Summary
שיטה של quantitating הידבקות נויטרופילים היא מדווחת. שיטה זו יוצרת זרימת סביבה דינמית דומה לזו שנתקלה בה בכלי דם. זה מאפשר החקירה של הידבקות נויטרופילים לשתי מולקולות מטוהרים הידבקות (ליגנד) או מצע תא אנדותל (HUVEC) בהקשר דומה לסביבת in vivo עם לחץ העצום.
Abstract
הידבקות משרד נויטרופילים לתאי האנדותל ממלאת תפקיד קריטי בדלקת בשתי בריאות ומחלה. התהליך של הידבקות משרד נויטרופילים כרוך מולקולות הדבקה שונות, כולל בני משפחת integrin β 2 ונגד הקולטנים שלהם של משפחת ICAM. לאחרונה, וריאנטים גנטיים מתרחשים באופן טבעי בשני β 2 integrins וICAMs מדווחים להיות קשורים למחלה אוטואימונית. לפיכך, קיבולת הדבק כמותית של נויטרופילים מאנשים עם צורות allelic משתנות של מולקולות הדבקות אלה חשוב ללמוד ביחס למנגנוני התפתחות של אוטואימוניות. מחקרי הידבקות במערכות תא זרימה יכולים ליצור סביבה עם לחץ הגזירה נוזל דומה לזה שנצפה בסביבת כלי דם בגוף חי. כאן, אנו מציגים שיטה באמצעות מערכת תא זרימת assay כדי ללמוד את מאפייני הדבקה כמותית של נויטרופילים דם ההיקפיים אדםים לתא האנדותל וריד טבור אנושי (HUVEC) ומצעים ליגנד מטוהרים. בשיטה זו, ניתן להעריך את יכולות דבק נויטרופילים מתורמים עם גרסאות allelic שונות בקולטנים הידבקות והשוואה. שיטה זו יכולה גם להיות שונה כדי להעריך את ההידבקות של סוגי תאים עיקריים אחרים או שורות תאים.
Introduction
וריאנטים גנטיים בשני β 2 integrins ובligands ICAM כעת מוכרים להיות קשורים להתפתחות של 1,2 מחלה אוטואימונית. קביעת ההשלכות התפקודית של וריאנטים אלה בתאים שמקורם אנשים עם גרסאות אלה היא הכרחית להבנה של אופן שהגרסות אלה תורמות להיווצרות מחלה אוטואימונית שלנו. מחקרים פונקציונליים, כגון לאפשר לקביעת המנגנונים שבאמצעותם וריאנטים גנטיים מתרחשים באופן טבעי לעצב את התגובה החיסונית בשתי בריאות ומחלה. בדוגמא הספציפית של SLE, עכשיו אנחנו יודעים שגרסות בITGAM (CD11b) ויגנד, ICAM-1, חזק לקשר עם התפתחות מחלת 1,2. בגלל נויטרופילים הם קריטיים בתגובות דלקתיות, המחקר הכמותי של הידבקות נויטרופילים עשוי לספק תובנות מכניסטית לתוך כמה וריאנטים גנטיים בITGAM / ICAM לשנות את דלקת.
NeutropHIL הידבקות משרד לתאי אנדותל (EC) הוא תהליך מוסדר מאוד וממלא תפקיד חיוני בתגובות דלקתיות 3,4. הידבקות החברה של נויטרופילים כדלקמן מתגלגלת ראשוניים נויטרופילים ולכידה על EC וסופו של דבר יכולה לגרום לגלגול in vivo. תהליכים אלה כרוכים בסוגים רבים של מולקולות הדבקות, כולל ICAM-1, ICAM-2, P-selectin, E-selectin בתאי האנדותל וβ 2 integrins על נויטרופילים 5-9. לפיכך, כימות זהיר של הידבקות נויטרופילים מתורמים עם גרסאות allelic שונות של מולקולות הדבקות יהיה חשוב להבין את ההשלכות תפקודיות ופתולוגית של ווריאנטים גנטיים אלה.
שימוש ניסיוני של תא זרימה יכול ליצור סביבה במבחנה עם לחץ הגזירה נוזל דומה לזה שנצפה בסביבת כלי דם בvivo 10-12. ואכן, assay תא זרימה בשילוב עם umbili אדםתא קאל אנדותל הווריד (HUVEC) יכול לחקות את סביבת vivo של כלי דם. באמצעות שיטה זו, ניתן ללמוד את מאפייני דבק סלולריים כוללים כלפי תא האנדותל. בנוסף, הסביבה מבוקרת מאוד של תא הזרימה מאפשרת גם הערכה של תא מחייבת לליגנד הידבקות מטוהר כגון ICAM-1 כדי להקל על המחקר של אינטראקציות רצפטור ליגנד ספציפיות.
אנו מציגים כאן שיטת ניצול מערכת assay תא זרימת הידבקות ללמוד את מאפייני ההדבקה של הנויטרופילים בדם היקפיים אדם לHUVEC ומצעים ליגנד מטוהרים. שימוש בשיטה זו בתאים מתורמים להביע גרסאות allelic מולקולת הידבקות שונות מאפשרת לנו להעריך כיצד וריאנטים הגנטיים אלה יכולים לשנות את הידבקות משרד נויטרופילים אנושית.
Protocol
כל התורמים שגויסו למחקר זה נתנו הסכמה מדעת בכתב והמחקר אושר על ידי אוניברסיטת אלבמה בבירמינגהם מוסדית המועצה לביקורת.
1. HUVEC תרבות ותת ראשוניות
- תאי תרבות אנושיים טבור וריד אנדותל (HUVEC) במבחנה במדיום גידול שלם שמורכב ממדיום של תאים הבזליים אנדותל (ראו רשימה של חומרים) בתוספת גורמי גדילת תא האנדותל.
הערה: גורמי הגדילה בשימוש במחקר זה כוללים: רקומביננטי אדם 5 ng / ml עוריות Growth Factor (hEGF), הידרוקורטיזון 1.0 מ"ג / מיליליטר, 50 מ"ג / מיליליטר גנטמיצין ו50 ng / ml amphotericin-B (GA-1000), 2 % שור סרום עוברי (FBS), 0.5 ng / ml אנדותל כלי הדם Growth Factor (VEGF),, פקטור 10 ng / ml אנושי פיברובלסטים Growth Factor-Basic עם הפרין (hFGF-B) 20 ng / ml אנושי רקומביננטי גדילה דמוי אינסולין ( R 3-IGF-1), 1 מיקרוגרם / מיליליטר חומצה אסקורבית, ו22.5 מיקרוגרם / מיליליטר הפרין. הבינוני המלאההוא הוכן בתחילה על 37 מעלות צלזיוס ואז יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס לשימוש בתוך החודש 1 של הכנה. - כדי להכין בקבוק לתאים, צמיחה בינונית מלאה מתווסף לבקבוק 75 2 סנטימטר בתרבית רקמה (1 מיליליטר / 5 סנטימטר 2) ולאחר מכן את הבקבוק מותר לאזן ל37 ° C / 5% CO 2 באינקובטור humidified עבור לפחות 30 דקות. HUVEC אדם יהיה זרע ישירות לתוך בקבוק תרבות equilibrated זה בצפיפות של 2,500-5,000 תאים / 2 סנטימטר.
- בעוד התקשורת היא equilibrating, להפשיר במהירות cryovial HUVEC המניה באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. לפזר את התאים בבקבוקון האחסון המקורי על ידי vortexing ולאחר מכן להוסיף אותם ישירות לבקבוק התרבות המכיל מדיום גידול equilibrated מראש HUVEC השלם כדי להשיג צפיפות של 2,500-5,000 תאים / 2 סנטימטר. נער בעדינות את הבקבוק כדי לפזר באופן שווה את התאים ולאחר מכן להחזיר את הבקבוק לחממה. תאים אלה מהווים כיום את מעבר 1 st. <li> בינוני צריכים להיות שונה בכל יומיים עד שהתאים הם מחוברות 70-80%.
- כעת ניתן לקצור HUVECs מהבקבוק התרבות עם טריפסין / EDTA. התקשורת והתרבות היא להישאף מצלוחיות התרבות ואחרי שטיפת PBS להסיר כל חלבון וסידן שנותר בתאים. פתרון טריפסין-EDTA 0.25% נוסף ובתוך 2-6 ניתוק תא דקות צריכים להיות ברור כפי שהוערך על ידי מיקרוסקופ אור.
- כאשר 90% מהתאים מעוגלים כלפי מעלה מהצלחת, לעצור את trypsinization ידי הוספת נפח שווה של מעכבי טריפסין 2x. כדי להקל על הקציר של תאים, להוסיף עוד כמות שווה של מדיום גידול שלם. להעביר את התאים מנותקים לצינור צנטריפוגות 15 מיליליטר סטרילי.
- צנטריפוגה התאים המנותק ב225 XG במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. לשאוב supernatant, ולאחר מכן resuspend התאים 2-3 מיליליטר של מדיום גידול שלם. קבע את ריכוז תא ואת הכדאיות באמצעות hemacytometer וTrypan כחול.
- לנצל הדואר נקטף תאים למחקר, מחדש זרע 75 סנטימטר נוסף 2 צלוחיות עם תאים בצפיפות של 10,000 תאים / 2 סנטימטר והמשך לשלב 2.2. לחלופין, אפשר להקפיא תאים בשלב זה למחקרים עתידיים. להקפאת תאים, גלולה התאים על ידי צנטריפוגה ב225 XG במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. לשאוב את supernatant ו resuspend התא גלולה ב FBS המכיל DMSO 10% בריכוז של 1 x 10 6 תאים / מיליליטר. ההשעיה התא הוא הועבר לאחר מכן לcryovials ומאוחסנות ב -80 מעלות צלזיוס לאחר ההקפאה של התאים במכל הקפאת תאים.
2. הכנת שכבת HUVEC
- שימוש בHUVECs מעבר 2 nd הקפוא: תחייה ותרבות. אם אתם משתמשים בתאים גדלים באופן פעיל, המשך לשלב 2.2.
- להפשיר את cryovial המכילה 2 HUVECs מעבר nd מצעד 1.8 במהירות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. העבר את התאים מcryovial לצינור צנטריפוגות סטרילי 15 מיליליטר ולהוסיף 10 מיליליטר Medi צמיחהאממ.
- צנטריפוגה התאים ב XG 200 במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר ולשאוב supernatant כדי להסיר את DMSO שיורית.
- Resuspend התא גלולה עם מדיום גידול שלם ולהעביר את התאים לתוך בקבוק 75 2 סנטימטר. הוסף בינוני צמיחה להיקף כולל על 20-25 מ"ל ולדגור על 37 ° C / 5% CO 2.
- לבחון חזותי את תרבית התאים למפגש כל יום עם שינויים בתקשורת בכל יומיים. בדרך כלל בתוך 2-4 ימים, תאים יגיעו 80-90 מפגש% בו בזמן שהם יהיו מוכנים לשימוש בassay תא זרימה.
- כדי להכין את המנה התרבות שתשמש בחדר הזרימה (ראה סעיף 5), להוסיף 1 מיליליטר של 10 מיקרוגרם / מיליליטר פיברונקטין ו0.05% (w / v) ג'לטין לצלחת 35 מ"מ רקמת תרבות וטפטף מספר פעמים על מנת להפוך את בטוח שכל שטח הצלחת מצופה. הסר את פתרון פיברונקטין וג'לטין מוגזם ואוויר יבש הצלחת לפחות 30 דקות כדי לייעל את היווצרות מטריצת החלבון. ופתרון ibronectin וג'לטין עשוי להיות בשימוש חוזר עד 10x.
- קציר תאי HUVEC משלב 2.2 באמצעות טריפסין-EDTA כפי שמתואר ב1.5-1.7 צעדים. זרעי 500,000 תאים לכל צלחת תרבית רקמה מצופה. הוסף 2 מיליליטר בינוני צמיחה בכל מנה ולדגור על 37 ° C / 5% CO 2.
- לאפשר לתאים לגדול למפגש כמו בשלב 2.2. תאים יש לבדוק מדי יום מבחינה ויזואלית עם שינויים בינוניים כל יומיים. לפני assay תא זרימה, ראש HUVEC עם 20 TNF-α ng / ml אדם ל4-6 שעות לupregulate ולעורר ביטוי מולקולת הידבקות.
3. מטוהר ליגנד ציפוי
- צייר מעגל של 0.5 קוטר סנטימטר עם סמן או עט במרכז צלחת תרבית רקמת 35 מ"מ.
- 20 μl צלחת 20 חלבון מיקרוגרם / מיליליטר באזור המסומן. השתמש בקצה פיפטה כדי להפיץ את חלבון פתרון כדי לכסות את האזור כולו במעגל בקוטר 0.5 סנטימטר. חשוב שלא לגעת או לגרד את פני השטח של דאיש. לדגור על C ° 37 במשך שעה 1.
- שטוף-חלבון 3x צלחת מצופה עם 1 מיליליטר של PBS (pH 8.0).
- צלחת 50 μl BSA 1% באזור המסומן לחסום הלא ספציפי מחייב את הצלחת. דגירה עבור שעה 2 ב 4 ° C.
- לשטוף 3x הצלחת החסום עם 1 מיליליטר של PBS כמו בשלב 3.3.
- הכן את פתרונות חלבון chimeric יגנד רצפטור FC-הידבקות לציפוי. בניסוי זה, פתרון ICAM-1/Fc הכימרה ב25 מיקרוגרם / מיליליטר והכימרה P-Selectin/Fc ב0.5 מיקרוגרם / מיליליטר PBS (pH 8.0) היה בשימוש.
- מעיל האזור המסומן ב50 μl של מצע. דגירה הלילה בשעה 4 ° C. יש להשתמש במנה בתוך יומיים והאזור המצופה לא צריך להיות מותר להתייבש. הוסף PBS במידת צורך כדי לשמור על פתרון 50 μl על הצלחת.
4. הפרדת נויטרופילים (כל השלבים מבוצע בטמפרטורת חדר)
- לאחר קבלת הסכמה מדעת, לאסוף דם משתתף ידי phlebotomy לתוךצינור n קרישת איסוף דם או Vacutainer (EDTA או הפרין). לאחר איסוף דם, לדלל את דם 1:01 עם PBS לפני ההפרדה.
- הכן שכבת Ficoll שתי להפרדה PBMC ונויטרופילים ב50 צינורות צנטריפוגה מיליליטר. להוסיף ראשון 15 מיליליטר Ficoll הכבד (ראה רשימה של חומרים, ρ = 1.118-1.120), ולאחר מכן שכבה בזהירות 10 מיליליטר להדליק Ficoll (ראה רשימה של חומרים, ρ = 1.077-1.080) על גבי Ficoll הכבד. לא צריך להיות גבול ברור בין Ficoll האור ושכבות Ficoll כבדים. לבסוף, שכבה בזהירות 25 מיליליטר של דגימת הדם המדולל על גבי Ficoll האור מבלי להפריע את שכבת Ficoll.
- צנטריפוגות הצינור ב250 XG במשך 30 דקות בטמפרטורת חדר. הערה: בלם הרוטור צנטריפוגות צריך להיות מחוץ לספינים האלה כדי לצמצם את השיבוש אפשרי של הפרדת התאים במהלך האטת הרוטור בסוף צנטריפוגה. לאחר צנטריפוגה, השכבות הבאות (מלמעלה למטה) נוכחים: השכבה העליונה היא follo הפלזמהנישא על ידי שכבת PBMC על גבי שכבת Ficoll אור, שכבת נויטרופילים עם מעט תאי דם אדומים (RBC) היא בין האור וFicoll הכבדה ואחריו השכבה הכבדה Ficoll וRBCs בחלק התחתון של הצינור.
- קציר ולהעביר את שכבת נויטרופילים לתוך צינור חדש 50 מיליליטר עם טפטפת העברה, להוסיף PBS לנפח סופי של 50 מיליליטר ו צנטריפוגות ב XG 225 ל10 דקות בטמפרטורת חדר.
- לאחר צנטריפוגה, יש עדיין עשוי להיות תאי דם אדומים מעורבבים עם נויטרופילים. לשאוב supernatant אל 10 מיליליטר הסימן. Resuspend את כדור נויטרופילים-RBC על ידי תסיסה עדינה של הצינור (או vortexing מהירות נמוכה קצר) ולאחר מכן לשטוף שוב עם 50 מיליליטר של PBS.
- לאחר לשטוף את השני, לשאוב supernatant. כדי להסיר את תאי הדם האדומים לזהם, resuspend תאי pelleted בPBS שיורית על ידי תסיסה (או vortexing הקצר), להוסיף 25 מיליליטר H 2 O ועדינות מערבולת 10 שניות לlyse RBC.
- הוסף 25 מיליליטר של .1.8% NaCl ומייד לערבבעל ידי צנטריפוגה ב225 XG במשך 10 דקות בטמפרטורת חדר. עכשיו צריך להיות lysed RBC לזהם עוזב תא גלולה נויטרופילים לבנים.
- שטוף את התא גלולה נויטרופילים עם PBS.
- Resuspend נויטרופילים המבודדים במדיום RPMI עם FBS 10% ולקבוע את ריכוז התאים תחת מיקרוסקופ אור עם hemocytometer.
- התאם את צפיפות התאים ל -500,000 תאים / מיליליטר עם שלמים RPMI-10% בינוניים FBS.
5. תזרים לשכת הידבקות Assay
- להרכיב את תא הזרימה. מניחים את צלחת 35 מ"מ המכילה HUVECs המחוברות או ligands קולט הידבקות מטוהר על שולחן מיקרוסקופ. חבר את זרימת צלחת הקאמרית מקביל למשאבת מזרק, שואב אבק ולהשאיר קו אחד פתוח לקלט נויטרופילים. הכנס את תא הזרימה על גבי הצלחת ולהדק את תא זרימת ההרכבה 13. (ראה איור 1)
- הפעל את תכנית הקלטת וידאו על לא מחשב המחוברo למיקרוסקופ. התאם את השדה ואת המיקוד של מיקרוסקופ עד שדה ברור עם תאי HUVEC גדלו באופן מלא או שדה בתוך אזור ציפוי יגנד הוא גלוי לעין.
- באמצעות משאבת המזרק, יש לשטוף את תא הזרימה עם מדיום RPMI. ודא שאין בועות אוויר בתוך התא או שורת קלט נויטרופילים.
- אם תרצה, נויטרופילים עשויים להיות דרוכים עם מינון נמוך fMLP (10 -8 M) למשך 10 דקות. זה יאפשר התאמה של הרמה הבסיסית של הפעלת נויטרופילים בין תורמים שונים 14.
- השתמש במשאבת המזרק כדי להזריק נויטרופילים לתא הזרימה במהירויות מוגדרות (מהירות של 350 μl / min, אשר שוות מאמץ גזירה של 1.5 dynes / 2 סנטימטר משמש במחקר זה). להקליט וידאו. בגלל הידבקות נויטרופילים יכולה להתרחש במהירות, וידאו באורך של 4-5 דקות בדרך כלל מספיק כדי לכמת אירועי הידבקות לניתוח.
- תא חסיד מוגדר כתא שזז בקוטר תא פחות מאחדתוך 5 שניות על HUVEC או משטח יגנד המצופה 15,16. לספור את המספר הכולל של תאים חסיד בתחום קיים בוידאו שהוקלט באמצעות הכלל הזה. על ידי הקלטת קטעי וידאו באורך דומה עם נויטרופילים של תורמים שונים, אפשר לחשב את התאים / דקות חסיד להשוות את מאפייני ההדבקה בין תורמים שונים.
Representative Results
דוגמאות של נויטרופילים מחייבות ליגנד מטוהר (ICAM-1/P-Selectin) תא זרימה מצופה (איור 2) או של נויטרופילים מחייבים HUVEC assay תא זרימה מצופה (איור 3) מוצגים. כפי שניתן לראות בדמויות, נויטרופילים ימשיכו לצבור / לדבוק משטח המצופה או HUVEC בתנאים של זרימה רציפה. בתנאי הניסוי הטיפוסיים שלנו, אנו יכולים לצפות 50-70 נויטרופילים אנושיים בתקיפות שמירה על המשטח המצופה או HUVEC במהלך תקופת הקלטה ארבע דקות. עם זאת, גרסאות allelic של מולקולות נויטרופילים הידבקות, או גרסאות allelic במצע (ליגנד מטוהר או HUVEC), יכולה לשנות באופן משמעותי הידבקות נויטרופילים כמותיים 14.
יש לנו גם להעריך את התלות של אירועי הידבקות נויטרופילים שנצפו במחקרים שלנו הזמן. בעוד אנו שמירה על תנאי זרימה מתמיד, זה אפשרי, כי מאפייני ההדבקה של התאים להשתנות עם הזמן. However, על קורסי זמן קצרים יחסית במחקרים שלנו, אנחנו לא שומרים שום הבדלים עקביים בשיעור ההידבקות לאורך זמן. לדוגמא, הערכת הידבקות ב1-2 נקודות הזמן דק בהשוואה להידבקות נצפתה בין נקודות הזמן דק '3-4 אינה שונה באופן עקבי. כמובן, אם תאים להיות מגורה במהלך ניסוי ההידבקות, אז שינויים במאפיינים דבקים לאורך זמן ניתן היו לצפות.
במחקרים שלנו, אנחנו בשליטה על הפעלת נויטרופילים מושרה בידוד במכוון תחול תאים עם המינון נמוך fMLP (10 -8 M) עבור 10 דקות לפני המחקר. תאי אנדותל (HUVEC במחקרים שלנו) גם דורשים הפעלה לפני upregulate ביטוי מולקולת הידבקות להידבקות משרד יקוציט אופטימלי. בהעדר הטיפול מראש, תאי אנדותל (HUVECs) יתמכו הידבקות נויטרופילים מעט מאוד. במחקרים שלנו, השתמשנו 10 ng / ml טיפול TNFα ל4-6 שעות לפני השימוש. IL-1β (10 ng / ml) ו גם LPS (0.5-1 מיקרוגרם / מיליליטר) יכול לשמש מראש להפעיל את תאי האנדותל. חשוב לציין, שלא טופל HUVEC יכול לשמש כביקורת שלילית על מנת להבטיח כי הידבקות תא נגרמת על ידי ספציפי אינטראקציות תא (בתיווך הקולטן) נויטרופילים-אנדותל. לחלופין, ניתן להשתמש בנוגדנים נגד הקולטן לחסימת קולטנים ספציפיים כדי להעריך את הספציפיות של הידבקות.
איור 1. תצורת תא זרימה על הבמה מיקרוסקופ. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
oad/51410/51410fig2.jpg "/>
יריות איור 2 מסך מוידאו מדגם של נויטרופילים דבקות ICAM-1/P-Selectin משטח מצופה בנקודות זמן שונות (:. 0 נקודת זמן, ב ': נקודת זמן 1 דקות, C: 2 נקודת זמן דק', ו-D: נקודת זמן 4 דק '). הריכוז של ICAM-1 הוא 25 מיקרוגרם / מיליליטר ו-P-selectin הוא 0.5 מיקרוגרם / מיליליטר. זרימת נויטרופילים מהירות היא 350 μl / min עם צפיפות נויטרופילים ב500,000 תאים / מיליליטר.
יריות איור 3 מסך מוידאו מדגם של נויטרופילים הקפדה על משטח HUVEC מצופה בנקודות זמן שונות (: 0 נקודת זמן, ב ': נקודת זמן 1 דקות, C: 2 נקודת זמן דק', ו-D: נקודת זמן 4 דק ')..זרימת נויטרופילים מהירות היא 350 μl / מיליליטר עם צפיפות נויטרופילים ב500,000 תאים / מיליליטר.
| מין | מקום | מאמץ גזירה (dynes / 2 סנטימטר) |
| אנושי | עורק caroid נפוץ | 11.6 |
| אנושי | עורק branchial | 6.5 |
| אנושי | עורק הירך נפוץ | 4.3 |
| אנושי | אב העורקים suprarenal | 7.3 |
| אנושי | אב העורקים Supraceliac | 4.2 |
| אנושי | עורק fermoral שטחי | 4.4 |
| אנושי | Venules | .5-5.0 |
| אנושי | arterioles הראשונה רשתית | 40.2 |
| אנושי | arterioles השנייה רשתית | 0.001 |
| אנושי | venules הראשונה רשתית | 23.2 |
| אנושי | venules השנייה רשתית | 0.43 |
| כלב | עורק caroid נפוץ | 15.8 |
| ארנב | עורק caroid נפוץ | 23.3 |
| עכברוש | עורק caroid נפוץ | 46.6 |
| עכבר | עורק caroid נפוץ | 64.8 |
| כלב | עורק הירך נפוץ | 9.8 |
| ארנב | עורק הירך נפוץ | 156.8 |
| עכברוש | עורק הירך נפוץ | 65.9 |
טבלת 1. מאמץ גזירה לדוגמא באיברים שונים ומינים שונים.
* סיכם מאזכור 13, 16, 19, ו20.
Discussion
פרוטוקול זה מנחה את ההפרדה ובידוד של נויטרופילים הופעלו מינימאלי לכימות זהירות של הידבקות נויטרופילים בתנאי לחץ העצום. הידבקות נויטרופילים היא תהליך קריטי בדלקת. מאחר וריאנטים גנטיים במולקולות רבות בתהליך הזה כבר הוכיחו לנטייה להתפתחות של מחלה אוטואימונית 1,2, נדרשת מערכת assay מסוגלת כמותית הערכת הידבקות משרד נויטרופילים אנושית. השיטה שתוארה בפרוטוקול זה מאפשרת הקביעה זהירה וכמותי של פוטנציאל הדבק האיתן של הנויטרופילים בסביבה מבוקרת במבחנה תחת לחץ העצום. שיטה זו ובכך מאפשרת ההשוואה הישירה של הידבקות נויטרופילים הכמותי בין אנשים genotyped כדי לקבוע את החשיבות של שונות גנטיות במולקולות הדבקת 14.
כמה שלבים בשיטה זו ראויות לשיקול דעת לשם השגהתוצאות כמותיות דואר מאוד לשחזור. בהכנת HUVEC, זה קריטי להשגה 100% מפגש תא לפני השימוש בהם בתא הזרימה. לשימוש במשטחים מצופים יגנד מטוהר, אזור ציפוי מצע לא צריך להיות מותר להתייבש כדי למנוע denaturing יגנד. בנוסף, ההכנה של נויטרופילים האנושיים היא קריטית להצלחה של הניסוי. נושאים מרכזיים בבידוד נויטרופילים מהדם כוללים בעדינות טיפול על ידי מזעור vortexing כדי להימנע מהפעלה, שמירה על התאים בטמפרטורת חדר (כלומר הדם לא צריך להיות מאוחסן בצעדים קרח וצנטריפוגה צריכה להתבצע בטמפרטורת חדר) והשלמת את הבידוד והניסוי בסכום של לפחות זמן אפשרי. ישנן שיטות בידוד נויטרופילים נוספות שיכול גם להיות מנוצל כדי להכין את התאים למבחנים אלה 17,18.
ממבחני פרספקטיבה, הידבקות מעשית באמצעות נויטרופילים אנושיים מבודדים טרי צריך להיות יזם בתוך 3-6 שעות לאחר phlebotomy המשתתף. כנויטרופילים רגישים במיוחד לטיפול, פעמים ממושכות בין תיקו הדם והשימוש עלולות להשפיע על תוצאות assay. קביעה זהירה של ריכוז תאי נויטרופילים לפני assay תא הזרימה היא גם הכרחית כדי להשיג תוצאות מדויקות ושחזור.
במהלך assay תא זרימה, חשוב לפקח על קלטת וידאו בקפידה כדי להבטיח שמהירות הזרימה עולה בקנה אחד, ואין מערבולת לכל אורך הניסוי. שינויים בזרימה במהירויות או הנוכחות של מערבולת יחייב שהניסוי יחזור על עצמו. לאחר הניסוי, חשוב גם להעריך את הנויטרופילים שנותרו מיקרוסקופי כדי להבטיח שהנויטרופילים אינם מקפצים. התקבצות בשלב זה היה מציין כי נויטרופילים הפכו הופעלו שיכולה לשנות באופן משמעותי את צפיפות נויטרופילים במהלך הניסוי.
תוכן "> תא הזרימה יוצר מתח ליד הומוגנית העצום בתוך החדר (τ = 6Qμ / (WH 2), שבו Q = קצב זרימה, μ = צמיגות דינמית, ו= רוחב w של תא הזרימה, H = גובה של תא זרימה 15). במחקרים שלנו, השתמשנו בקצב זרימה של 350 μl / min להידבקות נויטרופילים, דבר שיוצר לחץ העצום של 1.5 dynes / 2 סנטימטר (w = 0.25 סנטימטר, h = 0.01 פנימה, את הצמיגות של מים על 37 מעלות צלזיוס (0.007 יציבות) שימשה כקירוב לצמיגות של תקשורת RMPI). לתא זרימה ספציפי, ניתן לשנות את קצב הזרימה על מנת להשיג רמות של מתח צרוף שונות לחקות את התנאים פיסיולוגיים שונים. מאמץ גזירה פיסיולוגי אופייני בכלי דם אנושיים יכולים טווחים בין .5-5.0 dynes / סנטימטר 13,16. גזירת לחץ בכלי דם אחרים ובעלי חיים אחרים היו רשומים בטבלה 1 113,16,19 20.בעוד שהשיטה שלנו התמקדה במחקר של ההידבקות של neutrophi אדםls, שיטה זו אינה מוגבלת לנויטרופילים והוא יכול בקלות להיות מיושם על הידבקות או לימודים מתגלגלים של סוגי תאים אחרים עם שינויים פשוטים. כמו כן, מצעים בשיטה זו ניתן לשנות למטרות שונות.
למרות שפרוטוקול זה הוא להתאמה בקלות למחקרים שונים, יש כמה מגבלות. הפרוטוקול כפי שמיושם כאן דורש מספר גדול של תאים ראשוניים לניתוח. זה עלול למנוע ניתוח של תאים ראשוניים מבעלי חיים קטנים. בנוסף, הצורך לשתק ligands הידבקות מטוהר בקונפורמציה פעילה / ה עלול להגביל את הטווח של ligands. השימוש בחלבוני Fc היתוך משפר באופן משמעותי את הסיכויים להשגת קונפורמציה יגנד הנכון על פני השטח הצלחת. יחד עם זאת, יש השיטה שלנו גמישות משמעותית לאפשר לניתוח כמותי של אירועי הידבקות. מחקרים אלה ישפרו את ההבנה שלנו של זוגות הקולטן ליגנד הידבקות, ואת חשיבות פונקצית הפוטנציאל של וריאנטים גנטיים באופן משמעותיבחלבונים אלה, בפתוגנזה של מחלות בבני אדם.
Disclosures
יש המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו מומנה על ידי מכון המחקר לופוס (ניו יורק, ניו יורק), NIH P01-AR49084, NIH R21-DA026956 וNIH UL1-TR00165. אנו מודים לד"ר רוברט פ 'קימברלי להמשך התמיכה שלו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Life technologies | 25200-056 | with Phenol Red |
| 2x Trypsin inhibitor | Life technologies | R-002-100 | |
| 35 mm tissue culture dish | Corning Inc. | 430165 | Standard Tissue Culture Treated Surface |
| 75 cm2 tissue culture flask | Corning Inc. | 430641 | Standard Tissue Culture Treated Surface |
| CCD camera | Dage-MTI | Model 300T-RC | |
| Cell freezing container | Biocision | BCS-045 | |
| EBM-2 | Lonza Inc. | CC-3156 | HUVEC growth basal medium |
| EGM-2 Bulletkit | Lonza Inc | CC-4176 | HUVEC growth factors for basal medium |
| FBS | Life technologies | 10082-147 | Certified, Heat Inactivated |
| Gelatin | Sigma | G9391 | from bovine skin |
| Hemacytometer | Fisher scientific | 02-671-51B | |
| Fibronectin | Sigma | F2006 | from human plasma |
| Flow chamber | Glyco Tech | 31-001 | Circular flow chamber for 35 mm dishes |
| fMLP | Sigma | 47729 | |
| Histopaque-11191 | Sigma | 11191 | Heavy Ficoll |
| HUVEC | Lonza Inc. | CC-2517A | |
| ICAM-1 | R&D Systems | 720-IC | Fc chimera |
| Lymphocyte separation medium | Mediatech Inc. | 25072CV | Light Ficoll |
| Microscope | Zeiss | Axiovert 100 | |
| RPMI 1640 medium | Life technologies | 11875 | with L-glutamine and Phenol Red |
| Protein A | Sigma | P6031 | resuspend in PBS |
| P-Selectin | R&D Systems | 137-PS | Fc chimera |
| Syringe pump | KD Scientific | KDS270 | |
| TNF-α | Life technologies | PHC3015 | Recombinant Human Protein |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Life technologies | 15250-061 |
References
- Harley, J. B., et al. Genome-wide association scan in women with systemic lupus erythematosus identifies susceptibility variants. in ITGAM, PXK, KIAA1542 and other. 40, 204-210 (2008).
- Kim, K., et al. Variation in the ICAM1-ICAM4-ICAM5 Locus Is Associated with Systemic Lupus Erythematosus Susceptibility in Multiple Ancestry Populations. Ann. Rheum. Diseases. 71 (11), 1809-1814 (2012).
- Ley, K. Molecular mechanism of leukocyte recruitment in the inflammatory process. Cardiovasc. Res. 32 (4), 733-742 (1996).
- Korthuls, R. J., Anderson, D. C., Granger, D. N. Role of neutrophil-endothelial cell adhesion in inflammatory disorders. J. Crit. Care. 9 (1), 47-71 (1994).
- Albelda, S. M., Smith, C. W., Ward, P. A. Adhesion molecules and inflammatory injury. FASEB J. 8 (8), 504-512 (1994).
- Smith, C. W., Marlin, S. D., Rothlein, R., Toman, C., Anderson, D. C. Cooperative interactions of LFA-1 and Mac-1 with intercellular adhesion molecule-1 in facilitating adherence and transendothelial migration of human neutrophils in vitro. J. Clin. Invest. 83 (6), 2008-2017 (1989).
- Marlin, S. D., Springer, T. A. Purified intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) is a ligand for lymphocyte function-associated antigen. Cell. 51 (5), 813-819 (1987).
- Lawrence, M. B., Springer, T. A. Leukocytes roll on a selectin at physiologic flow rates: Distinction from and prerequisite for adhesion through integrins. Cell. 65 (5), 859-873 (1991).
- Smith, C. W. Possible steps involved in the transition to stationary adhesion of rolling neutrophils: A brief review. Microcirculation. 7, 385-394 (2000).
- Usami, S., Chen, H. H., Zhao, Y., Chien, S., Skalak, R. Design and construction of a linear shear stress flow chamber. Ann. Biomed. Eng. 21 (1), 77-83 (1993).
- van Kooten, T. G., Schakenraad, J. M., Vander Mei, H. C., Busscher, H. J. Development and use of a parallel-plate flow chamber for studying cellular adhesion to solid surfaces. J. Biomed. Mater. Res. 26 (6), 725-738 (1992).
- Munn, L. L., Melder, R. J., Jain, R. K. Analysis of cell flow in the parallel plate flow chamber: Implications for cell capture studies. Biophys. J. 67, 889-895 (1994).
- Kucik, D. F. Measurement of Adhesion Under Flow Conditions. Current Protocols in Cell Biology. , 9.6.1-9.6.10 (2003).
- Zhou, Y., et al. Multiple Lupus Associated ITGAM Variants Alter Mac-1 Function on Neutrophils. Arthritis. Rheum. , (2013).
- Bacabac, R. G., et al. Dynamic shear stress in parallel-plate flow chambers. J. Biomech. 38 (1), 159-167 (2005).
- Kucik, D. F., Wu, C. Cell-Adhesion Assay. Methods in Molecular Biology. 294, 43-54 (2005).
- Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed,, Goosmann, U., C,, Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them. J Vis Exp. 36 (36), (2010).
- Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. J Vis Exp. (17), 745 (2008).
- Cheng, C., et al. Large variations in absolute wall shear stress levels within one species and between species. Atherosclerosis. 195 (2), 225-235 (2007).
- Nagaoka, T., Yoshida, A. Noninvasive evaluation of wall shear stress on retinal microcirculation in humans. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (3), 1113-1119 (2006).
