Summary
En metode til kvantificering af neutrofiladhæsion rapporteret. Denne metode skaber en dynamisk flow miljø svarende til den, der forekommer i et blodkar. Det giver mulighed for undersøgelse af neutrofil adhæsion til enten oprensede adhæsionsmolekyler (ligand) eller endotelcelle substrat (HUVEC) i en sammenhæng, der svarer til in vivo-miljø med sheer stress.
Abstract
Neutrofil fast adhæsion til endotelceller spiller en kritisk rolle i inflammation i både sundhed og sygdom. Processen med neutrofil faste adhæsion involverer mange forskellige adhæsionsmolekyler, herunder medlemmer af β 2 integrinfamilien og deres modreceptorer af ICAM-familien. For nylig, naturligt forekommende genetiske varianter i både β 2 integriner og ICAM'er er rapporteret at være associeret med autoimmun sygdom. Således kvantitativ klæbende kapacitet af neutrofiler fra individer med forskellige allele former af disse adhæsionsmolekyler er vigtigt at studere i forhold til mekanismerne bag udviklingen af autoimmunitet. Vedhæftning studier i flowkammer systemer kan skabe et miljø med væske forskydningsspænding svarende til den observeret i blodkar miljø in vivo. Her præsenteres en fremgangsmåde ved hjælp af et flow kammer assaysystem til at studere de kvantitative klæbeegenskaber humant perifert blod neutrofils til human navlevene endotelceller (HUVEC), og oprensede ligand substrater. Med denne metode kan neutrofil klæbende kapacitet fra donorer med forskellige allelvarianter i adhæsionsreceptorer vurderes og sammenlignes. Denne metode kan også modificeres til at vurdere adhæsion af andre primære celletyper eller cellelinier.
Introduction
Genetiske varianter i begge β 2 integriner og i ICAM ligander er nu kendt for at være forbundet med udviklingen af autoimmune sygdomme 1,2. Fastlæggelsen af de funktionelle konsekvenser af disse varianter i celler fra individer med disse varianter er nødvendigt for vores forståelse af, hvordan disse varianter bidrager til autoimmun sygdom patogenese. Sådanne funktionelle undersøgelser giver mulighed for bestemmelse af de mekanismer, som naturligt forekommende genetiske varianter forme immunresponset i både sundhed og sygdom. I det konkrete eksempel med SLE, vi ved nu, at varianter i ITGAM (CD11), og dens ligand, ICAM-1, stærkt forbinder med udvikling af sygdom 1,2. Fordi neutrofiler er kritiske i inflammatoriske reaktioner kan den kvantitative undersøgelse af neutrofiladhæsion give mekanistiske indsigt i, hvordan genetiske varianter i ITGAM / ICAM ændre inflammation.
NeutropHil fast adhæsion til endothelceller (EF) er et stærkt reguleret proces, og spiller en afgørende rolle i inflammatoriske 3,4 svar. Firmaet vedhæftning af neutrofil følger indledende neutrofil rullende og fange på EF og i sidste ende kan resultere i sjælevandring in vivo. Disse processer involverer mange forskellige former for adhæsionsmolekyler, herunder ICAM-1, ICAM-2, P-selectin, E-selectin på endotelceller og β 2 integriner på neutrofile 5-9. Således vil omhyggelig kvantificering af neutrofiladhæsion fra donorer med forskellige allele varianter af adhæsionsmolekyler være vigtigt at forstå de funktionelle og patologiske konsekvenser af disse genetiske varianter.
Eksperimenterende brug af et flow kammer kan skabe en in vitro-miljø med væske forskydningsspænding svarende til den observeret i blodkar miljø in vivo 10-12. Faktisk et flow kammer assay kombineret med menneskelig umbilical vene endotelcelle (HUVEC) kan efterligne in vivo-miljø i et blodkar. Ved hjælp af denne metode kan man studere de samlede cellulære klæbeegenskaber over endotelcelle. Desuden stærkt kontrolleret miljø af strømningskammeret giver også vurdering af cellebindende oprensede vedhæftning ligander, såsom ICAM-1 for at lette undersøgelsen af særlige receptor-ligand-interaktioner.
Vi præsenterer her en fremgangsmåde, der anvender en flow-kammer adhæsionsassay system til at studere de klæbende egenskaber af humane perifere neutrofiler blod til HUVEC og oprensede ligand substrater. Ved hjælp af denne metode med celler fra donorer, der udtrykker forskellige adhæsionsmolekyle allelvarianter giver os mulighed for at vurdere, hvordan disse genetiske varianter kan ændre human neutrofil firma vedhæftning.
Protocol
Alle donorer rekrutteret til denne undersøgelse gav skriftligt informeret samtykke, og undersøgelsen blev godkendt af University of Alabama i Birmingham Institutional Review Board.
1.. HUVEC Indledende Kultur og Subkultur
- Kultur humane navleveneendotelceller (HUVEC) in vitro i komplet vækstmedium, der består af endotelcelle basale medium (se liste over materialer) suppleret med endotheliale cellevækstfaktorer.
Bemærk: De vækstfaktorer anvendt i denne undersøgelse omfatter: 5 ng / ml human rekombinant epidermal vækstfaktor (hEGF), 1,0 mg / ml hydrocortison, 50 mg / ml Gentamicin og 50 ng / ml amphotericin-B (GA-1000), 2 % føtalt bovint serum (FBS), 0,5 ng / ml vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF), 10 ng / ml human fibroblastvækstfaktor-Basic med heparin (hFGF-B), 20 ng / ml human rekombinant insulin-lignende vækstfaktor ( R3-IGF-1), 1 ug / ml ascorbinsyre og 22,5 ug / ml heparin. Det komplette mediumfremstilles indledningsvist ved 37 ° C og kan derefter opbevares ved 4 ° C til anvendelse inden for 1 måned efter fremstillingen. - For at fremstille en kolbe for celler, er komplet vækstmedium tilsat til en 75 cm2 vævskultur-kolbe (1 ml / 5 cm2) og kolben får lov at ækvilibrere til 37 ° C / 5% CO2 i en fugtig inkubator i mindst 30 min. Humant HUVEC vil blive podet direkte i dette ækvilibreret dyrkningskolbe ved en densitet på 2,500-5,000 celler / cm2.
- Mens medierne er ækvilibrering hurtigt tø bestanden HUVEC cryovialet i et 37 ° C vandbad. Sprede celler i den oprindelige oplagring hætteglasset ved hvirvelbehandling og derefter tilføje dem direkte til kulturen kolbe indeholdende præækvilibreret HUVEC komplet vækstmedium for at opnå en densitet på 2,500-5,000 celler / cm2. Ryst forsigtigt kolben fordeler cellerne og derefter kolben tilbage til inkubatoren. Disse celler udgør nu den 1. passage. <li> Medium bør ændres hver to dage, indtil cellerne er 70-80% sammenflydende.
- Den HUVEC'er kan nu høstes fra kulturen kolben med trypsin / EDTA. Kulturmediet suges fra dyrkningskolberne efterfulgt af en PBS-skylning for at fjerne enhver resterende protein og calcium fra cellerne. Der tilsættes en 0,25% trypsin-EDTA-opløsning og inden for 2-6 min celle løsrivelse burde være indlysende som vurderet ved lysmikroskopi.
- Når 90% af cellerne rundes op fra pladen, stoppe trypsinisering ved tilsætning af et lige så stort volumen 2x trypsininhibitor. For at lette høsten af celler, tilføje en anden lige så stor mængde af komplet vækstmedium. Overfør løsnede celler til et sterilt 15 ml centrifugerør.
- Centrifuger de løsrevne celler ved 225 xg i 5 minutter ved stuetemperatur. Aspirer supernatanten, og cellerne resuspenderes i 2-3 ml komplet vækstmedium. Bestem cellekoncentrationen og levedygtighed under anvendelse af et hæmacytometer og trypanblåt.
- For at udnytte the høstede celler til undersøgelse, re-seed yderligere 75 cm 2 kolber med celler i en densitet på 10.000 celler / cm 2 og fortsæt til trin 2.2. Alternativt kan cellerne fryses på dette tidspunkt for fremtidige undersøgelser. For celle frysning pelletere cellerne ved centrifugering ved 225 xg i 5 minutter ved stuetemperatur. Aspirer supernatanten og resuspender cellepelleten i FBS indeholdende 10% DMSO ved en koncentration på 1 x 10 6 celler / ml. Cellesuspensionen overføres derefter til kryohætteglas og lagret ved -80 ° C efter frysning af cellerne i en celle-frysning beholder.
2.. HUVEC Layer Fremstilling
- Anvendelse af frosne 2. passage HUVEC'er: vækkelse og kultur. Hvis du bruger aktivt voksende celler, skal du fortsætte til trin 2.2.
- Optø kryoglas indeholdende 2 nd passage HUVEC'er fra trin 1.8 hurtigt i et 37 ° C vandbad. Overførsel af celler fra den cryovialet til et 15 ml sterilt centrifugerør og der tilsættes 10 ml vækst medium.
- Centrifuger cellerne ved 200 x g i 5 minutter ved stuetemperatur og aspireres supernatanten for at fjerne den resterende DMSO.
- Resuspender cellepelleten med komplet vækstmedium og overføre celler i en 75 cm2 kolbe. Tilføj vækstmedium til et samlet volumen omkring 20-25 ml og inkuberes ved 37 ° C / 5% CO2.
- Visuelt undersøge cellekultur for sammenløb hver dag med medieændringer hver to dage. Normalt inden for 2-4 dage, vil cellerne nå 80-90% konfluens, på hvilket tidspunkt de vil være klar til brug i strømningskammeret assay.
- For at forberede den kultur, parabol, der vil blive anvendt i strømmen kammer (se afsnit 5), der tilsættes 1 ml 10 mg / ml fibronectin og 0,05% (w / v) gelatine til en 35 mm vævskulturskål og pipette flere gange for at Kontroller, at hele pladen er belagt. Fjern overdreven fibronectin og gelatineopløsning og lufttørre pladen i mindst 30 minutter for at optimere proteinmatriksen formation. Den fibronectin og gelatine opløsning kan genbruges op til 10x.
- Høste HUVEC-celler fra trin 2.2 under anvendelse af trypsin-EDTA som beskrevet i trin 1.5-1.7. Frø 500.000 celler i hver overtrukket vævsdyrkningsskål. Tilsæt 2 ml vækstmedium i hver skål, og der inkuberes ved 37 ° C / 5% CO2.
- Tillad celler til at vokse til konfluens som i trin 2.2. Cellerne skal efterses dagligt med mellemstore ændringer hver to dage. Forud for strømningskammeret assay prime HUVEC med 20 ng / ml human TNF-α 4-6 timer til opregulere og stimulere adhæsion molekyle ekspression.
3.. Oprenset ligand Coating
- Tegn en cirkel 0,5 cm diameter, med en markør eller kuglepen i midten af en 35 mm vævskulturskål.
- Plate 20 ul 20 ug / ml protein A i det markerede område. Brug pipettespidsen sprede protein En opløsning til at dække hele området inden for 0,5 cm diameter cirkel. Det er vigtigt ikke at røre eller ridse overfladen af dish. Der inkuberes ved 37 ° C i 1 time.
- Vask protein-A-overtrukne plade 3x med 1 ml PBS (pH 8,0).
- Plate 50 gl 1% BSA i det markerede område for at blokere ikke-specifik binding på pladen. Inkuber i 2 timer ved 4 ° C.
- Vask de blokerede plade 3x med 1 ml PBS som i trin 3.3.
- Forbered Fc-vedhæftning receptorliganden kimære protein løsninger til overfladebehandling. I dette eksperiment en ICAM-1/Fc kimære opløsning ved 25 ug / ml og en P-Selectin/Fc kimære 0.5 ug / ml i PBS (pH 8,0) blev anvendt.
- Coat markerede område med 50 pi substrat. Der inkuberes natten over ved 4 ° C. Skålen skal anvendes inden for to dage, og det coatede område bør ikke tillades at tørre ud. Tilføj PBS om nødvendigt for at opretholde 50 ul opløsning på pladen.
4.. Neutrofil Separation (Alle trin udføres ved stuetemperatur)
- Efter opnåelse af informeret samtykke, indsamle deltager blod ved tapning i enn antikoagulerende blodopsamlingsrør eller vacutainer (EDTA eller heparin). Efter tapning fortynde blodet 1:1 med PBS før adskillelse.
- Forbered en tolags Ficoll til adskillelse PBMC og neutrofiler i 50 ml centrifugerør. Først tilsættes 15 ml tung Ficoll (se liste over materialer, ρ = 1,118 til 1,120), og derefter forsigtigt lag 10 ml lys Ficoll (se liste over materialer, ρ = 1,077-1,080) oven på den tunge Ficoll. Der bør være en skarp grænse mellem lys Ficoll og tunge Ficoll lag. Endelig omhyggeligt lag 25 ml af den fortyndede blodprøve på toppen af lyset Ficoll uden at forstyrre Ficoll lag.
- Centrifuger røret ved 250 xg i 30 minutter ved stuetemperatur. Bemærk: Centrifugen rotorbremse skal være slukket for disse spin for at minimere potentielle forstyrrelser af cellen adskillelse under rotor deceleration ved slutningen af centrifugering. Efter centrifugering følgende lag (fra top til bund) er til stede: toplaget plasma følgenwed af PBMC lag oven på lyset Ficoll lag neutrofil lag med nogle røde blodlegemer (RBC) er mellem de lette og tunge Ficoll efterfulgt af tunge Ficoll lag og RBC'er i bunden af røret.
- Høst og overføre neutrofil lag i en ny 50 ml rør med en overførsel pipette PBS til et endeligt volumen på 50 ml og centrifugeres ved 225 xg i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Efter centrifugering kan der stadig være RBC'er blandet med neutrofiler. Aspirer supernatanten ned til 10 ml mærket. Resuspender neutrofil-RBC pellet ved forsigtig omrøring af røret (eller et kort lav hastighed vortexes) og derefter vaskes igen med 50 ml PBS.
- Efter den anden vask, aspireres supernatanten. For at fjerne forurenende RBC, resuspenderes de pelleterede celler i den resterende PBS ved omrøring (eller kort vortex), 25 ml H 2 O og forsigtigt vortex i 10 sek til at lysere RBC.
- Tilsæt 25 ml 1,8% NaCl og straks blandesved centrifugering ved 225 xg i 10 minutter ved stuetemperatur. Den kontaminerende RBC bør nu lyseres efterlader en hvid neutrofil cellepellet.
- Vask neutrofile cellepelleten med PBS.
- Resuspender isolerede neutrofiler i RPMI-medium med 10% FBS og bestemme koncentrationen af cellen under lysmikroskop med et hæmocytometer.
- Juster celledensiteten til 500.000 celler / ml med komplet RPMI-10% FBS-medium.
5.. Strømningskammeret adhæsionsassay
- Saml flowet kammeret. Anbring 35 mm skål indeholdende sammenflydende HUVEC'er eller oprensede vedhæftning receptorligander på mikroskop bordet. Tilslut parallel plade strømningskammeret med sprøjtepumpe, vakuum-system og efterlade en åben, for neutrofil input. Sæt flow kammer oven på pladen og fastgør strømningskammeret samling 13. (Se figur 1)
- Start videooptagelse program på computer tilsluttet to mikroskopet. Juster felt og fokus for mikroskopet, indtil en klar felt med fuldt udvoksede HUVEC celler eller et område inden for ligand belægningen regionen er synlig.
- Brug af sprøjtepumpen, skylles strømningskammeret med RPMI-medium. Sørg for at der ikke er luftbobler i kammeret eller neutrofile input linje.
- Hvis det ønskes, kan neutrofilerne grundes med lav dosis (10-8M) fMLP i 10 min. Dette vil muliggøre en matchning af det basale niveau af neutrofil aktivering mellem forskellige donorer 14.
- Brug sprøjtepumpen at injicere neutrofiler i strømningskammeret med definerede hastigheder (med en hastighed på 350 ul / min, hvilket svarer til en forskydningsspænding på 1,5 dyn / cm 2 anvendes i denne undersøgelse). Optag videoen. Fordi neutrofiladhæsion kan opstå hurtigt, en video med en længde på 4-5 min er normalt tilstrækkeligt at kvantificere vedhæftning arrangementer for analyse.
- En vedhængende celle er defineret som en celle, der bevæger sig mindre end en cellediameterinden for 5 sekunder på HUVEC eller ligand overflade 15,16. Tæl det samlede antal af vedhæftende celler i marken til stede i den optagede video ved hjælp af denne regel. Ved at optage tilsvarende længde videoer med forskellige donorer neutrofile, kan man beregne den vedhængende celler / min til at sammenligne vedhæftning mellem forskellige donorer.
Representative Results
Eksempler på neutrofil binding til en oprenset ligand (ICAM-1/P-Selectin) overtrukket strømningskammer (figur 2) eller neutrofil binding til en HUVEC overtrukket strømningskammer assay (figur 3) er vist. Som vist i figurerne, neutrofiler fortsætte med at akkumulere / klæbe til den overtrukne overflade eller HUVEC ved kontinuerlig strømning. Under vores typiske eksperimentforholdene, kan vi observere 50-70 humane neutrofiler fast klæber til coatede overflade eller HUVEC under en fire minutters optagetid periode. Men allelvarianter af neutrofile adhesionsmolekyler eller allelvarianter i underlaget (renset ligand eller HUVEC), væsentlig grad kunne ændre kvantitativ neutrofiladhæsion 14.
Vi har også vurderet tidsafhængigheden af neutrofiladhæsion begivenheder observeret i vore studier. Mens vi opretholde konstant strømning, er det muligt, at de klæbende egenskaber af cellerne ændrer sig over tid. However over den relativt korte tid kurser i vores studier, vi ikke observere nogen konsekvente forskelle i antallet af vedhæftning over tid. For eksempel, vurdere vedhæftning på 1-2 minutters tidspunkter i forhold til vedhæftning observeret mellem de 3-4 min tidspunkter er ikke konsekvent anderledes. Selvfølgelig, hvis cellerne bliver stimuleret under vedhæftning eksperiment skifter derefter i klæbeegenskaber over tid kan forventes.
I vores undersøgelser, vi kontrollerede til isolering induceret neutrofilaktivering ved bevidst priming cellerne med lav dosis fMLP (10 -8 M) i 10 min før at studere. Endotelceller (HUVEC i vores studier) kræver også forudgående aktivering for at opregulere adhæsionsmolekyleekspression for optimal leucocyte firma vedhæftning. I mangel af præ-behandling, vil endothelceller (HUVEC'er) støtter meget lidt neutrofiladhæsion. I vores undersøgelser har vi brugt 10 ng / ml TNFa behandling for 4-6 timer før brug. IL-1β (10 ng / ml) og LPS (0,5-1 ug / ml) kan også anvendes til at pre-aktivere endothelceller. Vigtigere er det, kan ubehandlet HUVEC anvendes som negativ kontrol for at sikre, at celleadhæsion er forårsaget af specifikke (receptor-medierede) neutrofil-endotel-celle interaktioner. Alternativt kan anti-receptor-antistoffer anvendes til at blokere specifikke receptorer for at vurdere specificitet vedhæftning.
Figur 1.. Flow kammer konfiguration på mikroskopbordet. Klik her for at se en større version af dette tal.
oad/51410/51410fig2.jpg "/>
. Figur 2. Screen shots fra en prøve video af neutrofiler klæber til ICAM-1/P-Selectin overflade på forskellige tidspunkter (A: 0 tidspunkt, B: 1 min tidspunkt, C: 2 min tidspunkt, og D: 4 min tidspunkt). Koncentrationen af ICAM-1 er 25 ug / ml og P-selectin er 0,5 ug / ml. Neutrofil flow hastighed er 350 ul / min med neutrofil densitet på 500.000 celler / ml.
. Figur 3 Screen shots fra en prøve video af neutrofiler klæber til HUVEC overflade på forskellige tidspunkter (A: 0 tidspunkt, B: 1 min tidspunkt, C: 2 min tidspunkt, og D: 4 min tidspunkt).Neutrofil flow hastighed er 350 ul / ml med neutrofil tæthed på 500.000 celler / ml.
| Arter | Placering | Forskydningsspænding (dyn / cm 2) |
| Menneskelige | Fælles caroid arterie | 11.6 |
| Menneskelige | Branchialfødder arterie | 6.5 |
| Menneskelige | Fælles femoralarterie | 4.3 |
| Menneskelige | Suprarenal aorta | 7.3 |
| Menneskelige | Supraceliac aorta | 4.2 |
| Menneskelige | Overfladisk fermoral arterie | 4.4 |
| Menneskelige | Venules | 0,5-5,0 |
| Menneskelige | Retinale første arterioler | 40.2 |
| Menneskelige | Retinale sekund arterioler | 0.001 |
| Menneskelige | Retinale første venules | 23.2 |
| Menneskelige | Retinale sekund venules | 0,43 |
| Hund | Fælles caroid arterie | 15.8 |
| Kanin | Fælles caroid arterie | 23.3 |
| Rotte | Fælles caroid arterie | 46,6 |
| Mus | Fælles caroid arterie | 64,8 |
| Hund | Fælles femoralarterie | 9.8 |
| Kanin | Fælles femoralarterie | 156,8 |
| Rotte | Fælles femoralarterie | 65,9 |
Tabel 1. Sample forskydningsspænding i forskellige organer og forskellige arter.
* Sammenskrevet fra referencer 13, 16, 19, og 20.
Discussion
Denne protokol guider adskillelse og isolation af minimalt aktiverede neutrofiler til omhyggelig kvantificering af neutrofiladhæsion under lutter stress. Neutrofiladhæsion er et kritisk proces i inflammation. Fordi genetiske varianter i flere molekyler i denne proces har vist sig at prædisponere for udvikling af autoimmun sygdom 1,2, er et assay-system er i stand til kvantitativt at vurdere human neutrofil faste adhæsion kræves. Det er beskrevet i denne protokol metode giver mulighed for omhyggelig og kvantitativ bestemmelse af firmaet klæbende potentiale af neutrofiler i et kontrolleret in vitro miljø under sheer stress. Denne fremgangsmåde tillader således direkte sammenligning af kvantitativ neutrofil adhæsion mellem genotypede individer for at bestemme betydningen af den genetiske variation i adhæsionsmolekyler 14.
Flere trin i denne metode fortjener omhyggelige overvejelser at achieve meget kvantitative og reproducerbare resultater. I HUVEC forberedelse, er det afgørende at nå 100% cellekonfluens før du bruger dem i strømmen kammeret. Ved hjælp af overflader coatet med oprenset ligand bør substratet overflade, aldrig få lov til at tørre ud for at undgå denaturering liganden. Hertil kommer, at fremstillingen af humane neutrofiler er afgørende for succes af eksperimentet. Centrale spørgsmål i isolere neutrofiler fra blod omfatter blidt håndtering ved at minimere vortex for at undgå aktivering, holder cellerne ved stuetemperatur (dvs. blodet ikke bør opbevares på is og centrifugering for trin skal udføres ved stuetemperatur) og udfylde isolation og forsøget i det mindste beløb af tid som muligt. Der er yderligere neutrofil isoleringsmetoder, der også kan anvendes til at fremstille celler til disse assays 17,18.
Fra et praktisk perspektiv adhæsionsassays hjælp frisk isolerede humane neutrofiler bør påbegyndes inden for 3-6 timer efter deltager tapning. Da neutrofiler er ekstremt følsomme over for håndtering, kan længere tid mellem blodprøve og brugen påvirke analyseresultater. Omhyggelig bestemmelse af neutrofil celle koncentration før strømningskammeret assayet er også nødvendigt at opnå nøjagtige og reproducerbare resultater.
Under strømningskammeret assay er det vigtigt at overvåge videooptagelsen omhyggeligt for at sikre, at strømningshastigheden er konsistent og der er ingen turbulens i hele længden af eksperimentet. Ændringer i strømningshastigheder eller tilstedeværelse af turbulens vil nødvendiggøre, at forsøget gentages. Efter eksperimentet, er det også vigtigt at vurdere de resterende neutrofiler mikroskopisk at sikre, at neutrofiler ikke klumpe. Sammenklumpning på dette tidspunkt tyder på, at de neutrofile er blevet aktiveret, som i væsentlig grad kunne ændre neutrofil tæthed under eksperimentet.
indhold "> strømningskammeret skaber en nær homogen ren og skær stress i kammeret (τ = 6Qμ / (WH 2), hvor Q = flow, μ = dynamisk viskositet, og w = bredde af flowet kammeret, h = højde strømningskammeret 15). I vores undersøgelser har vi anvendt en strømningshastighed på 350 gl / min for neutrofiladhæsion, hvilket skaber en ren belastning på 1,5 dyn / cm 2 (w = 0,25 cm, h = 0,01 inch, viskositeten af vand ved 37 ° C (0,007 poise) blev anvendt som en tilnærmelse af viskositeten af RMPI medier). For en bestemt flow kammer, kan man ændre flowet for at opnå forskellige niveauer af ren og skær stress at efterligne forskellige fysiologiske tilstande. Typisk fysiologisk forskydningsspænding i skibe humant blod kan varierer mellem 0,5-5,0 dyn / cm 13,16. Forskydningsspænding i andre blodkar og andre dyr blev anført i tabel 1 113,16,19 20.Mens vores metode har fokuseret på studiet af vedhæftningen af menneskelig neutrophils, er denne metode ikke begrænset til neutrofiler og kan nemt anvendes på vedhæftning eller rullende studier af andre celletyper med enkle ændringer. Desuden kan substraterne i denne fremgangsmåde ændres til forskellige formål.
Selv om denne protokol er let at tilpasse til forskellige undersøgelser, der er nogle begrænsninger. Protokollen som gennemført her kræver stort antal primære celler til analyse. Dette kan udelukke analyse af primære celler fra små dyr. Desuden kan behovet for at immobilisere rensede vedhæftning ligander i en aktiv / disponible konformation begrænse række ligander. Brugen af Fc-fusionsproteiner i høj grad øger chancerne for at opnå en ordentlig ligand kropsbygning på pladens overflade. Ikke desto mindre vores metode har en betydelig fleksibilitet til at tillade kvantitativ analyse af friktion begivenheder. Disse undersøgelser vil i høj grad øge vores forståelse af friktion receptor-ligand-par, og den potentielle funktion betydningen af genetiske varianteri disse proteiner, i patogenesen af sygdomme hos mennesker.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde er sponsoreret af Lupus Research Institute (NY, NY), NIH P01-AR49084, NIH R21-DA026956 og NIH UL1-TR00165. Vi takker Dr. Robert P. Kimberly for hans fortsatte støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Life technologies | 25200-056 | with Phenol Red |
| 2x Trypsin inhibitor | Life technologies | R-002-100 | |
| 35 mm tissue culture dish | Corning Inc. | 430165 | Standard Tissue Culture Treated Surface |
| 75 cm2 tissue culture flask | Corning Inc. | 430641 | Standard Tissue Culture Treated Surface |
| CCD camera | Dage-MTI | Model 300T-RC | |
| Cell freezing container | Biocision | BCS-045 | |
| EBM-2 | Lonza Inc. | CC-3156 | HUVEC growth basal medium |
| EGM-2 Bulletkit | Lonza Inc | CC-4176 | HUVEC growth factors for basal medium |
| FBS | Life technologies | 10082-147 | Certified, Heat Inactivated |
| Gelatin | Sigma | G9391 | from bovine skin |
| Hemacytometer | Fisher scientific | 02-671-51B | |
| Fibronectin | Sigma | F2006 | from human plasma |
| Flow chamber | Glyco Tech | 31-001 | Circular flow chamber for 35 mm dishes |
| fMLP | Sigma | 47729 | |
| Histopaque-11191 | Sigma | 11191 | Heavy Ficoll |
| HUVEC | Lonza Inc. | CC-2517A | |
| ICAM-1 | R&D Systems | 720-IC | Fc chimera |
| Lymphocyte separation medium | Mediatech Inc. | 25072CV | Light Ficoll |
| Microscope | Zeiss | Axiovert 100 | |
| RPMI 1640 medium | Life technologies | 11875 | with L-glutamine and Phenol Red |
| Protein A | Sigma | P6031 | resuspend in PBS |
| P-Selectin | R&D Systems | 137-PS | Fc chimera |
| Syringe pump | KD Scientific | KDS270 | |
| TNF-α | Life technologies | PHC3015 | Recombinant Human Protein |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Life technologies | 15250-061 |
References
- Harley, J. B., et al. Genome-wide association scan in women with systemic lupus erythematosus identifies susceptibility variants. in ITGAM, PXK, KIAA1542 and other. 40, 204-210 (2008).
- Kim, K., et al. Variation in the ICAM1-ICAM4-ICAM5 Locus Is Associated with Systemic Lupus Erythematosus Susceptibility in Multiple Ancestry Populations. Ann. Rheum. Diseases. 71 (11), 1809-1814 (2012).
- Ley, K. Molecular mechanism of leukocyte recruitment in the inflammatory process. Cardiovasc. Res. 32 (4), 733-742 (1996).
- Korthuls, R. J., Anderson, D. C., Granger, D. N. Role of neutrophil-endothelial cell adhesion in inflammatory disorders. J. Crit. Care. 9 (1), 47-71 (1994).
- Albelda, S. M., Smith, C. W., Ward, P. A. Adhesion molecules and inflammatory injury. FASEB J. 8 (8), 504-512 (1994).
- Smith, C. W., Marlin, S. D., Rothlein, R., Toman, C., Anderson, D. C. Cooperative interactions of LFA-1 and Mac-1 with intercellular adhesion molecule-1 in facilitating adherence and transendothelial migration of human neutrophils in vitro. J. Clin. Invest. 83 (6), 2008-2017 (1989).
- Marlin, S. D., Springer, T. A. Purified intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) is a ligand for lymphocyte function-associated antigen. Cell. 51 (5), 813-819 (1987).
- Lawrence, M. B., Springer, T. A. Leukocytes roll on a selectin at physiologic flow rates: Distinction from and prerequisite for adhesion through integrins. Cell. 65 (5), 859-873 (1991).
- Smith, C. W. Possible steps involved in the transition to stationary adhesion of rolling neutrophils: A brief review. Microcirculation. 7, 385-394 (2000).
- Usami, S., Chen, H. H., Zhao, Y., Chien, S., Skalak, R. Design and construction of a linear shear stress flow chamber. Ann. Biomed. Eng. 21 (1), 77-83 (1993).
- van Kooten, T. G., Schakenraad, J. M., Vander Mei, H. C., Busscher, H. J. Development and use of a parallel-plate flow chamber for studying cellular adhesion to solid surfaces. J. Biomed. Mater. Res. 26 (6), 725-738 (1992).
- Munn, L. L., Melder, R. J., Jain, R. K. Analysis of cell flow in the parallel plate flow chamber: Implications for cell capture studies. Biophys. J. 67, 889-895 (1994).
- Kucik, D. F. Measurement of Adhesion Under Flow Conditions. Current Protocols in Cell Biology. , 9.6.1-9.6.10 (2003).
- Zhou, Y., et al. Multiple Lupus Associated ITGAM Variants Alter Mac-1 Function on Neutrophils. Arthritis. Rheum. , (2013).
- Bacabac, R. G., et al. Dynamic shear stress in parallel-plate flow chambers. J. Biomech. 38 (1), 159-167 (2005).
- Kucik, D. F., Wu, C. Cell-Adhesion Assay. Methods in Molecular Biology. 294, 43-54 (2005).
- Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed,, Goosmann, U., C,, Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them. J Vis Exp. 36 (36), (2010).
- Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. J Vis Exp. (17), 745 (2008).
- Cheng, C., et al. Large variations in absolute wall shear stress levels within one species and between species. Atherosclerosis. 195 (2), 225-235 (2007).
- Nagaoka, T., Yoshida, A. Noninvasive evaluation of wall shear stress on retinal microcirculation in humans. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (3), 1113-1119 (2006).
