Summary
न्युट्रोफिल आसंजन quantitating की विधि बताई गई है. यह विधि एक रक्त वाहिका में आई है कि इसी तरह एक गतिशील प्रवाह वातावरण बनाता है. यह अनुमति देता है शुद्ध आसंजन अणु (ligand) या सरासर तनाव के साथ vivo में पर्यावरण के लिए इसी तरह के एक प्रसंग में endothelial सेल सब्सट्रेट (HUVEC) में भी न्युट्रोफिल आसंजन की जांच.
Abstract
Endothelial कोशिकाओं को न्युट्रोफिल फर्म आसंजन स्वास्थ्य और बीमारी दोनों में सूजन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. न्युट्रोफिल फर्म आसंजन की प्रक्रिया β 2 integrin परिवार के सदस्यों और ICAM परिवार के अपने जवाबी रिसेप्टर्स सहित कई विभिन्न आसंजन अणुओं शामिल है. हाल ही में, दोनों में स्वाभाविक रूप से होने वाली आनुवंशिक वेरिएंट 2 integrins β और आईसीएएमएस autoimmune रोग के साथ जुड़े होने की सूचना है. इस प्रकार, इन आसंजन अणुओं की बदलती allelic रूपों के साथ व्यक्तियों से neutrophils की मात्रात्मक चिपकने क्षमता autoimmunity के विकास अंतर्निहित तंत्र के संबंध में अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण है. प्रवाह चैम्बर सिस्टम में आसंजन पढ़ाई vivo में रक्त वाहिका वातावरण में मनाया समान द्रव कतरनी तनाव के साथ एक वातावरण बना सकते हैं. यहाँ, हम मानव परिधीय रक्त न्युट्रोफिल की मात्रात्मक चिपकने वाला गुणों का अध्ययन करने के लिए एक प्रवाह चैम्बर परख प्रणाली का उपयोग कर एक विधि प्रस्तुतमानव नाल की शिरा endothelial सेल (HUVEC) को और शुद्ध ligand substrates के लिए. इस विधि के साथ, आसंजन रिसेप्टर्स में अलग allelic वेरिएंट के साथ दाताओं से न्युट्रोफिल चिपकने वाला क्षमताओं का आकलन किया और तुलना की जा सकती. यह विधि भी अन्य प्राथमिक प्रकार की कोशिकाओं या सेल लाइनों के आसंजन का आकलन करने के लिए संशोधित किया जा सकता है.
Introduction
दोनों β 2 integrins में और ICAM ligands में आनुवंशिक वेरिएंट अब autoimmune रोग 1,2 के विकास के साथ जुड़े होने के लिए पहचाने जाते हैं. इन वेरिएंट के साथ व्यक्तियों से ली गई कोशिकाओं में इन वेरिएंट के कार्यात्मक परिणाम के निर्धारण इन वेरिएंट autoimmune रोग रोगजनन में योगदान के बारे में हमारी समझ के लिए आवश्यक है. इस तरह कार्यात्मक अध्ययन स्वाभाविक रूप से होने वाली आनुवंशिक वेरिएंट स्वास्थ्य और बीमारी दोनों में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को आकार तंत्र है जिसके द्वारा के निर्धारण के लिए अनुमति देते हैं. SLE की विशिष्ट उदाहरण में, हम अब उस ITGAM (CD11b) में वेरिएंट पता है और इसके ligand, ICAM-1, दृढ़ता रोग 1,2 के विकास के साथ सहयोगी. Neutrophils भड़काऊ प्रतिक्रियाओं में महत्वपूर्ण होते हैं, क्योंकि न्युट्रोफिल आसंजन की मात्रात्मक अध्ययन ITGAM / ICAM में आनुवंशिक वेरिएंट सूजन को बदलने में कैसे यंत्रवत अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है.
Neutropकोशिकाओं (ईसी) endothelial को फर्म आसंजन एचआइएल एक उच्च विनियमित प्रक्रिया है और भड़काऊ प्रतिक्रियाओं 3,4 में एक आवश्यक भूमिका निभाता है. न्युट्रोफिल की फर्म आसंजन चुनाव आयोग पर प्रारंभिक न्युट्रोफिल रोलिंग और कब्जा के बाद और अंततः vivo में स्थानांतरगमन में परिणाम कर सकते हैं. इन प्रक्रियाओं ICAM-1 सहित आसंजन अणुओं के कई अलग अलग प्रकार, ICAM-2, पी selectin, ई selectin endothelial कोशिकाओं पर और न्युट्रोफिल 5-9 पर 2 integrins β शामिल है. इस प्रकार, आसंजन अणुओं की विभिन्न allelic वेरिएंट के साथ दाताओं से न्युट्रोफिल आसंजन की सावधान मात्रा का ठहराव इन आनुवंशिक वेरिएंट के कार्यात्मक और रोग परिणामों को समझने के लिए महत्वपूर्ण होगा.
एक प्रवाह चैम्बर की प्रयोगात्मक उपयोग विवो 10-12 में रक्त वाहिका वातावरण में मनाया समान द्रव कतरनी तनाव के साथ इन विट्रो वातावरण बना सकते हैं. दरअसल, एक प्रवाह चैम्बर परख मानव umbili के साथ मिलकरसीएएल शिरा endothelial सेल (HUVEC) एक रक्त वाहिका के vivo पर्यावरण नकल कर सकते हैं. इस विधि का प्रयोग, एक endothelial सेल की ओर समग्र सेलुलर चिपकने वाला गुणों का अध्ययन कर सकते हैं. इसके अलावा, प्रवाह चैम्बर की अत्यधिक नियंत्रित वातावरण भी सेल का आकलन इस तरह ICAM-1 विशिष्ट रिसेप्टर ligand बातचीत के अध्ययन की सुविधा के रूप में शुद्ध आसंजन ligands के लिए बाध्य करने की अनुमति देता है.
हम यहाँ HUVEC को और शुद्ध ligand substrates के लिए मानव परिधीय रक्त neutrophils की चिपकने वाला गुणों का अध्ययन करने के लिए एक प्रवाह चैम्बर आसंजन परख प्रणाली का उपयोग एक तरीका मौजूद है. विभिन्न आसंजन अणु allelic वेरिएंट व्यक्त दाताओं से कोशिकाओं के साथ इस पद्धति का उपयोग करके हमें इन आनुवंशिक वेरिएंट मानव न्युट्रोफिल फर्म आसंजन बदल सकते हैं आकलन कैसे कर सकते हैं.
Protocol
इस अध्ययन के लिए भर्ती सभी दाताओं लिखित सूचित सहमति दे दी है और अध्ययन बर्मिंघम संस्थागत समीक्षा बोर्ड में अलबामा के विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया था.
1. HUVEC प्रारंभिक संस्कृति और उपसंकृति
- Endothelial सेल बेसल मध्यम के शामिल है कि पूरा मध्यम विकास में इन विट्रो में संस्कृति मानव नाल की शिरा endothelial कोशिकाओं (HUVEC) endothelial सेल वृद्धि कारकों के साथ पूरक (माल की सूची देखें).
नोट: इस अध्ययन में इस्तेमाल वृद्धि कारकों में शामिल हैं: 5 एनजी / एमएल पुनः संयोजक मानव epidermal वृद्धि कारक (hEGF), 1.0 मिलीग्राम / एमएल hydrocortisone, 50 मिलीग्राम / एमएल gentamicin और 50 एनजी / एमएल Amphotericin बी (जीए -1000), 2 % भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 0.5 एनजी / एमएल संवहनी endothelial वृद्धि कारक (VEGF), 10 एनजी / एमएल मानव fibroblast वृद्धि हेपरिन (hFGF बी) के साथ फैक्टर बेसिक, 20 एनजी / एमएल पुनः संयोजक मानव इंसुलिन की तरह विकास फैक्टर ( आर 3 IGF-1), / एमएल एस्कॉर्बिक एसिड 1 ग्राम, और 22.5 ग्राम / एमएल हेपरिन. पूरा मध्यम37 डिग्री सेल्सियस पर शुरू में तैयार किया जाता है और फिर तैयारी के 1 महीने के भीतर उपयोग के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है. - कोशिकाओं के लिए एक कुप्पी तैयार करते हैं, पूरी मध्यम विकास एक 75 सेमी 2 टिशू कल्चर कुप्पी (1 मिलीग्राम / 5 सेमी 2) के लिए और फिर कुप्पी के लिए एक humidified इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ 2 को संतुलित करने की अनुमति दी गयी है, कम से कम 30 मिनट. मानव HUVEC / 2 सेमी 2,500-5,000 कोशिकाओं के घनत्व पर इस equilibrated संस्कृति फ्लास्क में सीधे वरीयता प्राप्त किया जाएगा.
- मीडिया equilibrating रहा है, जल्दी से एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में शेयर HUVEC cryovial पिघलना. Vortexing द्वारा मूल भंडारण शीशी में कोशिकाओं को फैलाने और फिर / 2 सेमी 2,500-5,000 कोशिकाओं के घनत्व को प्राप्त करने के लिए पूर्व equilibrated HUVEC पूरा मध्यम विकास युक्त संस्कृति फ्लास्क उन्हें सीधे जोड़ने. धीरे समान रूप से कोशिकाओं को वितरित करने और फिर इनक्यूबेटर कुप्पी लौटने के लिए फ्लास्क रॉक. इन कोशिकाओं को अब 1 सेंट पारित होने का प्रतिनिधित्व करते हैं. <कोशिकाओं 70-80% मिला हुआ हैं जब तक ली> मध्यम हर दो दिन बदला जाना चाहिए.
- HUVECs अब trypsin / EDTA के साथ संस्कृति कुप्पी से काटा जा सकता है. संस्कृति मीडिया कोशिकाओं से किसी भी अवशिष्ट प्रोटीन और कैल्शियम को दूर करने के लिए एक पीबीएस कुल्ला द्वारा पीछा संस्कृति बोतल से aspirated है. एक 0.25% trypsin EDTA समाधान जोड़ा जाता है और प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा मूल्यांकन के रूप में 2-6 मिनट सेल टुकड़ी के भीतर स्पष्ट होना चाहिए.
- कोशिकाओं के 90% की थाली से दूर गोल कर रहे हैं, 2x trypsin अवरोध करनेवाला के एक बराबर मात्रा जोड़कर trypsinization बंद करो. कोशिकाओं की फसल की सुविधा के लिए, पूर्ण मध्यम विकास की एक और बराबर राशि जोड़ें. एक बाँझ 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब अलग कोशिकाओं स्थानांतरण.
- कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 225 XG पर अलग कोशिकाओं अपकेंद्रित्र. सतह पर तैरनेवाला Aspirate, और फिर पूरा मध्यम विकास के 2-3 मिलीलीटर में कोशिकाओं resuspend. एक hemacytometer और Trypan ब्लू का उपयोग सेल एकाग्रता और व्यवहार्यता का निर्धारण.
- वें का उपयोग करने के लिएई अध्ययन के लिए कोशिकाओं को फिर से बीज अतिरिक्त 75 सेमी / 2 सेमी 10,000 कोशिकाओं के घनत्व पर कोशिकाओं के साथ 2 बोतल काटा और 2.2 कदम आगे बढ़ना. वैकल्पिक रूप से, कोशिकाओं भविष्य के अध्ययन के लिए इस बिंदु पर जमे हुए किया जा सकता है. सेल ठंड के लिए कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 225 XG पर centrifugation द्वारा गोली कोशिकाओं. सतह पर तैरनेवाला बंद महाप्राण और 1 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल के एक एकाग्रता में 10% DMSO युक्त FBS में सेल गोली resuspend. सेल निलंबन तो एक सेल ठंड कंटेनर में कोशिकाओं की ठंड के बाद cryovials को हस्तांतरित और -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाता है.
2. HUVEC परत तैयारी
- जमे हुए 2 एन डी बीतने HUVECs का प्रयोग करें: पुनरुद्धार और संस्कृति. सक्रिय रूप से बढ़ कोशिकाओं का उपयोग करते हैं, तो 2.2 कदम आगे बढ़ना.
- एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में जल्दी से कदम 1.8 से 2 एन डी बीतने HUVECs युक्त cryovial पहले गला लें. एक 15 मिलीलीटर बाँझ अपकेंद्रित्र ट्यूब cryovial से कोशिकाओं स्थानांतरण और 10 एमएल विकास मेडी जोड़उम.
- कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 200 XG पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र और अवशिष्ट DMSO दूर करने के लिए सतह पर तैरनेवाला aspirate.
- पूरा मध्यम विकास के साथ सेल गोली Resuspend और एक 75 सेमी 2 फ्लास्क में कोशिकाओं को हस्तांतरण. कुल मात्रा के बारे में 20-25 मिलीलीटर के लिए मध्यम विकास जोडें और 37 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ 2 पर सेते हैं.
- दिखने में मीडिया में परिवर्तन हर दो दिन के साथ एक दिन संगम के लिए सेल संस्कृति की जांच. आम तौर पर 2-4 दिनों के भीतर, कोशिकाओं वे प्रवाह चैम्बर परख में इस्तेमाल के लिए तैयार हो जाएगा, जो समय पर 80-90% संगम तक पहुंच जाएगा.
- प्रवाह चैम्बर में उपयोग किया जाएगा जो संस्कृति व्यंजन तैयार करने (धारा 5 देखें), बनाने के लिए 10 माइक्रोग्राम / एमएल fibronectin के 1 मिलीग्राम और 0.05% एक 35 मिमी टिशू कल्चर पकवान और विंदुक (w / v) जिलेटिन कई बार जोड़ यकीन है कि पूरी थाली सतह लेपित है. प्रोटीन मैट्रिक्स गठन अनुकूलन करने के लिए कम से कम 30 मिनट के लिए थाली सूखी अत्यधिक फ़ाइब्रोनेक्टिन और जिलेटिन समाधान और हवा निकालें. चibronectin और जिलेटिन समाधान 10x अप करने के लिए पुन: उपयोग किया जा सकता है.
- कदम 1.5-1.7 में वर्णित के रूप में trypsin-EDTA का उपयोग 2.2 कदम से HUVEC कोशिकाओं फसल. प्रत्येक लेपित टिशू कल्चर डिश में 500,000 कोशिकाओं बीज. प्रत्येक पकवान में 2 मिलीलीटर मध्यम विकास जोडें और 37 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ 2 पर सेते हैं.
- कोशिकाओं 2.2 कदम के रूप में संगम के लिए विकसित करने की अनुमति. कोशिकाओं नेत्रहीन मध्यम परिवर्तन हर दो दिनों से दैनिक निरीक्षण किया जाना चाहिए. पिछले प्रवाह चैम्बर परख करने के लिए, आसंजन अणु अभिव्यक्ति upregulate और प्रोत्साहित करने के लिए 4-6 घंटे के लिए 20 एनजी / एमएल मानव TNF-α साथ HUVEC प्रधानमंत्री.
3. शुद्ध Ligand कोटिंग
- एक 35 मिमी टिशू कल्चर डिश के केंद्र में एक मार्कर या कलम के साथ 0.5 सेमी व्यास का एक चक्र ड्रा.
- चिह्नित क्षेत्र में 20 माइक्रोग्राम / एमएल प्रोटीन एक की प्लेट 20 μl. प्रोटीन 0.5 सेमी व्यास सर्कल के भीतर पूरे क्षेत्र को कवर करने के लिए एक समाधान का प्रसार करने के पिपेट टिप का उपयोग करें. यह घ की सतह को छूने या खरोंच नहीं करने के लिए महत्वपूर्ण हैish. 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
- पीबीएस के 1 मिलीलीटर (8.0 पीएच) के साथ प्रोटीन एक लेपित थाली 3x धो लें.
- गैर विशिष्ट थाली पर बाध्यकारी ब्लॉक करने के लिए चिह्नित क्षेत्र में प्लेट 50 μl 1% BSA. 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए सेते
- 3.3 कदम के रूप में पीबीएस के 1 मिलीलीटर के साथ बंद थाली 3x धो लें.
- कोटिंग के लिए एफसी आसंजन रिसेप्टर ligand chimeric प्रोटीन समाधान तैयार करें. इस प्रयोग में, 25 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर में एक ICAM-1/Fc कल्पना समाधान और पीबीएस में 0.5 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर में एक P-Selectin/Fc कल्पना (पीएच 8.0) का उपयोग किया गया था.
- कोट सब्सट्रेट के 50 μl के साथ चिह्नित क्षेत्र. 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते पकवान दो दिनों के भीतर किया जाना चाहिए और लेपित क्षेत्र सूखे से बाहर करने के लिए अनुमति नहीं दी जानी चाहिए. थाली पर 50 μl समाधान बनाए रखने के लिए यदि आवश्यक हो तो पीबीएस जोड़ें.
4. न्युट्रोफिल पृथक्करण (कमरे के तापमान पर प्रदर्शन सभी चरण)
- सूचित सहमति प्राप्त करने के बाद, एक में शिराछदन द्वारा भागीदार रक्त एकत्रn थक्कारोधी रक्त संग्रह ट्यूब या vacutainer (EDTA या हेपरिन). रक्त संग्रह के बाद, जुदाई से पहले पीबीएस के साथ रक्त 01:01 पतला.
- 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में PBMC और neutrophils को अलग करने के लिए एक दो परत Ficoll तैयार करें. पहले 15 मिलीलीटर भारी Ficoll (माल की सूची, ρ = 1.118-1.120 देखें) जोड़ने के लिए, और फिर ध्यान से 10 मिलीलीटर भारी Ficoll के शीर्ष पर (माल की सूची, ρ = 1.077-1.080 देखें) Ficoll प्रकाश परत. प्रकाश Ficoll और भारी Ficoll परतों के बीच एक तेज सीमा होनी चाहिए. अंत में, ध्यान से Ficoll परत परेशान बिना प्रकाश Ficoll के शीर्ष पर पतला रक्त के नमूने की 25 मिलीलीटर की परत.
- कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए 250 XG पर ट्यूब अपकेंद्रित्र. नोट: इन spins centrifugation के अंत में रोटर मंदी के दौरान सेल जुदाई के संभावित विघटन कम से कम करने के लिए अपकेंद्रित्र रोटर ब्रेक बंद होना चाहिए. Centrifugation के बाद, (ऊपर से नीचे तक) निम्नलिखित परतों उपस्थित हैं: ऊपर परत प्लाज्मा follo हैप्रकाश Ficoll परत के शीर्ष पर PBMC परत से बुध, कुछ लाल रक्त कोशिकाओं (आरबीसी) के साथ न्युट्रोफिल परत ट्यूब के नीचे भारी Ficoll परत और लाल रक्त कोशिकाओं के द्वारा पीछा प्रकाश और भारी Ficoll के बीच है.
- फसल और, एक हस्तांतरण विंदुक के साथ एक नया 50 मिलीलीटर ट्यूब में न्युट्रोफिल परत हस्तांतरण कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 225 XG पर 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र के अंतिम मात्रा के लिए पीबीएस जोड़ने.
- Centrifugation के बाद, अब भी neutrophils के साथ मिश्रित लाल रक्त कोशिकाओं हो सकता है. नीचे 10 एमएल निशान को सतह पर तैरनेवाला aspirate. ट्यूब (या एक संक्षिप्त कम गति vortexing) की कोमल आंदोलन के द्वारा न्युट्रोफिल आरबीसी गोली Resuspend और फिर पीबीएस के 50 एमएल के साथ फिर से धो लो.
- दूसरा धोने के बाद, सतह पर तैरनेवाला aspirate. , Contaminating लाल रक्त कोशिकाओं को हटाने आंदोलन (या कम vortexing) द्वारा अवशिष्ट पीबीएस में pelleted कोशिकाओं resuspend, 25 एमएल एच 2 हे और आरबीसी lyse करने के लिए 10 सेकंड के लिए धीरे भंवर जोड़ें.
- 1.8% NaCl के 25 मिलीलीटर जोड़ें और तुरंत मिश्रणकमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 225 XG पर centrifugation द्वारा. contaminating आरबीसी अब एक सफेद न्युट्रोफिल सेल गोली छोड़ने lysed किया जाना चाहिए.
- पीबीएस के साथ न्युट्रोफिल सेल गोली धो लें.
- 10% FBS के साथ RPMI मध्यम में अलग neutrophils Resuspend और एक hemocytometer साथ प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत सेल एकाग्रता का निर्धारण.
- पूरा RPMI-10% FBS के माध्यम के साथ 500,000 कोशिकाओं / एमएल सेल घनत्व को समायोजित करें.
5. फ्लो चैंबर आसंजन परख
- प्रवाह कक्ष इकट्ठे. माइक्रोस्कोप मेज पर मिला हुआ HUVECs या शुद्ध आसंजन रिसेप्टर ligands युक्त 35 मिमी पकवान. सिरिंज पंप, वैक्यूम सिस्टम के साथ समानांतर थाली प्रवाह चैम्बर कनेक्ट और न्युट्रोफिल निवेश के लिए खुला एक लाइन छोड़ दें. प्लेट के ऊपर प्रवाह चैम्बर डालें और प्रवाह चैम्बर विधानसभा 13 जकड़ना. (चित्रा 1 देखें)
- कंप्यूटर से जुड़ा टी पर वीडियो रिकॉर्डिंग कार्यक्रम प्रारंभमाइक्रोस्कोप ओ. पूर्ण विकसित HUVEC कोशिकाओं के साथ एक स्पष्ट क्षेत्र या ligand कोटिंग क्षेत्र दिख रहा है भीतर एक क्षेत्र तक खुर्दबीन के क्षेत्र और फोकस समायोजित करें.
- सिरिंज पंप का प्रयोग, RPMI मध्यम साथ प्रवाह चैम्बर कुल्ला. कक्ष के भीतर कोई हवाई बुलबुले या न्युट्रोफिल इनपुट लाइन कर रहे हैं सुनिश्चित करें.
- अगर वांछित, neutrophils 10 मिनट के लिए कम खुराक (10 -8 एम) fMLP साथ primed किया जा सकता है. यह अलग दाताओं 14 के बीच न्युट्रोफिल सक्रियण के बेसल स्तर की एक मिलान के लिए अनुमति देगा.
- परिभाषित गति पर प्रवाह चैम्बर में (इस अध्ययन में प्रयोग किया जाता है / 2 सेमी 1.5 dynes की एक कतरनी तनाव के बराबर होती है जो 350 μl / मिनट की गति,) neutrophils इंजेक्षन करने के लिए सिरिंज पंप का प्रयोग करें. वीडियो रिकार्ड. न्युट्रोफिल आसंजन तेजी से हो सकता है क्योंकि, 4-5 मिनट की लंबाई के साथ एक वीडियो विश्लेषण के लिए आसंजन घटनाओं quantitate को आमतौर पर पर्याप्त है.
- एक पक्षपाती सेल कम से कम एक सेल व्यास चलता है कि एक कोशिका के रूप में परिभाषित किया गया हैHUVEC या ligand लेपित सतह 15,16 पर 5 सेकंड के भीतर. इस नियम का उपयोग कर दर्ज वीडियो में उपस्थित क्षेत्र में पक्षपाती कोशिकाओं की कुल संख्या की गणना. विभिन्न दानदाताओं 'न्युट्रोफिल साथ समान लंबाई वीडियो रिकॉर्डिंग करके, एक अलग दाताओं के बीच आसंजन गुण तुलना करने के लिए पक्षपाती कोशिकाओं / मिनट की गणना कर सकते हैं.
Representative Results
न्युट्रोफिल के उदाहरण एक शुद्ध ligand (ICAM-1/P-Selectin) लेपित प्रवाह चैम्बर (चित्रा 2) या एक HUVEC लेपित प्रवाह चैम्बर परख (चित्रा 3) के लिए बाध्य न्युट्रोफिल के लिए बाध्य करने दिखाए जाते हैं. आंकड़े में दिखाया गया है, neutrophils सतत प्रवाह की शर्तों के तहत लेपित सतह या HUVEC का पालन करना / जमा करने के लिए जारी है. हमारे ठेठ प्रयोग शर्तों के तहत, हम दृढ़ता से चार मिनट की रिकार्डिंग की अवधि के दौरान लेपित सतह या HUVEC का पालन कर 50-70 मानव neutrophils निरीक्षण कर सकते हैं. हालांकि, न्युट्रोफिल आसंजन अणु, या सब्सट्रेट (शुद्ध किया ligand या HUVEC) में allelic वेरिएंट की allelic वेरिएंट काफी मात्रात्मक न्युट्रोफिल आसंजन 14 को बदल सकता है.
हम भी अपने अध्ययन में मनाया न्युट्रोफिल आसंजन घटनाओं के समय निर्भरता का आकलन किया है. हम निरंतर प्रवाह की स्थिति को बनाए रखने रहे हैं, यह कोशिकाओं के चिपकने वाला गुण समय के साथ बदल कि संभव है. एचowever, हमारे अध्ययन में अपेक्षाकृत कम समय के पाठ्यक्रम में, हम समय के साथ आसंजन की दर में किसी भी लगातार मतभेद का पालन नहीं करते. उदाहरण के लिए, 3-4 मिनट का समय अंक के बीच मनाया आसंजन की तुलना में 1-2 मिनट का समय बिंदुओं पर आसंजन आकलन लगातार अलग नहीं हैं. कोशिकाओं आसंजन प्रयोग के दौरान प्रेरित किया जा रहा है बेशक, अगर, फिर समय के साथ चिपकने वाला गुणों में परिवर्तन की उम्मीद की जा सकती है.
हमारे अध्ययन में, हम जानबूझकर अध्ययन करने से पहले 10 मिनट के लिए कम खुराक fMLP (10 -8 एम) के साथ कोशिकाओं को भड़काना से अलगाव प्रेरित न्युट्रोफिल सक्रियण के लिए नियंत्रित. Endothelial कोशिकाओं (हमारे अध्ययन में HUVEC) भी इष्टतम श्वेतकोशिका फर्म आसंजन के लिए आसंजन अणु अभिव्यक्ति upregulate करने से पहले सक्रियण की आवश्यकता होती है. पूर्व उपचार के अभाव में, endothelial कोशिकाओं (HUVECs) बहुत कम न्युट्रोफिल आसंजन का समर्थन करेंगे. हमारे अध्ययन में, हम 10 एनजी / एमएल का उपयोग करने से पहले 4-6 घंटे के लिए TNFα उपचार में इस्तेमाल किया. आईएल 1β (10 एनजी / एमएल) और LPS (0.5-1 ग्राम / एमएल) भी endothelial कोशिकाओं पूर्व सक्रिय करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. महत्वपूर्ण बात है, अनुपचारित HUVEC सेल आसंजन विशिष्ट (रिसेप्टर की मध्यस्थता) न्युट्रोफिल endothelial सेल बातचीत के कारण होता है कि यह सुनिश्चित करने के लिए नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. वैकल्पिक रूप से, विरोधी रिसेप्टर एंटीबॉडी आसंजन की विशिष्टता का आकलन करने के लिए विशिष्ट रिसेप्टर्स ब्लॉक करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
खुर्दबीन मंच पर चित्रा 1. प्रवाह चैम्बर विन्यास. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
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0 समय बिंदु, बी: 1 मिनट समय बिंदु, सी: 2 मिनट समय बिंदु, और डी. अलग समय अंक (ए पर लेपित सतह ICAM-1/P-Selectin का पालन कर neutrophils की एक नमूना वीडियो से चित्रा 2 स्क्रीन शॉट: 4 मिनट समय बिंदु). ICAM-1 की एकाग्रता 25 माइक्रोग्राम / एमएल है और पी selectin 0.5 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर है. न्युट्रोफिल प्रवाह की गति 500,000 कोशिकाओं / एमएल पर न्युट्रोफिल घनत्व के साथ 350 μl / मिनट है.
. अलग समय अंक (0 समय बिंदु, बी: 1 मिनट समय बिंदु, सी: 2 मिनट समय बिंदु, और डी: 4 मिनट समय बिंदु ए) में HUVEC लेपित सतह का पालन neutrophils की एक नमूना वीडियो से चित्रा 3 स्क्रीन शॉट्स.न्युट्रोफिल प्रवाह की गति 500,000 कोशिकाओं / एमएल पर न्युट्रोफिल घनत्व के साथ मिलीलीटर 350 μl / है.
| जाति | स्थान | कतरनी तनाव (dynes / 2 सेमी) |
| मानव | आम caroid धमनी | 11.6 |
| मानव | गिल धमनी | 6.5 |
| मानव | आम ऊरु धमनी | 4.3 |
| मानव | Suprarenal महाधमनी | 7.3 |
| मानव | Supraceliac महाधमनी | 4.2 |
| मानव | सतही fermoral धमनी | 4.4 |
| मानव | Venules | 0.5-5.0 |
| मानव | रेटिना पहले धमनियों | 40.2 |
| मानव | रेटिना दूसरा arterioles | 0.001 |
| मानव | रेटिना पहले venules | 23.2 |
| मानव | रेटिना दूसरा venules | 0.43 |
| कुत्ता | आम caroid धमनी | 15.8 |
| खरगोश | आम caroid धमनी | 23.3 |
| चूहा | आम caroid धमनी | 46.6 |
| माउस | आम caroid धमनी | 64.8 |
| कुत्ता | आम ऊरु धमनी | 9.8 |
| खरगोश | आम ऊरु धमनी | 156.8 |
| चूहा | आम ऊरु धमनी | 65.9 |
विभिन्न अंगों और विभिन्न प्रजातियों में तालिका 1. नमूना कतरनी तनाव.
* संदर्भ 13, 16, 19, और 20 से संक्षेप.
Discussion
इस प्रोटोकॉल सरासर तनाव परिस्थितियों में न्युट्रोफिल आसंजन की सावधान मात्रा का ठहराव के लिए न्यूनतम सक्रिय neutrophils की जुदाई और अलगाव गाइड. न्युट्रोफिल आसंजन सूजन में एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया है. इस प्रक्रिया में कई अणुओं में आनुवंशिक वेरिएंट autoimmune रोग 1,2 के विकास की संभावना अधिक होती है का प्रदर्शन किया गया है, क्योंकि मात्रात्मक मानव न्युट्रोफिल फर्म आसंजन आकलन करने में सक्षम एक परख प्रणाली की आवश्यकता है. इस प्रोटोकॉल में वर्णित विधि सरासर तनाव के तहत एक नियंत्रित में इन विट्रो वातावरण में neutrophils की फर्म चिपकने की क्षमता का सावधान और मात्रात्मक निर्धारण के लिए अनुमति देता है. इस विधि इस प्रकार genotyped व्यक्तियों के बीच मात्रात्मक न्युट्रोफिल आसंजन की प्रत्यक्ष तुलना आसंजन अणुओं 14 में आनुवंशिक परिवर्तन के महत्व को निर्धारित करने के लिए अनुमति देता है.
इस विधि में कई कदम उठाए achiev को सावधानी से विचार करने की योग्यताई अत्यधिक मात्रात्मक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने का परिणाम है. HUVEC तैयार करने में, यह प्रवाह चैम्बर में उन्हें प्रयोग करने से पहले 100% सेल संगम पाने के लिए महत्वपूर्ण है. शुद्ध ligand के साथ लेपित सतहों का उपयोग कर के लिए, सब्सट्रेट कोटिंग क्षेत्र ligand denaturing से बचने के लिए बाहर सूखे की अनुमति दी जा कभी नहीं करना चाहिए. इसके अलावा, मानव neutrophils की तैयारी प्रयोग की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है. खून से neutrophils अलग में महत्वपूर्ण मुद्दों धीरे अलगाव और प्रयोग, सक्रियण से बचने के लिए vortexing कम से कम (खून कमरे के तापमान पर प्रदर्शन किया जाना चाहिए बर्फ और centrifugation कदम पर संग्रहीत नहीं किया जाना चाहिए अर्थात्) कमरे के तापमान पर कोशिकाओं रखने और पूरा करके निपटने शामिल संभव के रूप में समय की कम से कम राशि में. भी इन assays 17,18 के लिए कोशिकाओं को तैयार करने के लिए उपयोग किया जा सकता है कि अतिरिक्त न्युट्रोफिल अलगाव तरीके हैं.
हौसले से अलग मानव neutrophils का उपयोग कर एक व्यावहारिक दृष्टिकोण, आसंजन assays से प्रतिभागी फ़स्त खोलना के बाद 3-6 घंटे के भीतर शुरू किया जाना चाहिए. Neutrophils से निपटने के लिए अत्यंत संवेदनशील होते हैं, रक्त ड्रा और उपयोग के बीच लंबे समय तक बार परख परिणामों को प्रभावित कर सकता है. पूर्व प्रवाह चैम्बर परख करने न्युट्रोफिल सेल एकाग्रता की सावधानी से दृढ़ संकल्प सटीक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए भी आवश्यक है.
प्रवाह चैम्बर परख के दौरान, यह प्रवाह की गति के अनुरूप है और प्रयोग की लंबाई भर में कोई अशांति नहीं है कि यह सुनिश्चित करने के लिए सावधानी से वीडियो रिकॉर्डिंग की निगरानी के लिए महत्वपूर्ण है. प्रवाह की गति में परिवर्तन या अशांति की उपस्थिति प्रयोग को दोहराया जा कि जरूरत होगी. प्रयोग करने के बाद, यह neutrophils clumping नहीं कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए microscopically शेष neutrophils का आकलन करने के लिए भी महत्वपूर्ण है. इस बिंदु पर clumping neutrophils काफी प्रयोग के दौरान न्युट्रोफिल घनत्व को बदल सकता है, जो सक्रिय हो गए हैं कि संकेत होगा.
सामग्री "> प्रवाह चैम्बर एक क्यू = प्रवाह की दर जहां कक्ष के भीतर निकट सजातीय सरासर तनाव (τ = 6Qμ / (क) 2,, μ = गतिशील चिपचिपापन, और प्रवाह कक्ष के डब्ल्यू = चौड़ाई, ज = ऊंचाई बनाता है ) कक्ष 15 प्रवाह. हमारे अध्ययन में, हम / 2 सेमी 1.5 dynes का सरासर तनाव पैदा करता है जो न्युट्रोफिल आसंजन के लिए 350 μl / मिनट की एक प्रवाह दर का उपयोग किया था (w = 0.25 सेमी, ज = अंदर 0.01, पानी का चिपचिपापन 37 डिग्री सेल्सियस (0.007 शिष्टता)) RMPI मीडिया की चिपचिपाहट का एक सन्निकटन के रूप में इस्तेमाल किया गया था. एक विशिष्ट प्रवाह कक्ष के लिए, एक अलग शारीरिक स्थितियों की नकल करने की सरासर तनाव के विभिन्न स्तरों को प्राप्त करने के लिए प्रवाह दर को बदल सकते हैं. विशिष्ट शारीरिक कतरनी तनाव मानव रक्त वाहिकाओं में 0.5-5.0 dynes / सेमी 13,16 के बीच पर्वतमाला. अन्य रक्त वाहिकाओं में तनाव कतरनी कर सकते हैं और अन्य जानवरों तालिका 1 113,16,19 20 में सूचीबद्ध किया गया.हमारे विधि मानव neutrophi के आसंजन के अध्ययन पर ध्यान केंद्रित किया हैरास, इस विधि neutrophils तक सीमित नहीं है और आसानी से आसंजन या सरल संशोधनों के साथ अन्य प्रकार की कोशिकाओं के रोलिंग के अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता है. इसके अलावा, इस पद्धति में substrates के विभिन्न प्रयोजनों के लिए बदला जा सकता है.
इस प्रोटोकॉल विभिन्न अध्ययनों के लिए आसानी से अनुकूलनीय है, कुछ सीमाएं हैं. यहां कार्यान्वित के रूप में प्रोटोकॉल के विश्लेषण के लिए प्राथमिक कोशिकाओं की बड़ी संख्या की आवश्यकता है. इस छोटे जानवरों से प्राथमिक कोशिकाओं का विश्लेषण छीन सकता है. इसके अतिरिक्त, एक उपलब्ध / सक्रिय रचना में शुद्ध आसंजन ligands स्थिर करने की जरूरत ligands की रेंज सीमित कर सकता है. एफसी संलयन प्रोटीन का उपयोग बहुत थाली सतह पर उचित ligand रचना को प्राप्त करने की संभावना को बढ़ाता है. बहरहाल, हमारे विधि आसंजन की घटनाओं का मात्रात्मक विश्लेषण की अनुमति के लिए महत्वपूर्ण लचीलापन है. ये अध्ययन काफी हमारे आसंजन रिसेप्टर ligand जोड़े की समझ, और आनुवंशिक वेरिएंट के संभावित समारोह महत्व में वृद्धि होगीइन प्रोटीनों में, मानव रोगों के रोगजनन में.
Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
यह काम एक प्रकार का वृक्ष अनुसंधान संस्थान (न्यूयॉर्क, एनवाई), एनआईएच P01-AR49084, एनआईएच R21-DA026956 और एनआईएच UL1-TR00165 द्वारा प्रायोजित है. हम अपने निरंतर समर्थन के लिए डॉ. रॉबर्ट पी. किम्बर्ली धन्यवाद.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Life technologies | 25200-056 | with Phenol Red |
| 2x Trypsin inhibitor | Life technologies | R-002-100 | |
| 35 mm tissue culture dish | Corning Inc. | 430165 | Standard Tissue Culture Treated Surface |
| 75 cm2 tissue culture flask | Corning Inc. | 430641 | Standard Tissue Culture Treated Surface |
| CCD camera | Dage-MTI | Model 300T-RC | |
| Cell freezing container | Biocision | BCS-045 | |
| EBM-2 | Lonza Inc. | CC-3156 | HUVEC growth basal medium |
| EGM-2 Bulletkit | Lonza Inc | CC-4176 | HUVEC growth factors for basal medium |
| FBS | Life technologies | 10082-147 | Certified, Heat Inactivated |
| Gelatin | Sigma | G9391 | from bovine skin |
| Hemacytometer | Fisher scientific | 02-671-51B | |
| Fibronectin | Sigma | F2006 | from human plasma |
| Flow chamber | Glyco Tech | 31-001 | Circular flow chamber for 35 mm dishes |
| fMLP | Sigma | 47729 | |
| Histopaque-11191 | Sigma | 11191 | Heavy Ficoll |
| HUVEC | Lonza Inc. | CC-2517A | |
| ICAM-1 | R&D Systems | 720-IC | Fc chimera |
| Lymphocyte separation medium | Mediatech Inc. | 25072CV | Light Ficoll |
| Microscope | Zeiss | Axiovert 100 | |
| RPMI 1640 medium | Life technologies | 11875 | with L-glutamine and Phenol Red |
| Protein A | Sigma | P6031 | resuspend in PBS |
| P-Selectin | R&D Systems | 137-PS | Fc chimera |
| Syringe pump | KD Scientific | KDS270 | |
| TNF-α | Life technologies | PHC3015 | Recombinant Human Protein |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Life technologies | 15250-061 |
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