Summary
Se presenta un método de cuantificación de la adhesión de neutrófilos. Este método crea un ambiente de flujo dinámica similar al que se encuentra en un vaso sanguíneo. Se permite la investigación de la adhesión de neutrófilos a cualquiera de las moléculas de adhesión purificadas (ligando) o sustrato de células endoteliales (HUVEC) en un contexto similar al entorno in vivo con el estrés pura.
Abstract
Firme adhesión de neutrófilos a las células endoteliales desempeña un papel crítico en la inflamación, tanto en la salud y la enfermedad. El proceso de adhesión de neutrófilos firma implica muchas diferentes moléculas de adhesión, incluyendo miembros de la familia de las integrinas β 2 y sus contra-receptores de la familia ICAM. Recientemente, variantes genéticas de origen natural en tanto β 2 integrinas y ICAM se informa, se asocia con la enfermedad autoinmune. Por lo tanto, la capacidad adhesiva cuantitativa de neutrófilos de los individuos con diferentes formas alélicas de estas moléculas de adhesión es importante para estudiar en relación con los mecanismos subyacentes desarrollo de autoinmunidad. Estudios de adhesión en los sistemas de cámara de flujo pueden crear un entorno con tensión de cizallamiento de fluido similar a la observada en el medio ambiente de los vasos sanguíneos in vivo. A continuación, presentamos un método que utiliza un sistema de ensayo cámara de flujo para estudiar las propiedades adhesivas cuantitativos de neutrófilos en la sangre periférica humanas a células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) y a sustratos ligando purificado. Con este método, las capacidades adhesivas de neutrófilos procedentes de donantes con diferentes variantes alélicas en los receptores de adhesión pueden ser evaluados y comparados. Este método también puede ser modificado para evaluar la adhesión de otros tipos de células primarias o líneas celulares.
Introduction
Las variantes genéticas en ambos β integrinas y 2 en ligandos ICAM son ahora reconocidos para ser asociado con el desarrollo de enfermedad autoinmune 1,2. La determinación de las consecuencias funcionales de estas variantes en células derivadas de los individuos con estas variantes es necesario para nuestra comprensión de cómo estas variantes contribuyen a la patogénesis de la enfermedad autoinmune. Tales estudios funcionales permiten para la determinación de los mecanismos por los que ocurren naturalmente variantes genéticas dan forma a la respuesta inmune tanto en la salud y la enfermedad. En el ejemplo específico de LES, ahora sabemos que las variantes en ITGAM (CD11b) y su ligando, ICAM-1, se asocian fuertemente con el desarrollo de la enfermedad 1,2. Debido a que los neutrófilos son críticos en la respuesta inflamatoria, el estudio cuantitativo de la adhesión de neutrófilos puede proporcionar ideas mecanicistas sobre cómo las variantes genéticas en ITGAM / ICAM alteran la inflamación.
NeutrophIL adhesión firme a las células endoteliales (CE) es un proceso altamente regulado y juega un papel esencial en las respuestas inflamatorias 3,4. La firma de adhesión de neutrófilos sigue rodadura de neutrófilos inicial y captura en la CE y en última instancia, puede dar lugar a la transmigración in vivo. Estos procesos implican muchos tipos diferentes de moléculas de adhesión, incluyendo ICAM-1, ICAM-2, P-selectina, E-selectina en las células endoteliales y β 2 las integrinas en el neutrófilo 5-9. Por lo tanto, con cuidado de la cuantificación de la adhesión de neutrófilos a partir de donantes con diferentes variantes alélicas de las moléculas de adhesión será importante para entender las consecuencias funcionales y patológicas de estas variantes genéticas.
El uso experimental de una cámara de flujo puede crear un entorno in vitro con tensión de cizallamiento de fluido similar a la observada en el medio ambiente de los vasos sanguíneos in vivo 10-12. De hecho, un ensayo de cámara de flujo acoplado con umbili humanaCal de células endoteliales de la vena (HUVEC) puede imitar el ambiente in vivo de un vaso sanguíneo. Usando este método, se puede estudiar las propiedades adhesivas celulares general hacia las células endoteliales. Además, el medio ambiente altamente controlado de la cámara de flujo también permite la evaluación de células de unión a ligandos de adhesión purificadas tales como ICAM-1 para facilitar el estudio de las interacciones receptor-ligando específicos.
Se presenta aquí un método que utiliza un sistema de ensayo de adhesión cámara de flujo para estudiar las propiedades adhesivas de los neutrófilos de sangre periférica humanos a HUVEC y a sustratos ligando purificado. El uso de este método con células de donantes que expresan diferentes variantes alélicas molécula de adhesión nos permite evaluar cómo estas variantes genéticas pueden alterar la adhesión firme de los neutrófilos humanos.
Protocol
Todos los donantes reclutados para este estudio dieron su consentimiento informado por escrito y el estudio fue aprobado por la Universidad de Alabama en Birmingham Junta de Revisión Institucional.
1. HUVEC Cultura Inicial y Subcultura
- Cultura vena células endoteliales umbilicales humanas (HUVEC) in vitro en medio de crecimiento completo que se compone de medio basal de células endoteliales (ver Lista de Materiales) suplementado con factores de crecimiento de células endoteliales.
Nota: Los factores de crecimiento utilizados en este estudio incluyen: 5 ng / ml de factor recombinante de crecimiento epidérmico humano (hEGF), 1,0 mg / ml de hidrocortisona, 50 mg / ml de gentamicina y 50 ng / ml de anfotericina-B (GA-1000), 2 % de suero fetal bovino (FBS), / ml de factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF),, Factor de 0,5 ng 10 ng / ml de factor de crecimiento de fibroblastos humano-básico con heparina (hFGF-B) 20 ng / ml humana recombinante de crecimiento tipo insulina ( R3-IGF-1), 1 g de ácido ascórbico / ml, y 22,5 mg / ml de heparina. El medio completose prepara inicialmente a 37 ° C y a continuación se puede almacenar a 4 ° C para su uso dentro de 1 mes de preparación. - Para preparar un matraz de células, se añade medio de crecimiento completo a un matraz de cultivo de tejidos de 75 cm 2 (1 ml / 5 cm 2) y luego se deja que el matraz se equilibre a 37 ° C / 5% de CO 2 en un incubador humidificado para por lo menos 30 min. HUVEC humano se sembró directamente en este frasco de cultivo equilibrado a una densidad de 2.500-5.000 células / cm 2.
- Mientras los medios de comunicación está equilibrando, descongelar rápidamente el vial de stock HUVEC en un baño de agua a 37 ° C. Dispersar las células en el vial de almacenamiento original por agitación y luego añadirlos directamente en el matraz de cultivo que contiene el medio de crecimiento completo HUVEC pre-equilibrada para lograr una densidad de 2.500-5.000 células / cm 2. Agite suavemente el frasco para distribuir uniformemente las células y luego devolver el frasco a la incubadora. Estas células representan ahora el paso 1 ª. <li> Medio se debe cambiar cada dos días hasta que las células son del 70-80% confluente.
- El HUVEC ahora se puede cosechar del matraz de cultivo con tripsina / EDTA. El medio de cultivo se aspiró de los frascos de cultivo, seguido de un enjuague con PBS para eliminar cualquier proteína residual y de calcio de las células. Se añade una solución de tripsina-EDTA 0,25% y el plazo de 2-6 min desprendimiento de las células debe ser evidente según lo evaluado por microscopía de luz.
- Cuando el 90% de las células se redondean hasta fuera de la placa, detener la tripsinización mediante la adición de un volumen igual de inhibidor de tripsina de 2x. Para facilitar la recolección de las células, añadir otra cantidad igual de medio de cultivo completo. Transferir las células separadas a un tubo de centrífuga de 15 ml estéril.
- Centrifugar las células desprendidas a 225 xg durante 5 min a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante, y a continuación, volver a suspender las células en 2-3 ml de medio de crecimiento completo. Determinar la concentración celular y la viabilidad utilizando un hemocitómetro y azul de tripano.
- Para utilizar ªe las células para su estudio, volver a sembrar otros 75 cm 2 frascos con las células a una densidad de 10.000 células / cm 2 cosechado y vaya al paso 2.2. Alternativamente, las células pueden ser congeladas en este punto para futuros estudios. Para la congelación de células, sedimentar las células por centrifugación a 225 xg durante 5 min a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular en FBS que contiene 10% de DMSO a una concentración de 1 x 10 6 células / ml. La suspensión de células se transfiere luego a crioviales y se almacenó a -80 ° C después de la congelación de las células en un recipiente de congelación de células.
2. Preparación de HUVEC Capa
- El uso de congelados HUVECs paso 2 ª: la reactivación y la cultura. Si el uso de células en crecimiento activo, vaya al paso 2.2.
- Descongele el vial que contiene 2 HUVECs paso nd del paso 1.8 rápidamente en un baño de agua a 37 ° C. Transferencia de células de la criovial a un tubo de centrífuga estéril de 15 ml, y añadir 10 ml de Medi crecimientoum.
- Centrifugar las células a 200 xg durante 5 min a temperatura ambiente y aspirar el sobrenadante para eliminar el DMSO residual.
- Resuspender el sedimento celular con medio de crecimiento completo y transferir las células en un matraz de 75 cm 2. Añadir medio de crecimiento a un volumen total de cerca de 20-25 ml y se incuba a 37 ° C / 5% de CO 2.
- Examine visualmente el cultivo celular para la confluencia cada día con los cambios de los medios de comunicación cada dos días. Por lo general, el plazo de 2-4 días, las células llegarán a 80-90% de confluencia en el que el tiempo que estará listo para su uso en el ensayo de la cámara de flujo.
- Para preparar la placa de cultivo que se utilizará en la cámara de flujo (véase la Sección 5), añadir 1 ml de 10 mg / ml de fibronectina y 0,05% (w / v) de gelatina a un 35 mm de placa de cultivo de tejido y la pipeta varias veces para asegurarse de que toda la superficie de la placa se recubre. Eliminar la solución de fibronectina y gelatina excesiva y el aire seco de la placa durante al menos 30 min para optimizar la formación de la matriz de proteínas. El fsolución ibronectin y gelatina se puede reutilizar hasta 10 veces.
- Recoger las células HUVEC en el paso 2.2 utilizando tripsina-EDTA como se describe en los pasos 1.5 a 1.7. Seed 500.000 células en cada placa de cultivo de tejidos recubiertos. Añadir 2 ml de medio de crecimiento en cada plato y se incuba a 37 ° C / 5% de CO 2.
- Permiten a las células a crecer hasta confluencia como en el paso 2.2. Las células deben ser inspeccionados visualmente a diario con cambios de medio cada dos días. Antes de la cámara de ensayo de flujo, el primer HUVEC con 20 ml de TNF-α ng / humano para 4-6 h para regular al alza y estimular la expresión de adhesión molecular.
3. Purificada ligando Revestimiento
- Dibuje un círculo de 0,5 cm de diámetro con un marcador o un bolígrafo en el centro de un 35 mm de placa de cultivo de tejido.
- Placa 20 l de 20 mg / ml de proteína A en la zona marcada. Use la punta de la pipeta para difundir la proteína de una solución para cubrir toda el área dentro del círculo de diámetro 0,5 cm. Es importante no tocar o rayar la superficie de la dish. Incubar a 37 ° C durante 1 hora.
- Lavar las proteína-A revestidos placa 3x con 1 ml de PBS (pH 8,0).
- Placa de 50 l 1% de BSA en la zona marcada para bloquear la unión no específica en la placa. Se incuba durante 2 horas a 4 ° C.
- Lavar la placa 3x los bloqueados con 1 ml de PBS como en el paso 3.3.
- Preparar las soluciones de proteínas quiméricas de ligando-receptor de Fc adherencia para el recubrimiento. En este experimento, se utilizó una solución ICAM-1/Fc quimera a 25 mg / ml y una quimera P-Selectin/Fc a 0,5 mg / ml en PBS (pH 8,0).
- Cubra el área marcada con 50 l de sustrato. Incubar toda la noche a 4 ° C. El plato se debe utilizar dentro de dos días y el área recubierta no se debe permitir que se sequen. Añadir PBS si es necesario para mantener la solución 50 l en la placa.
4. Separación de neutrófilos (todos los pasos realizados a temperatura ambiente)
- Después de obtener el consentimiento informado, recoger la sangre de los participantes por la flebotomía en unn anticoagulante tubo de recogida de sangre o Vacutainer (EDTA o heparina). Después de la extracción de sangre, se diluye la sangre 1:01 con PBS antes de la separación.
- Prepare una doble capa de Ficoll para la separación de PBMC y neutrófilos en 50 ml tubos de centrífuga. Primero se debe agregar 15 ml de Ficoll pesada (véase la lista de materiales, ρ = 1,118 a 1,120), y luego Capa cuidadosamente 10 ml de Ficoll luz (véase la lista de materiales, ρ = 1,077 a 1,080) en la parte superior de la pesada Ficoll. Debe haber un fuerte fronterizo entre el Ficoll luz y capas de Ficoll pesados. Por último, la capa con cuidado 25 ml de la muestra de sangre diluida en la parte superior de la Ficoll luz sin alterar la capa de Ficoll.
- Centrifugar el tubo a 250 xg durante 30 min a temperatura ambiente. Nota: El freno de rotor de la centrifugadora debe estar apagado para estos giros para reducir al mínimo la interrupción potencial de la separación de células durante la desaceleración del rotor al final de la centrifugación. Después de la centrifugación, las siguientes capas (de arriba a abajo) están presentes: la capa superior es la siguien plasmaconducido por la capa de PBMC en la parte superior de la capa de Ficoll luz, la capa de neutrófilos con pocos glóbulos rojos (RBC) se encuentra entre la luz y Ficoll pesado seguido por la capa de Ficoll pesado y glóbulos rojos en la parte inferior del tubo.
- Cosecha y transferir la capa de neutrófilos en un nuevo tubo de 50 ml con una pipeta de transferencia, añadir PBS hasta un volumen final de 50 ml y centrifugar a 225 xg durante 10 min a temperatura ambiente.
- Después de la centrifugación, todavía puede haber glóbulos rojos mezclados con los neutrófilos. Aspirar el sobrenadante hasta la marca de 10 ml. Resuspender el sedimento de neutrófilos-RBC mediante agitación suave del tubo (o un breve vórtex baja velocidad) y lavar de nuevo con 50 ml de PBS.
- Después del segundo lavado, aspirar el sobrenadante. Para eliminar los hematíes contaminantes, resuspender las células sedimentadas en el PBS residual mediante agitación (o corto agitación), añadir 25 ml de H2O y suavemente vortex durante 10 segundos para la lisis de los glóbulos rojos.
- Añadir 25 ml de 1,8% de NaCl y mezclar inmediatamentede centrifugación a 225 xg durante 10 min a temperatura ambiente. El RBC contaminar ahora debe ser lisadas dejando un sedimento de células de neutrófilos blanco.
- Se lava el sedimento de células de neutrófilos con PBS.
- Resuspender los neutrófilos aislados en medio RPMI con FBS al 10% y determinar la concentración de células bajo microscopio de luz con un hemocitómetro.
- Ajustar la densidad celular a 500.000 células / ml con RPMI completo-10% de medio FBS.
5. Flujo Cámara de ensayo de adhesión
- Montar la cámara de flujo. Coloque el plato de 35 mm que contiene las HUVEC confluentes o ligandos del receptor de adhesión purificadas en la tabla de microscopio. Conecte la cámara de flujo de placas paralelas con bomba de jeringa, sistema de vacío y dejar una línea abierta para la entrada de neutrófilos. Inserte la cámara de flujo en la parte superior de la placa y fije el conjunto de la cámara de flujo 13. (Ver Figura 1)
- Inicie el programa de grabación de vídeo en el ordenador conectado to el microscopio. Ajuste el campo y el enfoque del microscopio hasta el campo libre con células HUVEC están bien desarrollados o en un campo en la región de revestimiento ligando es visible.
- Uso de la bomba de jeringa, enjuagar la cámara de flujo con medio RPMI. Asegúrese de que no haya burbujas de aire dentro de la cámara o de la línea de entrada de neutrófilos.
- Si se desea, los neutrófilos pueden ser preparadas con la dosis baja (10 -8 M) fMLP durante 10 min. Esto permitirá una adaptación del nivel basal de activación de neutrófilos entre diferentes donantes 14.
- Utilice la bomba de jeringa para inyectar los neutrófilos en la cámara de flujo a velocidades definidas (una velocidad de 350 l / min, lo que es igual a una tensión de cizalla de 1,5 dinas / cm 2 se utiliza en este estudio). Grabe el video. Debido a la adhesión de neutrófilos puede ocurrir rápidamente, un video con una longitud de 4-5 minutos es generalmente suficiente para cuantificar eventos de adhesión para el análisis.
- Una de células adherentes se define como una célula que se mueve menos de un diámetro de céluladentro de 5 segundos en la superficie de HUVEC o ligando recubierto 15,16. Cuente el número total de células adherentes en el campo presente en el video grabado con esta regla. Mediante el registro de videos de larga duración similares con neutrófilos diferentes donantes, se puede calcular el adherente células / min para comparar las propiedades de adhesión entre los diferentes donantes.
Representative Results
Ejemplos de la unión de neutrófilos a un ligando purificado (ICAM-1/P-Selectin) cámara de flujo recubierto (Figura 2) o de la unión a un ensayo de cámara de flujo recubierto de HUVEC (Figura 3) de neutrófilos se muestran. Como se muestra en las figuras, los neutrófilos continúan acumulándose / adherirse a la superficie recubierta o HUVEC en condiciones de flujo continuo. Bajo nuestras condiciones experimentales típicas, podemos observar 50-70 neutrófilos humanos firmemente adheridas a la superficie recubierta o HUVEC durante un período de registro de cuatro minutos. Sin embargo, las variantes alélicas de las moléculas de adhesión de neutrófilos, o variantes alélicas en el sustrato (ligando purificado o HUVEC), podrían alterar sustancialmente la adhesión de neutrófilos cuantitativa 14.
También hemos evaluado la dependencia temporal de los eventos de adhesión de neutrófilos observados en nuestros estudios. Mientras que estamos manteniendo constantes las condiciones de flujo, es posible que las propiedades adhesivas de las células cambian con el tiempo. Hin embargo, en los cursos de tiempo relativamente cortos en nuestros estudios, no observamos ninguna diferencia consistente en la tasa de adherencia con el tiempo. Por ejemplo, la evaluación de la adherencia a los 1-2 puntos temporales minutos en comparación con la adhesión observada entre los 3-4 puntos temporales min no son consistentemente diferentes. Por supuesto, si las células están siendo estimulados durante el experimento de adhesión, entonces los cambios en las propiedades adhesivas con el tiempo se podía esperar.
En nuestros estudios, hemos controlado para la activación de neutrófilos inducida por aislamiento de cebado intencionalmente las células con dosis bajas de fMLP (10 -8 M) durante 10 min antes del estudio. Las células endoteliales (HUVEC en nuestros estudios) también requieren activación antes de regular positivamente la expresión de la molécula de adhesión para una óptima adhesión firme de leucocitos. En ausencia de pre-tratamiento, las células endoteliales (HUVEC) apoyarán muy poco la adhesión de neutrófilos. En nuestros estudios, hemos utilizado 10 ng / ml de TNF para el tratamiento 4-6 horas antes de su uso. IL-1β (10 ng / ml) y se LPS (0,5-1 g / ml) también se pueden utilizar para pre-activar las células endoteliales. Es importante destacar que, HUVEC no tratadas puede ser utilizado como control negativo para asegurar que la adhesión celular es causada por la específica de neutrófilos interacciones de células endoteliales (mediada por los receptores). Alternativamente, los anticuerpos anti-receptor se pueden utilizar para bloquear los receptores específicos para evaluar la especificidad de la adhesión.
Figura 1. Configuración de la cámara de flujo en la platina del microscopio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Disparos Figura 2 Pantalla de una muestra de vídeo de los neutrófilos se adhieren a ICAM-1/P-Selectin superficie recubierta en diferentes puntos de tiempo (A:. 0 punto temporal, B: 1 punto temporal min, c: 2 min punto de tiempo, y D: punto de tiempo de 4 min.) La concentración de ICAM-1 es 25 g / ml y P-Selectina es 0,5 g / ml. Velocidad de flujo de neutrófilos es de 350 l / min con una densidad de neutrófilos a 500.000 células / ml.
Disparos Figura 3 Pantalla de una muestra de vídeo de los neutrófilos se adhieren a la superficie de HUVEC revestido en diferentes puntos de tiempo (A: 0 punto del tiempo, B: 1 min punto de tiempo, C: 2 min punto de tiempo, y D: el punto de tiempo de 4 min)..Velocidad de flujo de neutrófilos es de 350 l / ml con una densidad de neutrófilos a 500.000 células / ml.
| Especies | Ubicación | Esfuerzo cortante (dinas / cm 2) |
| Humano | Arteria caroid Común | 11.6 |
| Humano | Arteria branquial | 6.5 |
| Humano | La arteria femoral común | 4.3 |
| Humano | Aorta suprarrenal | 7.3 |
| Humano | Aorta supracelíaco | 4.2 |
| Humano | Arteria fermoral Superficial | 4.4 |
| Humano | Vénulas | 0,5-5,0 |
| Humano | Retina primera arteriolas | 40.2 |
| Humano | Segundo arteriolas retinianas | 0.001 |
| Humano | Retina primera vénulas | 23.2 |
| Humano | Segundo vénulas retinianas | 0.43 |
| Perro | Arteria caroid Común | 15.8 |
| Conejo | Arteria caroid Común | 23.3 |
| Rata | Arteria caroid Común | 46.6 |
| Ratón | Arteria caroid Común | 64.8 |
| Perro | La arteria femoral común | 9.8 |
| Conejo | La arteria femoral común | 156,8 |
| Rata | La arteria femoral común | 65.9 |
Tabla 1. Tensión de cizallamiento de la muestra en diferentes órganos y diferentes especies.
* Resumen de las referencias 13, 16, 19, y 20.
Discussion
Este protocolo de guía a la separación y el aislamiento de los neutrófilos activados mínimamente para la cuantificación cuidadosa de la adhesión de neutrófilos bajo condiciones de estrés escarpados. La adhesión de neutrófilos es un proceso crítico en la inflamación. Debido a que las variantes genéticas en múltiples moléculas en este proceso se ha demostrado que predisponen al desarrollo de la enfermedad autoinmune 1,2, se requiere un sistema de ensayo capaz de evaluar cuantitativamente la adhesión firme de neutrófilos humanos. El método descrito en este protocolo permite la determinación cuantitativa de cuidado y el potencial adhesiva firme de los neutrófilos en un ambiente controlado in vitro bajo esfuerzo cortante. Así pues, este método permite la comparación directa de la adhesión de neutrófilos cuantitativa entre individuos con genotipo para determinar la importancia de la variación genética en las moléculas de adhesión 14.
Varios pasos de este método merecen una cuidadosa consideración a achievresultados e altamente cuantitativos y reproducibles. En la preparación de HUVEC, que es crítica para alcanzar 100% de confluencia celular antes de usarlos en la cámara de flujo. Para el uso de superficies recubiertas con ligando purificado, el área de recubrimiento sustrato no se debe permitir que se seque para evitar la desnaturalización de la ligando. Además, la preparación de los neutrófilos humanos es crítico para el éxito del experimento. Aspectos críticos de aislamiento de neutrófilos de la sangre incluyen el manejo con cuidado al minimizar vórtex para evitar la activación, manteniendo las células a temperatura ambiente (es decir, la sangre no se debe almacenar en los escalones de hielo y centrifugación se debe realizar a temperatura ambiente) y completar el aislamiento y el experimento en la menor cantidad de tiempo posible. Hay métodos de aislamiento de neutrófilos adicionales que también pueden ser utilizados para preparar las células para estos ensayos 17,18.
Desde un punto de vista prácticos ensayos, de adhesión utilizando neutrófilos humanos recién aislados debe iniciarse dentro de 3-6 horas después de la flebotomía participante. Como los neutrófilos son extremadamente sensibles a la manipulación, tiempos prolongados entre la extracción de sangre y el uso podrían afectar los resultados de ensayo. Cuidadosa determinación de la concentración celular de neutrófilos antes de la cámara de ensayo de flujo también es necesario para alcanzar resultados exactos y reproducibles.
Durante el ensayo de cámara de flujo, es importante para controlar la grabación de vídeo cuidadosamente para asegurar que la velocidad de flujo es constante y no hay ninguna turbulencia en toda la duración del experimento. Los cambios en las velocidades de flujo o la presencia de la turbulencia que precisen que se repitió el experimento. Después del experimento, también es importante para evaluar los neutrófilos restantes al microscopio para asegurarse de que los neutrófilos no se aglutinación. La formación de grumos en este punto indicaría que los neutrófilos se han convertido activado que podría alterar significativamente la densidad de neutrófilos durante el experimento.
contenido "> La cámara de flujo crea una tensión homogénea cerca pura dentro de la cámara (τ = 6Qμ / (wh 2), donde Q = caudal, μ = viscosidad dinámica, y w = ancho de la cámara de flujo, h = altura de la 15 cámara de flujo). En nuestros estudios, hemos utilizado una velocidad de flujo de 350 l / min para la adhesión de neutrófilos, lo que crea una gran tensión de 1,5 dinas / cm 2 (W = 0,25 cm, h = 0,01 cm, la viscosidad del agua a 37 ° C (0.007 poises) se utilizó como una aproximación de la viscosidad de los medios de comunicación RPMI). Para una cámara de flujo específica, se puede cambiar la velocidad de flujo para conseguir diferentes niveles de esfuerzo cortante para imitar diferentes condiciones fisiológicas. tensión de cizallamiento fisiológica Típica en los vasos sanguíneos humanos pueden oscila entre 0,5 a 5,0 dinas / cm 13,16. Shear stress en otros vasos sanguíneos y otros animales fueron listados en la Tabla 1 113,16,19 20.Mientras que nuestro método se ha centrado en el estudio de la adhesión de neutrophi humanaLS, este método no se limita a los neutrófilos y se puede aplicar fácilmente a la adhesión o estudios de rodadura de demás tipos de células con modificaciones sencillas. Además, los sustratos en este método se pueden cambiar para diferentes propósitos.
Aunque este protocolo es fácilmente adaptable a diferentes estudios, hay algunas limitaciones. El protocolo tal como se aplica aquí requiere gran número de células primarias para el análisis. Esto puede impedir el análisis de las células primarias de animales pequeños. Además, la necesidad de inmovilizar ligandos de adhesión purificadas en una conformación activa / disponible puede limitar la gama de ligandos. El uso de proteínas de fusión Fc aumenta enormemente las posibilidades de lograr la conformación ligando adecuado en la superficie de la placa. Sin embargo, nuestro método tiene una flexibilidad significativa para permitir el análisis cuantitativo de eventos de adhesión. Estos estudios mejorará en gran medida nuestra comprensión de pares de receptor-ligando de adhesión, y de la importancia potencial en función de las variantes genéticasen estas proteínas, en la patogénesis de las enfermedades humanas.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo es patrocinado por el Instituto de Investigación de Lupus (NY, NY), NIH P01-AR49084, NIH R21-DA026956 y NIH UL1-TR00165. Agradecemos al Dr. Robert P. Kimberly por su continuo apoyo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Life technologies | 25200-056 | with Phenol Red |
| 2x Trypsin inhibitor | Life technologies | R-002-100 | |
| 35 mm tissue culture dish | Corning Inc. | 430165 | Standard Tissue Culture Treated Surface |
| 75 cm2 tissue culture flask | Corning Inc. | 430641 | Standard Tissue Culture Treated Surface |
| CCD camera | Dage-MTI | Model 300T-RC | |
| Cell freezing container | Biocision | BCS-045 | |
| EBM-2 | Lonza Inc. | CC-3156 | HUVEC growth basal medium |
| EGM-2 Bulletkit | Lonza Inc | CC-4176 | HUVEC growth factors for basal medium |
| FBS | Life technologies | 10082-147 | Certified, Heat Inactivated |
| Gelatin | Sigma | G9391 | from bovine skin |
| Hemacytometer | Fisher scientific | 02-671-51B | |
| Fibronectin | Sigma | F2006 | from human plasma |
| Flow chamber | Glyco Tech | 31-001 | Circular flow chamber for 35 mm dishes |
| fMLP | Sigma | 47729 | |
| Histopaque-11191 | Sigma | 11191 | Heavy Ficoll |
| HUVEC | Lonza Inc. | CC-2517A | |
| ICAM-1 | R&D Systems | 720-IC | Fc chimera |
| Lymphocyte separation medium | Mediatech Inc. | 25072CV | Light Ficoll |
| Microscope | Zeiss | Axiovert 100 | |
| RPMI 1640 medium | Life technologies | 11875 | with L-glutamine and Phenol Red |
| Protein A | Sigma | P6031 | resuspend in PBS |
| P-Selectin | R&D Systems | 137-PS | Fc chimera |
| Syringe pump | KD Scientific | KDS270 | |
| TNF-α | Life technologies | PHC3015 | Recombinant Human Protein |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Life technologies | 15250-061 |
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