.
Figuur 1. Flow kamer configuratie op de microscoop podium. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
oad/51410/51410fig2.jpg "/>
. Figuur 2 Screen shots uit een steekproef video van neutrofielen aanhangen gecoate oppervlak ICAM-1/P-Selectin op verschillende tijdstippen (A: 0 tijdstip, B: 1 min tijdstip, C: 2 min tijdstip, en D: 4 min tijdstip). De concentratie van ICAM-1 is 25 ug / ml en P-selectine is 0,5 ug / ml. Neutrofielen stroomsnelheid 350 gl / min met neutrofielen dichtheid bij 500.000 cellen / ml.
. Figuur 3 Screen shots uit een steekproef video van neutrofielen aanhangen HUVEC gecoate oppervlak op verschillende tijdstippen (A: 0 tijdstip, B: 1 min tijdstip, C: 2 min tijdstip, en D: 4 min tijdstip).Neutrofielen stroomsnelheid is 350 pl / met neutrofielen dichtheid bij 500.000 cellen / ml ml.
| Soorten | Plaats | Shear stress (dyne / cm 2) |
| Menselijk | Gemeenschappelijke caroid slagader | 11.6 |
| Menselijk | Branchial slagader | 6.5 |
| Menselijk | Gemeenschappelijke dijbeenslagader | 4.3 |
| Menselijk | Suprarenal aorta | 7.3 |
| Menselijk | Supraceliac aorta | 4.2 |
| Menselijk | Oppervlakkige fermoral slagader | 4.4 |
| Menselijk | Venulen | 0,5-5,0 |
| Menselijk | Retinale eerste arteriolen | 40.2 |
| Menselijk | Retinale tweede arteriolen | 0.001 |
| Menselijk | Retinale eerste venulen | 23.2 |
| Menselijk | Retinale tweede venulen | 0,43 |
| Hond | Gemeenschappelijke caroid slagader | 15.8 |
| Konijn | Gemeenschappelijke caroid slagader | 23.3 |
| Rat | Gemeenschappelijke caroid slagader | 46.6 |
| Muis | Gemeenschappelijke caroid slagader | 64.8 |
| Hond | Gemeenschappelijke dijbeenslagader | 9.8 |
| Konijn | Gemeenschappelijke dijbeenslagader | 156.8 |
| Rat | Gemeenschappelijke dijbeenslagader | 65.9 |
Tabel 1. Voorbeeld schuifspanning in verschillende organen en verschillende soorten.
* Samengevat van referenties 13, 16, 19 en 20.
Discussion
Dit protocol leidt de scheiding en isolatie van minimaal geactiveerde neutrofielen voor de zorgvuldige kwantificering van neutrofieladhesie onder enorme stress-condities. Neutrofieladhesie is een essentieel proces bij ontstekingen. Omdat genetische varianten in meerdere moleculen in dit proces is aangetoond dat predisponeren voor de ontwikkeling van auto-immuunziekten 1,2, wordt een assay systeem dat kwantitatief beoordelen van menselijke neutrofiel stevige adhesie vereist. De methode beschreven in dit protocol zorgt voor de zorgvuldige en kwantitatieve bepaling van de firma lijm potentieel van neutrofielen in een gecontroleerde in vitro omgeving onder enorme stress. Deze methode maakt aldus de directe vergelijking van kwantitatieve neutrofiel hechting tussen genotyperen individuen het belang van genetische variatie in adhesiemoleculen 14 bepalen.
Verschillende stappen in deze methode verdient een zorgvuldige afweging te achieve zeer kwantitatieve en reproduceerbare resultaten. In de HUVEC voorbereiding, is het essentieel om 100% cel confluentie bereiken alvorens ze in de stromingskamer. Voor gebruik oppervlakken bekleed met gezuiverde ligand, moet het substraat lakstraat nooit laten uitdrogen te voorkomen denatureren van het ligand. Bovendien is de bereiding van humane neutrofielen is cruciaal voor het succes van het experiment. Kernpunten isoleren neutrofielen uit het bloed onder zachtjes lossen door het minimaliseren vortexen activering voorkomen, waarbij de cellen bij kamertemperatuur (dwz het bloed moeten worden bewaard op ijs en centrifugatie stappen moeten bij kamertemperatuur worden uitgevoerd) en voltooien van de isolatie en het experiment in de minste hoeveelheid tijd mogelijk. Er zijn extra neutrofielen isolatiemethoden die ook kan worden gebruikt om cellen te bereiden voor deze assays 17,18.
Vanuit praktisch oogpunt, adhesie experimenten met vers geïsoleerde humane neutrofielen moet worden gestart binnen 3-6 uur na deelnemer aderlaten. Aangezien neutrofielen zijn uiterst gevoelig voor behandeling, kan langdurige tijden tussen de bloedafname en het gebruik beïnvloeden testresultaten. Zorgvuldige bepaling van neutrofiel celconcentratie vóór de stroom kamer test is ook nodig om nauwkeurige en reproduceerbare resultaten te verkrijgen.
Tijdens de stromingskamer test is het belangrijk om de video opnamemonitor zorgvuldig zodat de stroomsnelheid consistent en er geen turbulentie gehele lengte van het experiment. Veranderingen in de stroomsnelheden of de aanwezigheid van turbulentie zou vereisen dat het experiment herhaald. Na het experiment is het ook belangrijk om de resterende neutrofielen microscopisch beoordelen dat de neutrofielen niet klonteren. Klonteren op dit punt zou erop wijzen dat de neutrofielen zijn geworden geactiveerd die aanzienlijk kunnen veranderen neutrofielen dichtheid tijdens het experiment.
inhoud "> De stroom kamer creëert een bijna homogene pure spanning binnen de kamer (τ = 6Qμ / (wh 2), waarbij Q = debiet, μ = dynamische viscositeit, en w = breedte van de stroom kamer, h = hoogte van de stromingskamerinfusie 15). In onze onderzoeken, gebruikten we een stroomsnelheid van 350 pl / min voor neutrofiel adhesie die een afschuifspanning van 1,5 dyne / cm 2 ontstaat (w = 0,25 cm, h = 0,01 in de viscositeit van water bij 37 ° C (0.007 poise) werd gebruikt als benadering van de viscositeit van RMPI media). Voor een specifieke stroomkamer, kan het debiet typische fysiologische schuifspanning veranderen om verschillende afschuifspanning bereiken verschillende fysiologische omstandigheden nabootsen. in menselijke bloedvaten varieert tussen 0,5-5,0 dyne / cm 13,16. Afschuifspanning in andere bloedvaten en andere dieren werden in tabel 1 113,16,19 20 vermeld.Terwijl onze methode is gericht op de studie van de hechting van menselijke neutrophils, deze methode is niet beperkt tot neutrofielen en kan gemakkelijk worden toegepast om de hechting of rollen studies van andere celtypes met eenvoudige aanpassingen. Ook kunnen de substraten in deze methode worden veranderd voor verschillende doeleinden.
Hoewel dit protocol gemakkelijk aan verschillende onderzoeken, zijn er enkele beperkingen. Het protocol zoals hier geïmplementeerd vereist grote aantal primaire cellen voor analyse. Dit kan analyse van de primaire cellen van kleine dieren in de weg. Bovendien kan de noodzaak om gezuiverde adhesie liganden immobiliseren in een actieve / verkrijgbare conformatie de reeks liganden beperken. Het gebruik van Fc-fusie-eiwitten vergroot de kansen op juiste ligand conformatie op het plaatoppervlak. Toch onze methode aanzienlijke flexibiliteit voor de kwantitatieve analyse van adhesie laten plaatsvinden. Deze studies zullen sterk verbeteren van ons begrip van adhesie receptor-ligand paren, en de mogelijke functie belang van genetische variantenin deze eiwitten in de pathogenese van menselijke ziekten.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk wordt gesponsord door de Lupus Research Institute (NY, NY), NIH P01-AR49084, NIH R21-DA026956 en NIH UL1-TR00165. Wij danken dr. Robert P. Kimberly voor zijn voortdurende steun.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Life technologies | 25200-056 | with Phenol Red |
| 2x Trypsin inhibitor | Life technologies | R-002-100 | |
| 35 mm tissue culture dish | Corning Inc. | 430165 | Standard Tissue Culture Treated Surface |
| 75 cm2 tissue culture flask | Corning Inc. | 430641 | Standard Tissue Culture Treated Surface |
| CCD camera | Dage-MTI | Model 300T-RC | |
| Cell freezing container | Biocision | BCS-045 | |
| EBM-2 | Lonza Inc. | CC-3156 | HUVEC growth basal medium |
| EGM-2 Bulletkit | Lonza Inc | CC-4176 | HUVEC growth factors for basal medium |
| FBS | Life technologies | 10082-147 | Certified, Heat Inactivated |
| Gelatin | Sigma | G9391 | from bovine skin |
| Hemacytometer | Fisher scientific | 02-671-51B | |
| Fibronectin | Sigma | F2006 | from human plasma |
| Flow chamber | Glyco Tech | 31-001 | Circular flow chamber for 35 mm dishes |
| fMLP | Sigma | 47729 | |
| Histopaque-11191 | Sigma | 11191 | Heavy Ficoll |
| HUVEC | Lonza Inc. | CC-2517A | |
| ICAM-1 | R&D Systems | 720-IC | Fc chimera |
| Lymphocyte separation medium | Mediatech Inc. | 25072CV | Light Ficoll |
| Microscope | Zeiss | Axiovert 100 | |
| RPMI 1640 medium | Life technologies | 11875 | with L-glutamine and Phenol Red |
| Protein A | Sigma | P6031 | resuspend in PBS |
| P-Selectin | R&D Systems | 137-PS | Fc chimera |
| Syringe pump | KD Scientific | KDS270 | |
| TNF-α | Life technologies | PHC3015 | Recombinant Human Protein |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Life technologies | 15250-061 |
References
- Harley, J. B., et al. Genome-wide association scan in women with systemic lupus erythematosus identifies susceptibility variants. in ITGAM, PXK, KIAA1542 and other. 40, 204-210 (2008).
- Kim, K., et al. Variation in the ICAM1-ICAM4-ICAM5 Locus Is Associated with Systemic Lupus Erythematosus Susceptibility in Multiple Ancestry Populations. Ann. Rheum. Diseases. 71 (11), 1809-1814 (2012).
- Ley, K. Molecular mechanism of leukocyte recruitment in the inflammatory process. Cardiovasc. Res. 32 (4), 733-742 (1996).
- Korthuls, R. J., Anderson, D. C., Granger, D. N. Role of neutrophil-endothelial cell adhesion in inflammatory disorders. J. Crit. Care. 9 (1), 47-71 (1994).
- Albelda, S. M., Smith, C. W., Ward, P. A. Adhesion molecules and inflammatory injury. FASEB J. 8 (8), 504-512 (1994).
- Smith, C. W., Marlin, S. D., Rothlein, R., Toman, C., Anderson, D. C. Cooperative interactions of LFA-1 and Mac-1 with intercellular adhesion molecule-1 in facilitating adherence and transendothelial migration of human neutrophils in vitro. J. Clin. Invest. 83 (6), 2008-2017 (1989).
- Marlin, S. D., Springer, T. A. Purified intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) is a ligand for lymphocyte function-associated antigen. Cell. 51 (5), 813-819 (1987).
- Lawrence, M. B., Springer, T. A. Leukocytes roll on a selectin at physiologic flow rates: Distinction from and prerequisite for adhesion through integrins. Cell. 65 (5), 859-873 (1991).
- Smith, C. W. Possible steps involved in the transition to stationary adhesion of rolling neutrophils: A brief review. Microcirculation. 7, 385-394 (2000).
- Usami, S., Chen, H. H., Zhao, Y., Chien, S., Skalak, R. Design and construction of a linear shear stress flow chamber. Ann. Biomed. Eng. 21 (1), 77-83 (1993).
- van Kooten, T. G., Schakenraad, J. M., Vander Mei, H. C., Busscher, H. J. Development and use of a parallel-plate flow chamber for studying cellular adhesion to solid surfaces. J. Biomed. Mater. Res. 26 (6), 725-738 (1992).
- Munn, L. L., Melder, R. J., Jain, R. K. Analysis of cell flow in the parallel plate flow chamber: Implications for cell capture studies. Biophys. J. 67, 889-895 (1994).
- Kucik, D. F. Measurement of Adhesion Under Flow Conditions. Current Protocols in Cell Biology. , 9.6.1-9.6.10 (2003).
- Zhou, Y., et al. Multiple Lupus Associated ITGAM Variants Alter Mac-1 Function on Neutrophils. Arthritis. Rheum. , (2013).
- Bacabac, R. G., et al. Dynamic shear stress in parallel-plate flow chambers. J. Biomech. 38 (1), 159-167 (2005).
- Kucik, D. F., Wu, C. Cell-Adhesion Assay. Methods in Molecular Biology. 294, 43-54 (2005).
- Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed,, Goosmann, U., C,, Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them. J Vis Exp. 36 (36), (2010).
- Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. J Vis Exp. (17), 745 (2008).
- Cheng, C., et al. Large variations in absolute wall shear stress levels within one species and between species. Atherosclerosis. 195 (2), 225-235 (2007).
- Nagaoka, T., Yoshida, A. Noninvasive evaluation of wall shear stress on retinal microcirculation in humans. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (3), 1113-1119 (2006).
