Summary
Nötrofil yapışmasını ölçülmesi için bir yöntem rapor edilir. Bu yöntem, bir kan damarı karşılaşılan edilene benzer bir dinamik akış ortam oluşturur. Bu izin saflaştırılmış yapışma molekülleri (ligand) veya saf stres ile in vivo ortama benzer bir bağlamda endotel hücre alt-tabaka (HUVEC) ya da, nötrofil adhezyonunun araştırılması.
Abstract
Endotel hücrelerine nötrofil sağlam yapışma sağlık ve hastalık hem enflamasyonda önemli bir rol oynar. Nötrofil sağlam yapışma süreci β 2 integrin ailesinin üyeleri ve ICAM ailesinin kontra reseptörleri de dahil olmak üzere birçok farklı yapışma moleküllerini içerir. Son zamanlarda, hem de doğal olarak oluşan genetik varyantları 2 integrinler β ICAMlann ve oto-bağışıklık hastalığı ile ilişkili olduğu bildirilmektedir. Bu nedenle, bu yapışma moleküllerinin değişik alelik formları ile bireylerden alınan nötrofil kantitatif yapışkan otoimmün kapasite gelişimi altında yatan mekanizmaları ile ilgili olarak çalışma için önemlidir. Akış bölme sistemlerinde Yapışma çalışmalar in vivo olarak kan damarı ortamda gözlenene benzer akışkan kesme stresi ile bir ortam oluşturabilir. Burada, insan periferal kan nötrofil kantitatif yapışkan özelliklerini incelemek için bir akış odası deney sistemi kullanılarak bir yöntem mevcuts insan göbek damarı endotel hücre (HUVEC) ve saflaştırılmış ligand substratlara. Bu yöntem ile, yapışma reseptörlerinin farklı alelik varyantları ile vericilerden, nötrofil yapışkan kapasitelerinin değerlendirilmesi ve karşılaştırılabilir. Bu yöntem, aynı zamanda birincil hücre tipleri veya hücre hatları yapışmasını değerlendirmek için modifiye edilebilir.
Introduction
Her iki β 2 integrins ve ICAM ligandlardaki genetik varyantlar şimdi otoimmün hastalık 1,2 gelişimi ile ilişkili olduğu kabul edilmektedir. Bu varyantların olan bireylerden türetilen hücrelerde, bu varyantların işlevsel sonuçları belirlenmesi, bu varyantlar, otoimmün hastalık patojenezine katkıda kadar daha iyi anlaşılması için gereklidir. Bu gibi fonksiyonel çalışmalar, doğal olarak oluşan genetik varyantları sağlık ve hastalık hem de bağışıklık tepkisini şekillendiren hangi mekanizmaların belirlenmesine izin verir. SLE Spesifik bir örnek olarak, şimdi bu ITGAM (CD11b) varyantları bilmek ve ligand, ICAM-1, 1,2 güçlü bir hastalığın gelişimi ile ilişkilendirir. Nötrofiller inflamatuvar yanıtları kritik olduğundan, nötrofil yapışma kantitatif çalışma ITGAM / ICAM genetik varyantlar iltihabı nasıl değiştirdiğini içine mekanistik anlayışlar sağlayabilir.
Neutrophücreleri (EC) endotelial sıkı bir yapışmaya hIL oldukça düzenli bir süreçtir ve enflamatuar yanıtları 3,4 in önemli bir rol oynar. Nötrofil sağlam yapışma EC ilk nötrofil haddeleme ve ele geçirmesi ve sonuçta in vivo göçüne neden olabilir. Bu işlemler, ICAM-1 de dahil olmak üzere yapışma moleküllerinin çok farklı, ICAM-2, P-selektin, E-selektin, endotel hücrelerinde ve nötrofil 5-9 2 integrinler β içerir. Bu nedenle, yapışma moleküllerinin farklı alelik varyantları olan donörlerden nötrofil yapışmasının dikkatli bir miktar, bu genetik varyantları fonksiyonel ve patolojik sonuçlara yol anlaşılması için önemli olacaktır.
Bir akış odasının Deneysel in vivo kullanımı 10-12 kan damarı ortamda gözlenene benzer akışkan kesme stresi ile in vitro bir ortam oluşturabilir. Gerçekten de, bir akım odası deney insan umbili ile birleştiğindecal damarı endotel hücre (HUVEC) bir kan damarının in vivo ortamı taklit edebilir. Bu yöntemi kullanarak, bir endotel hücreye doğru genel hücresel yapıştırıcı özelliklerini incelemek olabilir. Buna ek olarak, akış odacığının son derece kontrollü bir ortam da hücrenin değerlendirilmesi örneğin ICAM-1 spesifik reseptör-ligand etkileşiminin çalışma kolaylaştıracak şekilde saflaştırılmış yapışma ligandlarına bağlanmasını sağlar.
Burada HUVEC ve saflaştırılmış ligand alt-tabakalar için, insan periferik kan nötrofillerinin yapışkan özelliklerini incelemek için bir akış odası yapışma deneyi sistemi kullanan bir yöntem sunuyoruz. Farklı yapışma molekülü alelik varyantlarını eksprese eden vericiden hücreler ile bu yöntemi kullanarak, bize bu genetik varyant insan nötrofil sıkı bir yapışmaya değiştirebilir nasıl tayin edilmesine olanak sağlamaktadır.
Protocol
Bu çalışma için alınan tüm donörler yazılı bilgilendirilmiş onam verdi ve çalışma Birmingham Kurumsal Değerlendirme Kurulu Alabama Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.
1.. HUVEC İlk Kültür ve alt kültür
- Endotel hücre bazal ortamda oluşan tam bir büyüme ortamı içinde in vitro kültür insan göbek damarı endotel hücrelerinin (HUVEC), endotel hücre büyüme faktörleri ile takviye edilmiş (Malzemelerin listesine bakınız).
Not: Bu çalışmada kullanılan büyüme faktörleri şunları içerir: 5 ng / ml insan rekombinan epidermal büyüme faktörü (hEGF), 1.0 mg / ml hidrokortizon, 50 mg / ml gentamisin ve 50 ng / ml amfoterisin B (GA-1000), 2 % Fetal Bovine Serum (FBS), 0.5 ng / ml Vasküler Endotel Büyüme Faktörü (VEGF), 10 ng / ml insan Fibroblast Büyüme heparin (hFGF-B) ile faktör-Basic, 20 ng / ml insan rekombinan insülin-benzeri büyüme faktörü ( R3-IGF-1) / ml askorbik asit 1 ug ve 22.5 ug / ml heparin. Tam ortam37 ° C de ilk olarak hazırlanır ve daha sonra hazırlama 1 ay içinde kullanım için 4 ° C'de saklanabilir. - Hücreler için bir şişe hazırlamak için, tam büyüme ortamı, 75 cm doku kültür şişesi 2 (1 ml / 5 cm2) ve daha sonra şişe, bir nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C /% 5 CO2 dengelenmeye bırakılır ilave edilir en az 30 dak. İnsan HUVEC / cm 2 2,500-5,000 hücre yoğunluğunda bu dengeye kültür şişesi doğrudan ekildi olacaktır.
- Ortam dengeye olsa da, hızlı bir şekilde 37 ° C su banyosu içinde stok HUVEC cryovial eritin. Vorteks orjinal depolama şişede hücreleri dağıtılır ve daha sonra / cm 2 2,500-5,000 bir hücre yoğunluğu elde etmek için ön-dengelenmiş HUVEC tam büyüme ortamını içeren kültür şişesi doğrudan ekleyin. Yavaşça hücreler eşit olarak, dağıtılması ve daha sonra inkübatör şişeyi geri dönmek için şişeyi sallayın. Bu hücreler artık 1 st geçişini temsil eder. <Hücreler% 70-80 konfluent kadar li> ortam her iki günde bir değiştirilmelidir.
- HUVECler artık tripsin / EDTA ile kültür şişelerinde hasat edilebilir. Kültür ortamı, hücrelerden herhangi bir artık protein ve kalsiyum çıkarmak için PBS ile durulanır ve ardından kültür şişelerinden aspire edilir. A% 0.25 tripsin-EDTA çözeltisi ilave edilir ve ışık mikroskopisi ile değerlendirilen 2-6 dakika hücresi ayrılmasıdır içinde belirgin olmalıdır.
- Hücrelerin% 90'ı plaka kapalı yuvarlanır olduğunda, 2x tripsin inhibitörü eşit hacmi eklenerek trypsinization durdurun. Hücrelerin hasat kolaylaştırmak için, tam büyüme ortamında bir diğer eşit miktarda ekleyin. Steril bir 15 ml santrifüj tüpüne müstakil hücreleri aktarın.
- Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 225 x g de müstakil hücreleri santrifüjleyin. Süpernatanı havalandırın, ve daha sonra tam büyüme ortamı içinde 2-3 ml hücreleri tekrar süspansiyon. , Bir hemasitometre ve tripan mavisi kullanarak hücre konsantrasyonuna ve canlılığı belirler.
- Th kullanmak içine çalışma için hücreler, yeniden tohum ek olarak 75 cm / cm 2 10,000 hücre yoğunluğunda hücreler hasat edilmiş ve 2 şişe 2,2 adıma geçin. Alternatif olarak, hücreler gelecek çalışmalar için bu noktada dondurulabilir. Hücre dondurma için, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 225 x g'de santrifüj ile pelet hücreleri. Süpernatan aspire ve 1 x 10 6 hücre / ml 'lik bir konsantrasyonda,% 10 DMSO içeren FBS hücre pelletini. Hücre süspansiyonu daha sonra bir hücre dondurma kap içindeki hücrelerin dondurma sonra cryovials aktarılır ve -80 ° C'de saklanır.
2.. HUVEC Katman Hazırlık
- Dondurulmuş 2. pasaj HUVEC'lerin Kullanımı: canlanma ve kültür. Aktif büyüyen hücreleri kullanıyorsanız, 2.2 adıma geçin.
- Bir 37 ° C su banyosu içinde hızla aşama 1.8 'den 2 nci geçiş HUVECler içeren dondurarak saklama viali çözülme. 15 ml steril santrifüj tüpüne dondurarak saklamaya uygun vialler hücreleri aktarın ve 10 mi büyüme medi eklemekum.
- Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 xg'de hücreleri santrifüj ve kalıntı DMSO'yu çıkarmak için süpernatan aspire.
- Tam büyüme ortamı ile hücre pelletini ve bir 75 cm 2 şişeye hücreleri aktarın. Toplam hacim, yaklaşık 20-25 ml büyüme ortamı ilave edin ve 37 ° C /% 5 CO2 ile inkübe edilir.
- Görsel olarak ortam değişiklikleri her iki günde bir ile her gün birleştiği için hücre kültürü inceleyin. Genellikle 2-4 gün içinde, hücreler akış odası deneyinde kullanıma hazır olacak hangi zaman% 80-90 ulaşacak.
- Akış odasının kullanılacak bir kültür tabağı hazırlamak için (bkz. Bölüm 5) için 10 ug / ml fibronektinin 1 ml ve% 0.05 bir 35 mm doku kültürü çanağı ve pipet (w / v) jelatin birkaç kez eklemek Emin bütün plaka yüzeyi kaplanır. Matris protein oluşumunu optimize etmek için en az 30 dakika boyunca plaka kuru aşırı fibronektin ve jelatin çözeltisi ve hava çıkarın. Fibronectin ve jelatin çözüm 10x'e kadar tekrar edilebilir.
- 1,5-1,7 adımları tarif edildiği gibi tripsin-EDTA kullanılarak aşama 2.2 'den HUVEC hücreleri hasat. Her bir kaplanmış doku kültür kabına 500,000 hücreleri tohum. Her bir tabağın içinde 2 ml büyüme ortamı ilave edin ve 37 ° C /% 5 CO2 ile inkübe edilir.
- Hücreler adım 2.2 olarak çoğalmak üzere büyümeye olanak sağlar. Hücreler görsel ortam değişiklikleri her iki günde bir günlük muayene edilmelidir. Önceki akış odası deneyine, yapışma molekülü ekspresyonunu ve teşvik etmek için 4-6 saat boyunca 20 ng / ml insan TNF-α ile HUVEC ana.
3.. Saf Ligand Kaplama
- Bir 35 mm doku kültürü çanağı merkezinde bir işaretleyici ya da kalem ile 0.5 cm çapında bir daire çizin.
- Işaretli alandaki 20 ug / ml protein A Levha 20 ul. Protein 0.5 cm çaplı bir daire içinde tüm alanı kapsayacak şekilde bir çözeltisi yaymak için pipet kullanın. Bu d yüzeyine dokunmayın veya çizmeyin önemlidirish. 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edilir.
- 1 ml PBS (pH 8.0) ile protein-kaplanmış bir tabak 3 kez yıkayın.
- Spesifik olmayan plaka üzerine bağlanmasını bloke etme işaretli alanda plaka 50 ul% 1 BSA. 4 ° C'de 2 saat boyunca inkübe
- Adım 3.3 'de olduğu gibi 1 ml PBS ile bloke plaka 3 kez yıkayın.
- Kaplama için Fc-reseptör ligand yapışma kimerik protein solüsyonları hazırlayın. Bu deneyde, 25 ug / ml 'de bir ICAM-1/Fc kimera çözeltisi ve PBS içinde 0.5 ug / ml' de bir P-Selectin/Fc kimera (pH 8.0) kullanıldı.
- Coat alt-tabakanın 50 ul ile işaretli alanı. 4 ° C de bir gece inkübe Çanak iki gün içinde kullanılmalıdır ve kaplanmış alan kurumasına izin verilmemelidir. Plaka üzerinde 50 ul çözelti sağlamak için gerekirse PBS ilave edin.
4. Nötrofil Ayırma (Oda Sıcaklığında Yapılan tüm adımlar)
- Bilgilendirilmiş onam alındıktan sonra, bir içine flebotomiden tarafından katılımcı kan toplamakn antikoagülan kan toplama tüpü veya vacutainer (EDTA veya heparin). Kan toplandıktan sonra, ayrılmasından önce PBS ile kan 01:01 sulandırmak.
- 50 ml santrifüj tüplerine PBMC ve nötrofilleri ayrılması için iki tabakalı bir Ficoll hazırlayın. Ilk olarak 15 mL ağır Ficoll (Malzeme Listesi, ρ = 1,118-1,120 bakınız) ekleyin ve sonra dikkatlice 10 ml ağır Ficoll'ün üstüne (Malzeme Listesi, ρ = 1,077-1,080 bakınız) Ficoll ışık katmanı. Hafif Ficoll'ün ve ağır Ficoll katmanları arasında keskin bir sınır olmalıdır. Son olarak, dikkatli bir Ficoll tabaka bozmadan ışık Ficoll üstüne seyreltilmiş kan örneğinin 25 ml katman.
- Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 250 x g'de santrifüje tüpü. Not: Bu spin santrifüj sonunda rotor yavaşlama sırasında hücre ayırma potansiyel bozulmasını en aza indirmek için santrifüj rotor freni kapalı olmalıdır. Santrifüjlemeden sonra, (yukarıdan aşağıya) aşağıdaki tabakaları mevcuttur: üst tabaka plazma Follo olduğuışık Ficoll tabakanın üzerine PBMC tabakası ile evli, az kırmızı kan hücrelerinin (RBC) ile nötrofil tabaka tüpün altındaki ağır Ficoll katmanı ve eritrositlerde ardından hafif ve ağır Ficoll arasındadır.
- Hasat ve bir transfer pipeti ile yeni bir 50 ml tüp içine nötrofil tabaka transferi, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 225 x g hızında 50 ml ve santrifüj bir son hacme PBS ekleyin.
- Santrifüj işleminden sonra hala nötrofiller ile karıştırıldı eritrosit olabilir. Aşağı 10 ml işaretine süpernatant aspire. Tüp (veya kısa bir düşük hız vorteks) yumuşak çalkalama ile, nötrofil-RBC pelletini ve daha sonra PBS, 50 ml ile tekrar yıkanır.
- İkinci yıkamadan sonra, süpernatan aspire. , Kirletici eritrositlerde kaldırma çalkalama (veya kısa vorteks) ile artık PBS içinde tekrar süspansiyon pelet hücreleri için, 25 ml H2O ve RBC lize etmek için 10 saniye boyunca nazikçe girdap ekleyin.
- % 1.8 NaCl, 25 ml eklenir ve karışım hemenOda sıcaklığında 10 dakika boyunca 225 x g'de santrifüj ile. Kirletici RBC artık, beyaz bir nötrofil hücre pelletini terk lize olmalıdır.
- PBS ile nötrofil hücre pelletini yıkayın.
- % 10 FBS ile RPMI ortamı içinde yeniden süspanse edin ve izole edilmiş nötrofiller bir hemasitometre ile ışık mikroskobu altında hücre konsantrasyonunu belirler.
- Tam RPMI-% 10 FBS ortamı ile 500,000 hücre / ml hücre yoğunluğu ayarlayın.
5. Akış Odası Yapışma Deneyi
- Akış odasının birleştirin. Mikroskop masaya birleşik HUVECler ya da saflaştırılmış yapışma reseptörü ligandları ihtiva eden 35 mm tabak yerleştirin. Şırınga pompası, vakum sistemi ile paralel plaka akış odasına bağlayın ve nötrofil girişi için açık bir satır bırakın. Plakanın üst akış odası takın ve akış odası düzeneğini 13 sabitleyin. (Bkz. Şekil 1)
- Bilgisayar bağlı t video kayıt programını başlatınmikroskop o. Tam olarak büyümüş HUVEC hücreleri ile açık alan veya ligand kaplama bölge görünür içinde bir alana dek mikroskop alanını ve odağı ayarlayın.
- Şırınga pompası kullanılarak, RPMI ortam maddesi ile akış odası yıkayın. Odasının içindeki hava kabarcıkları veya nötrofil giriş hattı olmadığından emin olun.
- Eğer arzu edilirse, nötrofiller, 10 dakika boyunca, düşük dozda (10 -8 M) fMLP ile hazırlanmış olabilir. Bu, farklı vericilerden 14 arasında nötrofil aktivasyonunun bazal seviyesi bir eşleşme için izin verir.
- Belirlenen hızlarda akış odasına (Bu çalışmada kullanılan / cm 2 1,5 dynes bir kesme stresi eşittir 350 | il / dk 'lık bir hız) nötrofiller enjekte etmek için şırınga pompası kullanın. Video kaydedin. Nötrofil yapışma hızla meydana gelebileceğinden, 4-5 dakikalık bir uzunluğu olan bir görüntü analiz için yapışma olayları miktarını belirlemek için yeterlidir.
- Bir yapışkan hücre az bir hücre çapı hareket eden bir hücre olarak tanımlanmaktadırHUVEC veya ligand kaplı yüzey 15,16 on 5 saniye içinde. Bu kural kullanılarak kaydedilen video alanında mevcut olan yapışkan hücrelerin toplam sayısı. Farklı bağış nötrofil ile benzer uzunlukta video kaydı tarafından, biri farklı bağışçılar arasındaki yapışma özelliklerini karşılaştırmak için yapışık hücre / dk hesaplayabilirsiniz.
Representative Results
Nötrofil örnekleri arasında saflaştırılmış bir ligand (ICAM-1/P-Selectin) kaplanmış akım odası (Şekil 2) ya da bir HUVEC kaplanmış akım odası analizi (Şekil 3) bağlanabilen nötrofil bağlanmasını gösterilmiştir. Şekillerde gösterildiği gibi, nötrofiller sürekli akış koşulları altında kaplanmış yüzey veya HUVEC uyması / birikmeye devam etmektedir. Bizim tipik deney koşulları altında, sıkıca dört dakikalık bir kayıt dönemi sırasında, kaplanmış yüzey veya HUVEC yapışan 50-70 insan nötrofil gözlemleyebiliriz. Bununla birlikte, nötrofil yapışma molekülleri ya da alt-tabaka (saflaştırılmıştır ligand veya HUVEC) allelik varyantları alelik varyantlar, esas olarak nicel nötrofil yapışmasını 14 değiştirebilir.
Biz de bizim çalışmalarda gözlenen nötrofil yapışma olayların zaman bağımlılığını değerlendirdik. Biz sabit akış koşulları muhafaza ederken, bu hücrelerin yapışkan özellikleri zamanla değişebilir mümkündür. However, bizim çalışmalarda nispeten kısa zamanlı kurslar içinde, biz zamanla yapışma oranı herhangi tutarlı farklılıkları gözlemek değil. Örneğin, 3-4 dakikalık bir zaman noktaları arasında gözlemlenen yapışma göre 1-2 dakika zaman noktalarında yapışmasını değerlendirmek sürekli olarak farklı değildir. Hücrelerin yapışma deney sırasında uyarılır ediliyor Tabii ki, o zamanla yapışkan özelliklerinde değişiklikler beklenebilir.
Çalışmalarımızda olarak, kasıtlı olarak çalışma öncesinde, 10 dakika boyunca düşük doz fMLP (10 8 M) ile hücrelerin priming ile izolasyon neden olduğu nötrofil aktivasyonu için kontrol edilir. Endotel hücreleri (Çalışmalarımızda HUVEC), aynı zamanda en iyi şekilde yapışması için sağlam bir lökosit yapışma molekülü ekspresyonunu öncesinde aktivasyon gerektirir. Ön-muamele yokluğunda, endotel hücreleri (HUVECler) çok az, nötrofil yapışmasını destekleyecektir. Çalışmalarımızda olarak, 10 ng / ml, kullanımdan önce 4-6 saat boyunca TNFa tedavisinde kullanılır. IL-1β (10 ng / ml) ve LPS (0.5-1 ug / ml), aynı zamanda endotel hücrelerinin ön-aktive etmek için kullanılabilir. Önemli bir şekilde, muamele edilmemiş HUVEC hücre yapışma spesifik (alıcı aracılı) nötrofil-endotel hücre etkileşimleri neden olduğundan emin olmak için negatif bir kontrol olarak kullanılabilir. Alternatif olarak, anti-reseptör antikorlar yapışma özelliğinin değerlendirilmesi özgü reseptörleri bloke etmek için kullanılabilir.
Mikroskop sahnede Şekil 1.. Akış odası yapılandırma. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
oad/51410/51410fig2.jpg "/>
0 zaman noktası, B: 1 dakika zaman noktası, C: 2 dk zaman noktası, ve D. Farklı zaman noktalarında (A kaplanacak yüzey ICAM-1/P-Selectin yapışan nötrofillerin örnek bir videodan Şekil 2 ekran görüntüleri: 4 dk zaman noktası). ICAM-1 konsantrasyonu 25 ug / ml 'dir ve P-Selektin 0.5 ug / ml' dir. Nötrofil akış hızı 500,000 hücre / ml 'de nötrofil yoğunluğa sahip 350 ml / dk' dır.
. Farklı zaman noktalarında (: 0 zaman noktası, B: 1 dakika zaman noktası, C: 2 dk zaman noktası, ve D: 4 dk zaman noktası A) HUVEC kaplanmış yüzeyine yapışan nötrofillerin örnek bir videodan Şekil 3 ekran görüntüleri.Nötrofil akış hızı 500,000 hücre / ml 'de nötrofil yoğunluğa sahip 350 ml ul / olup.
| Tür | Yer | Kesme gerilmesi (din / cm 2) |
| Insan | Ortak caroid arter | 11.6 |
| Insan | Brankiyal arter | 6.5 |
| Insan | Femoral arter | 4.3 |
| Insan | Böbreküstü aorta | 7.3 |
| Insan | Supraceliac aorta | 4.2 |
| Insan | Yüzeysel fermoral arter | 4.4 |
| Insan | Venüller | 0.5-5.0 |
| Insan | Retina ilk arteriyoller | 40.2 |
| Insan | Retina ikinci arteriyoller | 0.001 |
| Insan | Retina ilk venüller | 23.2 |
| Insan | Retina ikinci venüller | 0.43 |
| Köpek | Ortak caroid arter | 15.8 |
| Tavşan | Ortak caroid arter | 23.3 |
| Sıçan | Ortak caroid arter | 46.6 |
| Fare | Ortak caroid arter | 64.8 |
| Köpek | Femoral arter | 9.8 |
| Tavşan | Femoral arter | 156.8 |
| Sıçan | Femoral arter | 65.9 |
Farklı organ ve farklı türler Tablo 1.. Numune kesme gerilmesi.
* Referanslar 13, 16, 19, ve 20 özetlenmiştir.
Discussion
Bu protokol, saf, gerilimli şartlar altında, nötrofil yapışmasının ölçümü için dikkatli bir minimal aktifleştirilmiş nötrofillerin ayrılmasını ve izole yönlendirir. Nötrofil yapışma inflamasyonda önemli bir işlemdir. Bu işlemde çok sayıda molekülün genetik varyantları, otoimmün hastalık 1,2 gelişmesi için temel oluşturabilir için gösterilmiştir için, nicel olarak insan nötrofil sağlam yapışmasını değerlendirmek yeteneğine sahip bir test sistemi gereklidir. Bu protokolde tarif edildiği gibi bir yöntem şeffaf stres altında kontrollü bir ortamda in vitro nötrofil firma yapışkan potansiyelinin dikkatli ve kantitatif belirlenmesi için olanak sağlar. Bu nedenle bu yöntem genotyped bireyler arasındaki nicel nötrofil yapışma direkt karşılaştırılması yapışma molekülleri 14 genetik varyasyonun önemini belirlemek için izin verir.
Bu yöntemde çeşitli adımlar achiev önemsenmesi hake yüksek kantitatif ve tekrarlanabilir sonuçlar. HUVEC hazırlanmasında, akış odası içinde kullanmadan önce% 100 hücre izdiham elde etmek için kritiktir. Saflaştırılmış ligand ile kaplanmış yüzeyler kullanmak için, alt tabaka kaplama alanı ligandı denatüre önlemek için kurumasına asla izin verilmemeli. Buna ek olarak, insan nötrofilleri hazırlanması Deneyin başarısı için çok önemlidir. Kan nötrofilleri de izole önemli hususlar yavaşça izole edilmesini ve deney, aktivasyonunu önlemek için en aza indirmek vorteks (kan, oda sıcaklığında gerçekleştirilmelidir buz ve santrifüj adımları saklanmamalıdır örneğin), oda sıcaklığında hücreleri tutmak ve tamamlayarak işleme dahil mümkün olduğu zaman en az miktarda. Ayrıca, bu tahliller 17,18 için hücrelerin hazırlanması için kullanılabilen ek nötrofil izolasyon yöntemleri vardır.
Taze izole edilmiş insan nötrofil kullanarak pratik bir bakış açısı, yapışma tahlilleri kaynaktan katılımcı phlebotomy sonra 3-6 saat içinde yapılması gerekir. Nötrofiller kullanım için son derece hassas olduğu, kan çizmek ve kullanımı arasında uzun süreli kez tahlil sonuçlarını etkileyebilir. Önce, akış odası tahlile nötrofil hücre konsantrasyonunun belirlenmesi dikkatli doğru ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için gereklidir.
Akış odası Deney sırasında, bu akım hızı tutarlıdır ve deney uzunluğu boyunca herhangi bir türbülans olduğundan emin olmak için dikkatle video kayıt izlemek için önemlidir. Akış hızları değişimler veya türbülans varlığı deney tekrar edilmesi gerekli olacaktır. Deneyden sonra, o nötrofil topaklanma emin olmak için mikroskobik olarak kalan nötrofiller değerlendirmek için de önemlidir. Bu noktada, topaklanma nötrofiller önemli ölçüde deney sırasında nötrofil yoğunluğu değiştirebilir ki aktif hale gelmiş olduğunu işaret eder.
içeriği "> akım odası, bir Q = akış oranı odası içinde homojen yakın dik stres (τ = 6Qμ / (WH 2), μ = dinamik viskozite ve akış odasının W = genişlik ', h = yükseklik yaratır ) haznesi 15 akar. Çalışmalarımızda olarak, / cm 2 1,5 dynes dik bir stres yaratır nötrofil yapışması için 350 ul / dk 'lık bir akış hızı, kullanılan (w = 0.25 cm, h = 0.01 inç su, viskozite 37 ° C'de (0.007 poise)) Kan numuneleri ortamın viskozitesinin bir yaklaşım olarak kullanılmıştır. özel bir akış odası için, bir başka fizyolojik koşulları taklit etmek için saf stres seviyelerinin elde edilmesi için farklı akış hızını değiştirebilir. tipik fizyolojik kesme stresi İnsan kan damarlarında 0.5-5.0 din / cm 13,16 arasında değişmektedir. diğer kan damarlarında stres Kayma ve diğer hayvanlar Tablo 1 113,16,19 20'de listelenmiştir.Bizim yöntem, insan neutrophi yapışmasının çalışmaya odaklanmış olsa dals, bu yöntem, nötrofiller ile sınırlı değildir ve kolay bir şekilde yapışması ya da basit değişikliklerle, başka hücre tipleri haddeleme çalışmalarında uygulanabilir. Ayrıca, bu yöntemde, alt-tabakalar, farklı amaçlar için değiştirilebilir.
Bu protokol, farklı çalışmalarda kolayca adapte olmasına rağmen, bazı sınırlamalar vardır. Burada uygulandığı gibi protokol analizi için, birincil hücre sayıda gerektirir. Bu küçük hayvanlardan birincil hücre analizi engelleyebilir. Buna ek olarak, uygun bir / etken konformasyonda saflaştırılmış yapışma ligandlar hareketsiz hale getirmek için ihtiyaç ligandların aralığı sınırlayabilir. Fc-füzyon proteinlerinin kullanımı büyük ölçüde plaka yüzeyi üzerinde uygun bir ligand konformasyon elde etme şansını arttırır. Bununla birlikte, bizim yöntem yapışma olayların kantitatif analiz izin önemli esnekliğe sahiptir. Bu çalışmalar büyük ölçüde yapışma reseptör-ligand çiftleri anlayış ve genetik varyantlar potansiyel fonksiyonu önemini artıracakBu protein, insan hastalıklarının patojenezinde.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Lupus Araştırma Enstitüsü (NY, NY), NIH P01-AR49084, NIH R21-DA026956 ve NIH UL1-TR00165 tarafından desteklenmektedir. Biz onun sürekli destek için Dr Robert P. Kimberly teşekkür ederim.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Life technologies | 25200-056 | with Phenol Red |
| 2x Trypsin inhibitor | Life technologies | R-002-100 | |
| 35 mm tissue culture dish | Corning Inc. | 430165 | Standard Tissue Culture Treated Surface |
| 75 cm2 tissue culture flask | Corning Inc. | 430641 | Standard Tissue Culture Treated Surface |
| CCD camera | Dage-MTI | Model 300T-RC | |
| Cell freezing container | Biocision | BCS-045 | |
| EBM-2 | Lonza Inc. | CC-3156 | HUVEC growth basal medium |
| EGM-2 Bulletkit | Lonza Inc | CC-4176 | HUVEC growth factors for basal medium |
| FBS | Life technologies | 10082-147 | Certified, Heat Inactivated |
| Gelatin | Sigma | G9391 | from bovine skin |
| Hemacytometer | Fisher scientific | 02-671-51B | |
| Fibronectin | Sigma | F2006 | from human plasma |
| Flow chamber | Glyco Tech | 31-001 | Circular flow chamber for 35 mm dishes |
| fMLP | Sigma | 47729 | |
| Histopaque-11191 | Sigma | 11191 | Heavy Ficoll |
| HUVEC | Lonza Inc. | CC-2517A | |
| ICAM-1 | R&D Systems | 720-IC | Fc chimera |
| Lymphocyte separation medium | Mediatech Inc. | 25072CV | Light Ficoll |
| Microscope | Zeiss | Axiovert 100 | |
| RPMI 1640 medium | Life technologies | 11875 | with L-glutamine and Phenol Red |
| Protein A | Sigma | P6031 | resuspend in PBS |
| P-Selectin | R&D Systems | 137-PS | Fc chimera |
| Syringe pump | KD Scientific | KDS270 | |
| TNF-α | Life technologies | PHC3015 | Recombinant Human Protein |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Life technologies | 15250-061 |
References
- Harley, J. B., et al. Genome-wide association scan in women with systemic lupus erythematosus identifies susceptibility variants. in ITGAM, PXK, KIAA1542 and other. 40, 204-210 (2008).
- Kim, K., et al. Variation in the ICAM1-ICAM4-ICAM5 Locus Is Associated with Systemic Lupus Erythematosus Susceptibility in Multiple Ancestry Populations. Ann. Rheum. Diseases. 71 (11), 1809-1814 (2012).
- Ley, K. Molecular mechanism of leukocyte recruitment in the inflammatory process. Cardiovasc. Res. 32 (4), 733-742 (1996).
- Korthuls, R. J., Anderson, D. C., Granger, D. N. Role of neutrophil-endothelial cell adhesion in inflammatory disorders. J. Crit. Care. 9 (1), 47-71 (1994).
- Albelda, S. M., Smith, C. W., Ward, P. A. Adhesion molecules and inflammatory injury. FASEB J. 8 (8), 504-512 (1994).
- Smith, C. W., Marlin, S. D., Rothlein, R., Toman, C., Anderson, D. C. Cooperative interactions of LFA-1 and Mac-1 with intercellular adhesion molecule-1 in facilitating adherence and transendothelial migration of human neutrophils in vitro. J. Clin. Invest. 83 (6), 2008-2017 (1989).
- Marlin, S. D., Springer, T. A. Purified intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) is a ligand for lymphocyte function-associated antigen. Cell. 51 (5), 813-819 (1987).
- Lawrence, M. B., Springer, T. A. Leukocytes roll on a selectin at physiologic flow rates: Distinction from and prerequisite for adhesion through integrins. Cell. 65 (5), 859-873 (1991).
- Smith, C. W. Possible steps involved in the transition to stationary adhesion of rolling neutrophils: A brief review. Microcirculation. 7, 385-394 (2000).
- Usami, S., Chen, H. H., Zhao, Y., Chien, S., Skalak, R. Design and construction of a linear shear stress flow chamber. Ann. Biomed. Eng. 21 (1), 77-83 (1993).
- van Kooten, T. G., Schakenraad, J. M., Vander Mei, H. C., Busscher, H. J. Development and use of a parallel-plate flow chamber for studying cellular adhesion to solid surfaces. J. Biomed. Mater. Res. 26 (6), 725-738 (1992).
- Munn, L. L., Melder, R. J., Jain, R. K. Analysis of cell flow in the parallel plate flow chamber: Implications for cell capture studies. Biophys. J. 67, 889-895 (1994).
- Kucik, D. F. Measurement of Adhesion Under Flow Conditions. Current Protocols in Cell Biology. , 9.6.1-9.6.10 (2003).
- Zhou, Y., et al. Multiple Lupus Associated ITGAM Variants Alter Mac-1 Function on Neutrophils. Arthritis. Rheum. , (2013).
- Bacabac, R. G., et al. Dynamic shear stress in parallel-plate flow chambers. J. Biomech. 38 (1), 159-167 (2005).
- Kucik, D. F., Wu, C. Cell-Adhesion Assay. Methods in Molecular Biology. 294, 43-54 (2005).
- Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed,, Goosmann, U., C,, Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them. J Vis Exp. 36 (36), (2010).
- Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. J Vis Exp. (17), 745 (2008).
- Cheng, C., et al. Large variations in absolute wall shear stress levels within one species and between species. Atherosclerosis. 195 (2), 225-235 (2007).
- Nagaoka, T., Yoshida, A. Noninvasive evaluation of wall shear stress on retinal microcirculation in humans. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (3), 1113-1119 (2006).
