Summary
Un procédé de quantification de l'adhésion des neutrophiles est rapporté. Cette méthode permet de créer un environnement dynamique d'écoulement semblable à celle rencontrée dans un vaisseau sanguin. Il permet à l'enquête de l'adhésion des neutrophiles soit à des molécules purifiées d'adhésion (ligand) ou substrat de cellules endothéliales (HUVEC) dans un contexte similaire à l'environnement in vivo avec contrainte de cisaillement.
Abstract
cabinet d'adhésion des neutrophiles aux cellules endothéliales joue un rôle crucial dans l'inflammation dans la santé et la maladie. Le processus d'adhésion des neutrophiles entreprise implique de nombreuses molécules d'adhésion différents, y compris les membres de la famille des intégrines β 2 et leurs contre-récepteurs de la famille de la GIZC. Récemment, d'origine naturelle variants génétiques dans les deux intégrines β 2 et ICAM sont rapportés pour être associée à une maladie auto-immune. Ainsi, la capacité d'adhésion des neutrophiles quantitative de personnes ayant différentes formes alléliques de ces molécules d'adhérence est important d'étudier en ce qui concerne les mécanismes sous-jacents au développement de l'auto-immunité. études d'adhérence dans les systèmes de la chambre d'écoulement peut créer un environnement avec une contrainte de cisaillement de fluide semblable à celle observée dans l'environnement d'un vaisseau sanguin in vivo. Ici, nous présentons une méthode utilisant un système d'analyse de la chambre de flux pour étudier les propriétés adhésives quantitatives de neutrophiles périphériques humains de sangs à ombilicale humaine cellule endothéliale de la veine (HUVEC) et à des supports de ligands purifiés. Avec cette méthode, les capacités adhésives neutrophiles provenant de donneurs avec différentes variantes alléliques dans des récepteurs d'adhésion peuvent être évalués et comparés. Cette méthode peut également être modifiée afin d'évaluer l'adhésion des autres types de cellules primaires ou de lignées cellulaires.
Introduction
Variants génétiques dans les deux β 2 intégrines et de ligands ICAM sont maintenant reconnus pour être associés à l'élaboration de 1,2 maladie auto-immune. La détermination des conséquences fonctionnelles de ces variantes dans les cellules provenant d'individus avec ces variantes est nécessaire à notre compréhension de la façon dont ces variantes contribuent à la pathogenèse de la maladie auto-immune. Ces études fonctionnelles permettent la détermination des mécanismes par lesquels des variants génétiques d'origine naturelle forment la réponse immunitaire à la fois dans la santé et la maladie. Dans l'exemple spécifique du lupus érythémateux disséminé, nous savons maintenant que les variantes dans ITGAM (CD11b) et son ligand, ICAM-1, fortement associons avec le développement de la maladie 1,2. Parce que les neutrophiles sont essentielles dans les réponses inflammatoires, l'étude quantitative de l'adhésion des neutrophiles peut fournir des idées sur la façon dont mécanistes variants génétiques dans ITGAM / ICAM modifient inflammation.
NeutropHil ferme adhésion aux cellules endothéliales (CE) est un processus très réglementé et joue un rôle essentiel dans les réponses inflammatoires 3,4. L'adhésion ferme de neutrophiles suit roulement des neutrophiles initiale et la capture à la CE et, finalement, peut entraîner la transmigration in vivo. Ces processus impliquent de nombreux types différents de molécules d'adhésion, y compris ICAM-1, ICAM-2, P-sélectine, E-sélectine sur les cellules endothéliales et β 2 intégrines sur la neutrophiles 5-9. Ainsi, la quantification attention de l'adhésion des neutrophiles des bailleurs de fonds avec différentes variantes alléliques de molécules d'adhésion sera important de comprendre les conséquences fonctionnelles et pathologiques de ces variantes génétiques.
Utilisation expérimentale d'une chambre d'écoulement peut créer un environnement in vitro avec une contrainte de cisaillement de fluide semblable à celle observée dans l'environnement d'un vaisseau sanguin in vivo de 10 à 12. En effet, une analyse de la chambre de flux couplé à ombilicale humainecal cellule endothéliale de la veine (HUVEC) peut imiter l'environnement in vivo d'un vaisseau sanguin. En utilisant cette méthode, on peut étudier les propriétés adhésives cellulaires globales à l'égard des cellules endotheliales. En outre, l'environnement hautement contrôlé de la chambre d'écoulement permet également l'évaluation des cellules de liaison à des ligands d'adhésion purifiées telles que ICAM-1, afin de faciliter l'étude des interactions récepteur-ligand spécifiques.
Nous présentons ici une méthode utilisant un système de dosage de la chambre d'écoulement d'adhérence pour étudier les propriétés d'adhérence des neutrophiles du sang périphérique humain pour les cellules HUVEC et de substrats de ligand purifié. En utilisant cette méthode avec des cellules provenant de donneurs exprimant différentes variantes molécule d'adhésion alléliques nous permet d'évaluer comment ces variantes génétiques peuvent modifier l'adhésion de l'entreprise neutrophile humaine.
Protocol
Tous les donneurs recrutés pour cette étude ont donné leur consentement éclairé écrit et l'étude a été approuvé par l'Université de l'Alabama à Birmingham Institutional Review Board.
1. HUVEC Culture initiale et Subculture
- Culture veine cellules endotheliales ombilicales humaines (HUVEC) in vitro dans un milieu de croissance complet qui est composé de cellules endotheliales milieu basai (voir la liste des matériaux) additionné de facteurs de croissance des cellules endothéliales.
Remarque: Les facteurs de croissance utilisés dans cette étude sont les suivantes: 5 ng / ml recombinant humain facteur de croissance épidermique (hEGF), 1,0 mg / ml d'hydrocortisone, 50 mg / ml de gentamicine et 50 ng / ml d'amphotéricine-B (AG-1000), 2 % de sérum bovin fœtal (FBS), 0,5 ng / ml Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF), 10 ng / ml Fibroblast Growth Factor-base avec de l'héparine (hFGF-B), 20 ng / ml de facteur humain recombinant humain de l'insuline-like Growth ( R3-IGF-1), 1 ug / ml d'acide ascorbique, et 22,5 pg / ml d'héparine. Le milieu completOn prépare d'abord à 37 ° C et peut ensuite être conservée à 4 ° C pour une utilisation dans les 1 mois de préparation. - Pour préparer un flacon de cellules, le milieu de croissance complet est ajouté à un flacon de 75 cm2 pour culture de tissus (1 ml / 5 cm 2), puis le flacon est laissé s'équilibrer à 37 ° C / 5% de CO2 dans un incubateur humidifié pour au moins 30 min. HUVEC humain sera ensemencé directement dans ce flacon de culture équilibrée à une densité de 2,500-5,000 cellules / cm 2.
- Alors que les médias s'équilibre, décongeler rapidement la cryovial stock HUVEC dans un bain d'eau à 37 ° C. Disperser les cellules dans le flacon de stockage d'origine par vortex, puis les ajouter directement dans le ballon de culture contenant le milieu de croissance complet pré-équilibré HUVEC pour obtenir une densité de 2,500-5,000 cellules / cm 2. Agitez doucement le flacon afin de répartir uniformément les cellules, puis retourner le ballon à l'incubateur. Ces cellules représentent maintenant le passage 1 er. <li> moyen doit être changé tous les deux jours jusqu'à ce que les cellules sont 70-80% de confluence.
- L'HUVEC peut maintenant être récoltée à partir du flacon de culture avec de la trypsine / EDTA. Le milieu de culture est aspiré à partir des flacons de culture, suivie d'un rinçage du PBS pour éliminer toute protéine résiduelle et du calcium à partir des cellules. Une solution de trypsine-EDTA à 0,25% est ajouté à l'intérieur et le détachement des cellules 2-6 min devrait être évident évaluée par microscopie optique.
- Quand 90% des cellules sont arrondis vers le haut hors de la plaque, arrêter le traitement à la trypsine en ajoutant un volume égal d'inhibiteur de trypsine de 2x. Afin de faciliter la récolte des cellules, ajouter une autre quantité égale de milieu de croissance complet. Transférer les cellules individuelles de 15 ml tube à centrifuger stérile.
- Centrifuger les cellules détachées à 225 xg pendant 5 min à température ambiante. Aspirer le surnageant, puis remettre en suspension les cellules dans 2-3 ml de milieu de croissance complet. Déterminer la concentration et la viabilité cellulaire en utilisant un hémacytomètre et bleu Trypan.
- Pour utiliser ee cellules pour étude, réensemencer supplémentaire de 75 cm 2 flacons avec des cellules à une densité de 10 000 cellules / cm 2 récolté et passez à l'étape 2.2. Alternativement, les cellules peuvent être congelés à ce point pour des études futures. Pour la congélation de cellules, un culot de cellules par centrifugation à 225 xg pendant 5 min à température ambiante. Aspirer le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans du FBS contenant 10% de DMSO à une concentration de 1 x 10 6 cellules / ml. La suspension cellulaire est ensuite transféré dans des cryotubes et stocké à -80 ° C après congélation des cellules dans un récipient de congélation de cellules.
2. Préparation HUVEC Layer
- L'utilisation de surgelés HUVECs 2ème passage: renouveau et de la culture. Si l'utilisation de cellules en croissance active, passez à l'étape 2.2.
- Décongeler la cryovial contenant 2 HUVECs e de passage de l'étape 1.8 rapidement dans un bain d'eau à 37 ° C. Transférer les cellules du tube cryogénique à un tube à centrifuger stérile de 15 ml et ajouter 10 ml de mé croissanceum.
- Centrifuger les cellules à 200 xg pendant 5 min à température ambiante et aspirer le surnageant pour éliminer le DMSO résiduel.
- Remettre en suspension le culot de cellules avec du milieu de croissance complet et transférer les cellules dans un flacon de 75 cm 2. Ajouter un milieu de croissance à un volume total d'environ 20 à 25 ml et incuber à 37 ° C / 5% CO 2.
- Examiner visuellement la culture cellulaire pour confluence chaque jour avec les changements des médias tous les deux jours. Habituellement dans les 2-4 jours, les cellules atteignent 80-90% de confluence au moment où ils seront prêts pour une utilisation dans l'analyse de la chambre d'écoulement.
- Pour préparer le plat de la culture qui sera utilisé dans la chambre de circulation (voir la section 5), ajouter 1 ml de 10 ug / fibronectine ml et 0,05% (p / v) de gélatine à une boîte de culture tissulaire de 35 mm et la pipette plusieurs fois pour faire que la surface de la plaque tout est enrobé. Retirer la solution et de l'air de la fibronectine et de la gélatine excessive sécher la plaque pendant au moins 30 min afin d'optimiser la formation de la matrice de protéine. Le fsolution de ibronectin et la gélatine peut être réutilisée jusqu'à 10 fois.
- Récolter les cellules HUVEC à partir de l'étape 2.2 en utilisant de la trypsine-EDTA comme décrit dans les étapes 01.05 à 01.07. Ensemencer 500 000 cellules dans chaque boîte de culture de tissu enduit. Ajouter 2 ml de milieu de croissance dans chaque boîte et incuber à 37 ° C / 5% CO 2.
- Permettent aux cellules de croître jusqu'à la confluence comme dans l'étape 2.2. Les cellules doivent être inspectés visuellement tous les jours avec changement de milieu tous les deux jours. Avant le dosage de la chambre d'écoulement, le premier HUVEC avec 20 le TNF-α humain ng / ml pour 4-6 heures pour réguler à la hausse et à stimuler l'expression des molécules d'adhérence.
3. Purifiée de ligand de revêtement
- Tracez un cercle de 0,5 cm de diamètre avec un marqueur ou un stylo au centre d'une boîte de culture tissulaire de 35 mm.
- Plate 20 pi de 20 pg / ml de protéine A dans la zone marquée. Utilisez la pointe de la pipette pour répandre la protéine Une solution pour couvrir toute la zone à l'intérieur du cercle de 0,5 cm de diamètre. Il est important de ne pas toucher ou rayer la surface de la dish. Incuber à 37 ° C pendant 1 heure.
- Laver les protéine A la plaque 3x revêtues avec 1 ml de PBS (pH 8,0).
- Planche 50 pi 1% de BSA dans la zone marquée à bloquer la liaison non-spécifique sur la plaque. Incuber pendant 2 heures à 4 ° C.
- Laver la plaque 3x les bloqués avec 1 ml de PBS que dans l'étape 3.3.
- Préparer les solutions de protéines chimères ligand-récepteur Fc d'adhérence pour le revêtement. Dans cette expérience, une solution ICAM-1/Fc chimère à 25 pg / ml et une chimère P-Selectin/Fc à 0,5 ug / ml dans du PBS (pH 8,0) a été utilisé.
- Manteau de la zone marquée avec 50 ul de substrat. Incuber pendant une nuit à 4 ° C. Le plat doit être utilisé dans les deux jours et la surface revêtue ne devrait pas être autorisé à sécher. Ajouter PBS si nécessaire pour maintenir la solution de 50 ul sur la plaque.
4. Séparation des neutrophiles (Tous les étapes réalisées à température ambiante)
- Après obtention du consentement éclairé, recueillir le sang des participants par la saignée dans unn anticoagulant tube de collecte de sang ou Vacutainer (EDTA ou de l'héparine). Après la collecte de sang, diluer le sang de 1:01 avec du PBS avant la séparation.
- Préparer une à deux couches de Ficoll pour séparer PBMC et des neutrophiles dans 50 ml tubes de centrifugation. Première ajouter 15 ml de Ficoll lourd (voir la liste des matériaux, ρ = 1,118 à 1,120), et ensuite soigneusement couche 10 ml de Ficoll lumière (voir la liste des matériaux, ρ = 1,077 à 1,080) sur le dessus de la lourde Ficoll. Il devrait y avoir une frontière nette entre le Ficoll lumière et des couches de Ficoll lourds. Enfin, la couche soigneusement 25 ml de l'échantillon de sang dilué sur le dessus du Ficoll lumière sans déranger la couche de Ficoll.
- Centrifuger le tube à 250 g pendant 30 min à température ambiante. Remarque: Le frein de rotor de centrifugeuse doit être éteint pour ces rotations afin de minimiser la perturbation potentielle de la séparation des cellules au cours de la décélération du rotor à la fin de la centrifugation. Après centrifugation, les couches suivantes (de haut en bas) sont présents: la couche supérieure est la sui plasmamené par la couche de PBMC sur le dessus de la couche de Ficoll lumière, la couche de neutrophiles avec peu de globules rouges (RBC) est comprise entre la lumière et Ficoll lourde suivie de la couche de globules rouges et de Ficoll lourde au fond du tube.
- Récolte et transférer la couche de cellules neutrophiles dans un nouveau tube de 50 ml avec une pipette de transfert, ajouter du PBS pour un volume final de 50 ml et centrifuger à 225 g pendant 10 min à température ambiante.
- Après centrifugation, il peut toujours y avoir des globules rouges mélangés avec les neutrophiles. Aspirer le surnageant jusqu'à la marque de 10 ml. Reprendre le culot neutrophiles RBC par agitation douce du tube (ou une brève vortex à basse vitesse), puis lavez à nouveau avec 50 ml de PBS.
- Après le second lavage, aspirer le surnageant. Pour enlever les globules rouges contaminants, remettre en suspension le culot cellulaire dans le PBS résiduelle par agitation (ou court vortex), ajouter 25 ml H 2 O et doucement vortex pendant 10 secondes à la lyse RBC.
- Ajouter 25 ml de NaCl 1,8% et immédiatement mélangerpar centrifugation à 225 xg pendant 10 min à température ambiante. La RBC contamination devrait maintenant être lysée laissant un neutrophiles blanc culot cellulaire.
- Laver le culot cellulaire des neutrophiles avec de la PBS.
- Remettre en suspension les cellules neutrophiles isolés dans du milieu RPMI avec 10% de FBS et de déterminer la concentration de cellules au microscope optique avec un hémocytomètre.
- Ajuster la densité cellulaire à 500 000 cellules / ml avec du milieu RPMI complet, 10% de milieu FBS.
5. Chambre de circulation Essai d'adhésion
- Assemblez la chambre d'écoulement. Placer le plat de 35 mm contenant les HUVEC confluentes ou des ligands de récepteurs d'adhérence purifiées sur la table de microscope. Relier la chambre d'écoulement à plaques parallèles avec une pompe à seringue, le système de vide et de laisser une ligne ouverte pour l'entrée des neutrophiles. Insérer la chambre d'écoulement au-dessus de la plaque et fixer l'ensemble formant chambre d'écoulement 13. (Voir Figure 1)
- Démarrez le programme d'enregistrement vidéo sur l'ordinateur connecté to le microscope. Réglez le champ et du microscope jusqu'à ce que le champ libre avec des cellules HUVEC à maturité ou un champ dans la région de revêtement de ligand est visible.
- Utilisation de la pompe à seringue, rincer la chambre d'écoulement avec du milieu RPMI. Assurez-vous qu'il n'y a pas de bulles d'air dans la chambre ou la ligne d'entrée des neutrophiles.
- Si vous le souhaitez, les neutrophiles peuvent être apprêtées avec une faible dose (10 -8 M) fMLP pendant 10 min. Cela permettra une adaptation du niveau basal de l'activation des neutrophiles entre 14 donneurs différents.
- Utiliser la pompe à seringue pour injecter des neutrophiles dans la chambre d'écoulement à des vitesses déterminées (une vitesse de 350 ul / min, ce qui correspond à une contrainte de cisaillement de 1,5 dynes / cm 2 est utilisé dans la présente étude). Enregistrer de la vidéo. Étant donné que l'adhésion des neutrophiles peut se produire rapidement, une vidéo d'une longueur de 4 à 5 min est généralement suffisante pour quantifier des événements d'adhésion pour l'analyse.
- Une cellule adhérente est définie comme une cellule qui se déplace de moins d'un diamètre de celluledans les 5 secondes sur la HUVEC ou ligand surface revêtue 15,16. Compter le nombre total de cellules adhérentes dans le champ présent dans la vidéo enregistrée à l'aide de cette règle. Par l'enregistrement de vidéos de longueur similaires avec des neutrophiles de différents bailleurs de fonds, on peut calculer la adhérente cellules / min pour comparer les propriétés d'adhérence entre les différents bailleurs de fonds.
Representative Results
Des exemples de neutrophiles se lier à un ligand purifié (ICAM-1/P-Selectin) chambre d'écoulement revêtu (figure 2) ou de se lier à un essai de HUVEC revêtu chambre d'écoulement (figure 3) sont représentées des neutrophiles. Comme représenté sur les figures, les neutrophiles continuent à s'accumuler / adhérer à la surface revêtue ou les cellules HUVEC dans des conditions d'écoulement continu. Dans nos conditions expérimentales typiques, nous pouvons observer 50-70 neutrophiles humains qui adhère fermement à la surface revêtue ou HUVEC au cours d'une période d'enregistrement de quatre minutes. Cependant, les variants alléliques des molécules d'adhésion des neutrophiles, ou des variants alléliques dans le substrat (ligand purifié ou HUVEC), pourraient modifier sensiblement l'adhésion des neutrophiles quantitative 14.
Nous avons également évalué la dépendance temporelle des événements d'adhésion des neutrophiles observés dans nos études. Bien que nous maintenons conditions de débit constant, il est possible que les propriétés adhésives des cellules changent au fil du temps. Houtefois, sur les cours de temps relativement courts dans nos études, nous n'avons pas observé de différences constantes dans le taux d'adhérence au fil du temps. Par exemple, l'évaluation de l'adhérence au niveau des points de temps de 1 à 2 minutes par rapport à l'adhérence observée entre les points de temps de 3 à 4 min ne sont pas systématiquement différents. Bien sûr, si les cellules sont stimulées pendant l'expérience de l'adhérence, puis change de propriétés adhésives au fil du temps on pourrait s'attendre.
Dans nos études, nous avons contrôlé pour l'isolement activation des neutrophiles induite par amorçage intentionnellement les cellules à faible dose fMLP (10 -8 M) pendant 10 minutes avant d'étudier. Les cellules endothéliales (HUVEC dans nos études) exigent également l'activation avant upregulate molécule d'adhésion expression optimale cabinet d'adhésion des leucocytes. En l'absence de pré-traitement, les cellules endothéliales (HUVEC) appuieront très peu d'adhérence des neutrophiles. Dans nos études, nous avons utilisé 10 ng / ml de TNFa pour un traitement de 4 à 6 heures avant l'utilisation. IL-1β (10 ng / ml) et LPS (0,5 à 1 pg / ml) peuvent également être utilisés pour pré-activer les cellules endothéliales. Fait important, non traité HUVEC peut être utilisé comme témoin négatif pour faire en sorte que l'adhésion des cellules est provoquée par des interactions spécifiques de cellules neutrophiles-endothélial (médiés par le récepteur). En variante, des anticorps anti-récepteurs peuvent être utilisés pour bloquer les récepteurs spécifiques pour évaluer la spécificité de l'adhérence.
Figure 1. Configuration de la chambre de flux sur la platine du microscope. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Coups Figure 2 de l'écran à partir d'un échantillon vidéo de neutrophiles adhérant à ICAM-1/P-Selectin surface revêtue à des moments différents (A:. 0 point de temps, B: 1 point de temps min, C: 2 point de temps min et D: 4 min point de temps). La concentration de ICAM-1 est de 25 pg / ml et de P-sélectine est de 0,5 ug / ml. la vitesse d'écoulement de neutrophiles est de 350 ul / min avec une densité de cellules neutrophiles à 500 000 cellules / ml.
Coups Figure 3 de l'écran à partir d'un échantillon vidéo de neutrophiles adhérant à surface revêtue HUVEC à différents points de temps (A: 0 point de temps, B: 1 min point de temps, C: 2 points de temps min et D: 4 min point de temps)..la vitesse d'écoulement de neutrophiles est de 350 ul / ml avec une densité de cellules neutrophiles à 500 000 cellules / ml.
| Espèce | Emplacement | La contrainte de cisaillement (dynes / cm 2) |
| Humain | Artère caroid commune | 11.6 |
| Humain | Artère branchiale | 6.5 |
| Humain | Artère fémorale commune | 4.3 |
| Humain | Aorte surrénale | 7.3 |
| Humain | Aorte supracœliaque | 4.2 |
| Humain | Artère fémorale superficielle | 4.4 |
| Humain | Veinules | 0,5-5,0 |
| Humain | Rétiniennes premiers artérioles | 40,2 |
| Humain | Deuxième artérioles rétiniennes | 0,001 |
| Humain | Rétiniennes premiers veinules | 23.2 |
| Humain | Deuxième veinules rétiniennes | 0,43 |
| Chien | Artère caroid commune | 15,8 |
| Lapin | Artère caroid commune | 23,3 |
| Rat | Artère caroid commune | 46,6 |
| Souris | Artère caroid commune | 64,8 |
| Chien | Artère fémorale commune | 9.8 |
| Lapin | Artère fémorale commune | 156,8 |
| Rat | Artère fémorale commune | 65,9 |
Tableau 1. Exemple de cisaillement dans les différents organes et les différentes espèces.
* Résumé de références 13, 16, 19 et 20.
Discussion
Ce protocole oriente la séparation et l'isolement des neutrophiles peu activés pour la quantification attention de l'adhésion des neutrophiles dans des conditions de stress abruptes. L'adhésion des neutrophiles est un processus critique dans l'inflammation. Étant donné que des variants génétiques dans de multiples molécules dans ce processus ont été démontrées pour prédisposer au développement de la maladie auto-immune 1,2, un système de dosage capable d'évaluer quantitativement l'adhésion ferme des neutrophiles humaine n'est nécessaire. La méthode décrite dans ce protocole permet la détermination minutieuse et quantitative du potentiel adhésif cabinet de neutrophiles dans un environnement contrôlé in vitro sous contrainte de cisaillement. Cette méthode permet ainsi la comparaison directe de quantitative adhésion des neutrophiles entre les individus génotypés pour déterminer l'importance de la variation génétique dans des molécules d'adhésion 14.
Plusieurs étapes de cette méthode méritent un examen attentif de achievles résultats quantitatifs et e hautement reproductibles. Dans la préparation des cellules HUVEC, il est essentiel d'atteindre 100% de confluence des cellules avant de les utiliser dans la chambre d'écoulement. Pour l'utilisation de surfaces revêtues de ligand purifié, la région de revêtement de substrat ne doit jamais être laissé à sécher pour éviter la dénaturation du ligand. En outre, la préparation des neutrophiles humains est critique pour le succès de l'expérience. Les questions clés à isoler les neutrophiles du sang incluent la manutention en douceur en minimisant vortex pour éviter l'activation, en gardant les cellules à température ambiante (c'est à dire le sang ne doit pas être stocké sur glace et étapes de centrifugation doit être effectuée à la température ambiante) et en complétant l'isolement et l'expérience dans le moins de temps possible. Il existe des méthodes d'isolement des neutrophiles supplémentaires qui peuvent également être utilisés pour préparer des cellules pour ces dosages 17,18.
D'un point de vue pratique essais, adhérence par les neutrophiles humains fraîchement isolés doit être initié dans les 3-6 heures après la saignée participant. Que les neutrophiles sont extrêmement sensibles à la manipulation, temps prolongées entre la prise de sang et l'utilisation pourrait affecter les résultats du dosage. Attention, la détermination de la concentration cellulaire des neutrophiles avant le dosage de la chambre d'écoulement est également nécessaire pour obtenir des résultats précis et reproductibles.
Au cours de l'essai de la chambre d'écoulement, il est important de surveiller l'enregistrement vidéo avec soin pour s'assurer que la vitesse d'écoulement est uniforme et il n'y a pas de turbulence sur toute la longueur de l'expérience. Les variations de vitesses d'écoulement ou de la présence de turbulences qui nécessiteraient l'expérience répétée. Après l'expérience, il est également important d'évaluer les neutrophiles restants au microscope pour s'assurer que les neutrophiles sont pas agglutination. Agglutination à ce stade d'indiquer que les neutrophiles sont devenus activé qui pourraient modifier de manière significative la densité des neutrophiles au cours de l'expérience.
contenu "> La chambre d'écoulement crée une contrainte près homogène pure dans la chambre (τ = 6Qμ / (wh 2), où Q = débit, μ = viscosité dynamique, et w = largeur de la chambre d'écoulement, h = hauteur de la la chambre 15 d'écoulement). Dans nos études, nous avons utilisé un débit de 350 ul / min pour l'adhésion des neutrophiles, ce qui crée une contrainte de cisaillement de 1,5 dynes / cm 2 (p = 0,25 cm, h = 0,01 pouce, la viscosité de l'eau à 37 ° C (0,007 équilibre) a été utilisée comme une approximation de la viscosité de l'IPMB médias). Pour une chambre de flux spécifique, on peut changer le débit pour atteindre différents niveaux de contrainte de cisaillement pour imiter différentes conditions physiologiques. contrainte de cisaillement physiologique typique dans les vaisseaux sanguins humains est comprise entre 0,5-5,0 dynes / cm 13,16. peuvent Contrainte de cisaillement dans d'autres vaisseaux sanguins et d'autres animaux ont été énumérés dans le tableau 1 113,16,19 20.Bien que notre méthode a porté sur l'étude de l'adhésion de neutrophi humainels, ce procédé n'est pas limité aux neutrophiles et peut être facilement appliquée à l'adhérence ou des études de roulement d'autres types de cellules avec des modifications simples. De plus, les substrats de ce procédé peuvent être modifiés à des fins différentes.
Bien que ce protocole est facilement adaptable à différentes études, il existe certaines limites. Le protocole mis en œuvre ici nécessite grand nombre de cellules primaires pour l'analyse. Cela peut empêcher l'analyse des cellules primaires de petits animaux. En outre, la nécessité d'immobiliser les ligands d'adhésion purifiées dans une conformation active / disponible peut limiter la gamme de ligands. L'utilisation de protéines de fusion Fc améliore grandement les chances de réaliser la conformation du ligand approprié sur la surface de la plaque. Néanmoins, notre procédé présente une grande souplesse pour permettre l'analyse quantitative des événements d'adhésion. Ces études permettra d'améliorer grandement notre compréhension de paires récepteur-ligand adhérence, et l'importance de la fonction potentiel de variants génétiquesdans ces protéines, dans la pathogenèse de maladies humaines.
Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Ce travail est parrainé par l'Institut de recherche Lupus (NY, NY), NIH P01-AR49084, NIH R21-DA026956 et NIH UL1-TR00165. Nous remercions le Dr Robert P. Kimberly pour son soutien continu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Life technologies | 25200-056 | with Phenol Red |
| 2x Trypsin inhibitor | Life technologies | R-002-100 | |
| 35 mm tissue culture dish | Corning Inc. | 430165 | Standard Tissue Culture Treated Surface |
| 75 cm2 tissue culture flask | Corning Inc. | 430641 | Standard Tissue Culture Treated Surface |
| CCD camera | Dage-MTI | Model 300T-RC | |
| Cell freezing container | Biocision | BCS-045 | |
| EBM-2 | Lonza Inc. | CC-3156 | HUVEC growth basal medium |
| EGM-2 Bulletkit | Lonza Inc | CC-4176 | HUVEC growth factors for basal medium |
| FBS | Life technologies | 10082-147 | Certified, Heat Inactivated |
| Gelatin | Sigma | G9391 | from bovine skin |
| Hemacytometer | Fisher scientific | 02-671-51B | |
| Fibronectin | Sigma | F2006 | from human plasma |
| Flow chamber | Glyco Tech | 31-001 | Circular flow chamber for 35 mm dishes |
| fMLP | Sigma | 47729 | |
| Histopaque-11191 | Sigma | 11191 | Heavy Ficoll |
| HUVEC | Lonza Inc. | CC-2517A | |
| ICAM-1 | R&D Systems | 720-IC | Fc chimera |
| Lymphocyte separation medium | Mediatech Inc. | 25072CV | Light Ficoll |
| Microscope | Zeiss | Axiovert 100 | |
| RPMI 1640 medium | Life technologies | 11875 | with L-glutamine and Phenol Red |
| Protein A | Sigma | P6031 | resuspend in PBS |
| P-Selectin | R&D Systems | 137-PS | Fc chimera |
| Syringe pump | KD Scientific | KDS270 | |
| TNF-α | Life technologies | PHC3015 | Recombinant Human Protein |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Life technologies | 15250-061 |
References
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