Summary
Environ 3 à 8.000.000 de personnes aux Etats-Unis souffrent d'un syndrome interstitiel de cystite douleur / de la vessie (IC / BPS), une maladie débilitante caractérisée en partie par des douleurs pelviennes. Afin d'étudier le système nerveux contributions à la condition, un modèle physiologique de la douleur de la vessie est utilisé chez les souris et les rats.
Abstract
Environ 3 à 8.000.000 de personnes aux Etats-Unis souffrent du syndrome de la cystite / de la douleur de la vessie interstitielle (CI / BPS), une maladie débilitante caractérisée par une augmentation urgence et la fréquence des mictions, ainsi que la nycturie et les douleurs pelviennes général, en particulier lors du remplissage de la vessie ou miction. Malgré des années de recherche, la cause de l'IC / BPS reste insaisissable et stratégies de traitement sont incapables de fournir un soulagement complet aux patients. Afin d'étudier le système nerveux contributions à la condition, de nombreux modèles animaux ont été développés pour simuler la douleur et les symptômes associés à IC / BPS. Un tel modèle murin est urinaire distension de la vessie (DLC). Dans ce modèle, l'air comprimé d'une pression spécifique est fourni à la vessie d'un animal anesthésié légèrement sur une période de temps définie. Tout au long de la procédure, les fils dans les muscles abdominaux obliques supérieures enregistrer l'activité électrique du muscle. Cette activité est connue comme la réponse viscéromotrice (VMR) et isa mesure fiable et reproductible de la nociception. Ici, nous décrivons les étapes nécessaires pour effectuer cette technique chez des souris dont les manipulations chirurgicales, de l'enregistrement physiologique, et l'analyse de données. Avec l'utilisation de ce modèle, la coordination entre les neurones sensoriels primaires, la moelle épinière afférences secondaires et les zones du système nerveux central supérieurs impliqués dans la douleur de la vessie peut être démêlé. Ces connaissances de base de la science peut être cliniquement traduit pour traiter les patients souffrant d'IC / BPS.
Introduction
La douleur chronique est officiellement définie comme une douleur qui persiste pendant environ trois mois, ou pour plus longtemps que le temps de guérison des tissus normaux 1. Ce type de douleur est l'une des principales raisons que les gens sont poussés à chercher l'attention médicale 2 et peut coûter jusqu'à 635 milliards de dollars par an 3. Stratégies douleur chronique actuelle d'adaptation sont considérés comme archaïque; après des décennies de progrès de la médecine, les AINS (anti-inflammatoires non stéroïdiens) et les opioïdes sont encore les traitements primaires prescrits par les médecins. Toutefois, ces traitements visent tous les différents types de douleur de la même manière, en fournissant des effets analgésiques sur tout le corps plutôt que de se concentrer spécifiquement sur la cause de cet incident de la douleur exacte. Afin de mieux aider ceux qui souffrent de douleur chronique, l'attention de la recherche devrait être déplacé vers l'étiologie et les traitements spécifiques à la douleur possibles associés à des causes les plus fréquentes de douleur chronique. Le but de ce manuscript est de décrire un modèle utilisé pour mieux comprendre une maladie appelée syndrome de la cystite interstitielle / douloureuse de la vessie (IC / BPS).
IC / BPS est une condition débilitante qui affecte des millions de personnes, principalement des femmes âgées de plus de 40 4. Les causes exactes de IC / BPS ne sont pas connus, mais la prévalence a été liée à la génétique 5, les régimes alimentaires spécifiques, et des niveaux élevés de stress 6 . Les symptômes de l'IC / BPS comprennent, mais ne sont pas limités à: l'urgence accrue d'uriner, mictions plus fréquentes, des douleurs, perçage, ou une sensation de brûlure lors du remplissage de la vessie et la miction, nycturie et 7. Les patients souffrant de ces conditions ont des niveaux de stress plus élevés et sont plus anxieux 8. Cette augmentation des résultats de stress augmentation de la douleur, ce qui augmente le niveau de stress d'origine. Des études ont montré que les niveaux de dépression et d'anxiété diminuent traitements suivants qui soulagent la douleur urinaire, ainsi briser efficacement ce cycle à rétroaction positive Afin d'étudier le système nerveux contributions à la condition, de nombreux modèles animaux ont été développés pour simuler la douleur et les symptômes associés à IC / BPS. Traditionnellement, la cystite a été recréé dans les animaux avec l'introduction de divers produits chimiques tels que l'huile de moutarde, l'acétone, le lipopolysaccharide, l'acide chlorhydrique, et le cyclophosphamide dans la vessie. Toutefois, aucun des agents étrangers sont présents dans l'urine stérile des patients IC / BPS, remettant ainsi en question la validité de ces modèles. Un autre modèle murin de la douleur urologie est la distension de la vessie (DLC) 10. Dans ce modèle, l'air comprimé d'une pression spécifique est fourni à la vessie d'un animal éveillé ou anesthésié légèrement sur une période de temps définie. Tout au long de la procédure, fils dans le dossier muscles abdominaux activité électrique obliquetion du muscle (avec un électromyogramme (EMG)). Cette activité est connue comme la réponse viscéromotrice (VMR) et est fiable, reproductible mesure de nociception 10. Similaire distension des organes creux (par exemple, la vessie, rectum) chez des volontaires humains en bonne santé produit des sentiments d'inconfort et de l'augmentation significative de la douleur rapporté 11,12, traits qui sont souvent utilisés pour diagnostiquer IC / BPS. Ainsi, en conjonction avec des procédés électriques, pharmacologiques, et optogénétiques de stimulation ou d'inhibition, UBD est un modèle utile pour la compréhension et valide à la fois les composants du système nerveux périphérique et central de la nociception et la douleur de la vessie. Ici, nous décrivons la procédure de DLC comme il est actuellement utilisé dans notre laboratoire dans les membres féminins de la souche de souris commune, C57BL/6J. En raison de difficultés dans le processus de cathétérisation mâles, cette procédure est réalisée principalement chez les souris femelles. Ce protocole a été adapté à partir de celui développé par Ness <em> et al 10. et déjà publié de notre laboratoire 13. Le protocole suivant décrit quatre composants principaux de ce modèle chez l'animal anesthésié: (1) la vessie cathéter et de la chirurgie de l'électrode d'enregistrement (2) induction de l'anesthésie partielle (3) distension de la vessie et de l'enregistrement VMR, et (4) l'analyse des données de traces premières VMR / EMG . Des différences subtiles dans la procédure DLC-VMR en raison de choix de l'organisme, la profondeur de l'anesthésie et de l'induction, et la température corporelle sont discutés ci-dessous.
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Protocol
Le protocole suivant a été approuvée par l'établissement de soins et d'utilisation des animaux à l'Université Duquesne Comité et est conforme aux lignes directrices des Instituts nationaux de la santé.
1. L'implantation chirurgicale de fil électrodes et vessie cathéter utilisant des techniques stériles (temps total 5-10 min)
- Les éléments suivants doivent être préparés avant la chirurgie de départ:
- Surveiller activement et d'ajuster la température du corps à 37,5 ± 0,5 ° C en utilisant le système de contrôle de température avec un coussin chauffant fonctionnant sur batterie et la sonde de température du corps de l'animal (liste des matières) Connecter le système automatique d'une lampe de chaleur de faible puissance pour un contrôle supplémentaire de la température du corps.
- Equipement nécessaire pour l'isoflurane comprend l'air comprimé (par exemple 100% de O 2), vaporisateur isoflurane, l'isoflurane, chambre d'induction isoflurane (pour abattre initiale), ogive, et le système d'échappement.
- Assemblez ee des instruments appropriés de chirurgie, cathéter IV, et des électrodes (Liste Matériaux)
- Provoquer état d'anesthésie dans la chambre d'induction à 2-3% d'isoflurane. Retirez la souris de la chambre quand réflexe de redressement est perdu (0-1 min).
- Placez la souris dans le nez cône avec 2-2,5% d'isoflurane. Pincez orteil pour vérifier l'anesthésie complète. Il devrait y avoir aucune réponse de l'animal. Lancement d'une temporisation.
- Placez une goutte de pommade ophtalmique sur chaque oeil de la souris.
- Tournez la souris sur la face dorsale est donc orientée vers le bas.
- Insérer le cathéter à travers l'urètre et dans la vessie.
- Trempez cathéter lubrifiant chirurgicale pour lubrifier cathéter.
- Tirez doucement sur l'ouverture de l'urètre avec des pinces pointues perpendiculaires au corps de l'animal. En maintenant le cathéter avec la 2 ème ensemble de pinces, introduire doucement extrémité de cathéter dans l'urètre à un angle perpendiculaire au corps de l'animal.
- Lorsque le cathéter est entré dans l'urètre ~ 2.1 mm, ajuster doucement le cathéter de sorte qu'il est maintenant parallèle au corpsvisant vers la tête. Ce mouvement est nécessaire pour éviter l'os du pubis.
- Poussez doucement le cathéter vers le corps de la souris. Le cathéter doit glisser dans la cavité du corps en douceur et sans résistance. Ne pas forcer cathéter. Si cathéter n'entre pas en douceur, revenir à la position du cathéter perpendiculaire et recommencer.
- Avec cathéter complètement insérée dans la vessie, appuyez doucement sur l'abdomen de la souris pour expulser le contenu de la vessie. Retirer toute l'urine de cathéter en poussant un petit morceau de serviette en papier dans l'ouverture du cathéter. Lorsque serviette en papier est trempé d'urine, de remplacer. Retirer urine en permanence tout au long du protocole restant, y compris lors des expériences de distension de la vessie (voir Protocole 3 ci-dessous.)
- Insérez deux fils d'argent dans les muscles abdominaux gauche et un fil d'argent dans la poitrine (comme un motif.)
- Utilisez de l'alcool ou de l'iode pour désinfecter la zone latérale à droite du cathéter (côté gauche du corps de l'animal.)
- Exposer muscle abdominal gauche.
- Maintenez la peau près de muscle abdominal gauche avec une pince. Faire une petite incision de 1-2 cm avec des ciseaux chirurgicaux moyennes.
- Insérer la pointe de ciseaux dans l'incision et d'élargir délicatement incision de 2 cm.
- Utilisez une pince pour déplacer fascia recouvrant d'exposer supérieure des muscles abdominaux obliques. Veillez à ne pas couper / déchirer l'un des principaux vaisseaux sanguins qui se trouvent dans cette région.
- Pliez trois fils d'argent dans la moitié. Utilisez forte aiguille de 21 G de prendre une petite bouchée du muscle. Ensuite, appuyez aiguille dans le muscle. Lors de l'insertion dans le muscle attention à ne pas percer tous les organes internes ou provoquer des dommages inutiles au muscle.
- Collez une extrémité libre d'un fil d'argent dans l'ouverture de l'aiguille 21 G. Tirez doucement l'aiguille à travers le muscle de tirer le fil d'argent par la piqûre de muscle. Lorsque l'aiguille est libre de muscle, tirez doucement sur le fil d'argent par le muscle jusqu'à ce que la boucle dans le fil est aligné avec lemorsure de muscle.
- Répétez les étapes 1.7.3-1.7.4 deuxième fil de muscle. Ce fil doit être placé ~ 0,5 cm à partir du premier fil de muscle. Il est important que les deux fils ne se touchent pas après l'insertion.
- Insérez le troisième fil d'argent (masse) dans le coffre inférieur au cœur.
- Utilisez forte aiguille de 21 G de prendre une petite bouchée de la peau (il n'est pas nécessaire de faire une incision ou raser la peau) et pousser l'aiguille à travers la peau.
- Insérer le fil d'argent comme décrit ci-dessus et tirez à travers la peau.
- Placer une petite quantité de 37,5 ° C de l'huile minérale stérile sur les muscles exposés pour les garder humides et tirez la peau sur le muscle autant exposés que possible.
- Injecter 0,5 ml de solution saline sous-cutanée pour aider à maintenir les niveaux de liquides pendant les étapes ultérieures.
- Roulez doucement animaux sur côté de sorte que la température du corps peut être facilement mis à jour.
2. Anesthésie partielle procédure par étapes vers le bas (Total Durée ~ 75 min)
Le protocole d'anesthésie qui suit a été approuvé par la institutionnel de protection et d'utilisation des animaux à l'Université Duquesne Comité et est conforme aux lignes directrices des Instituts nationaux de la santé.
- Immédiatement après la section I (ci-dessus) est complète, l'isoflurane inférieure à 1,5%. Tenir à ce niveau pendant 15 minutes.
- Lower isoflurane tels que l'animal est anesthésié partiellement.
- Basse isoflurane par 0,125% toutes les 15 min jusqu'à ce que des expositions d'animaux une réponse de flexion de pincement de l'orteil, mais ne pas vocaliser ou déplacer autrement.
- En général, un niveau de 0,8-1,0% d'isoflurane est optimale, mais les niveaux peuvent varier en raison de différences dans les configurations d'anesthésie. Vocalisation et / ou la marche sont des événements extrêmement rares où l'anesthésie est au bon niveau.
. 3 électromyogramme (EMG) l'enregistrement Pendant distension de la vessie avec pressions Graded (15-75 mmHg) de (durée totale - variable selon expérience)
- Configuration d'un amplificateur, un convertisseur analogique-numérique, et le logiciel d'enregistrement. Dans cette configuration, le numériseur a une entrée de l'amplificateur et de deux entrées pour le régulateur de pression (pression et entrées des marqueurs de relance, voir ci-dessous la section 3.1.2). Configuration matérielle et logicielle exacte est personnalisable (voir la liste des matériaux pour des instructions spécifiques).
- Installation d'un système pour fournir des rafales spécifiques de pression d'air à l'animal. Ce système est désigné comme le "régulateur de pression synchronisée» dans le protocole suivant. Il permet la livraison de pression automatisé, y compris la numérisation de la pression de l'air, le contrôle de la longueur du procès, l'automatisation intervalle entre les essais, le contrôle de nombre de procès et de relance signal numérique apparition (voir Anderson et al. 14 pour schématique d'un régulateur de pression chronométré).
- Réglez le régulateur de débit à 60 mmHg (contrôle de pression en utilisant un sphygmomanomètre analogique.)
- Régler le régulateur de pression temporisé pour fournir un intervalle de pression préalable de 20 sec (ce sera le signal de stimulus 2V enregistrée dans un logiciel de convertisseur analogique-numérique), suivie d'une impulsion de pression de distension de 20 sec.
- Lancer le procès (intervalle de pression préalable + procès de distension de pression). Lorsque le procès de pression réelle commence, doubler vérifier la pression en utilisant les 3 tensiomètres connectés au système.
- Au cours du procès de distension de pression, un signal EMG forte (> 0,5 V) doit être observée pendant et éventuellement après la distension sec 20. L'animal peut présenter abdominauxmouvement nal, mais l'animal ne doit pas vocaliser ou autrement déplacer. Bien que rare, si des mouvements anormaux ou vocalisations sont observées, augmenter le niveau de l'isoflurane.
- De nombreuses études utilisent des distensions progressives à partir de basse pression (10-15 mmHg) et de travailler jusqu'à des pressions nocives (75-80 mmHg) en 10-15 incréments de mmHg. Voir résultats représentatifs ci-dessous par exemple des traces à des pressions différentes.
- Essais typiques comprennent un intervalle de 20 secondes de pression préalable, un essai de distension de pression de 20 sec, et un intervalle intertrial 1-2 min.
- Effectuer trois distentions à chaque pression, puis la moyenne dans les trois essais (pour obtenir une réponse viscéromotrice unique pour chaque pression). Dans un autre procédé, la perform cinq distensions à chaque pression, jeter les essais de haute et basse, puis la moyenne des trois autres réponses.
4. Analyse des traces Raw EMG
- L'analyse des réponses de viscéro (c.-à-enregistrements EMG) sont facilement fait en utilisant le logiciel de bord numériseur ou par un programme tiers (liste des matières) Les instructions suivantes sont des instructions générales qui pourraient être utilisés pour analyser ces données en utilisant plusieurs programmes ou d'utiliser l'analyse manuelle .
- Pour exporter EMG, la pression, et les données de signaux de stimulation à partir du logiciel de numérisation ne le texte suivant:
- Ouvrez le fichier expérimental.
- Cliquez sur "Fichier", "Exporter comme".
- Modifier le type de fichier "texte de tableur (. Txt)," le nom du fichier et cliquez sur "Enregistrer".
- Dans le pofenêtre de p-up, changer le taux d'échantillonnage de sortie de "1000," changer l'heure de début de la collecte des données de moment a commencé et modifier l'heure de fin de "MaxTime ()." Cochez la case marquage "sortie de décalage dans le temps si la première ligne est un 0,0 s, "et cliquez sur" OK ".
- Les données vont maintenant être exportés dans un fichier texte qui peut être ouvert dans une variété de programmes. Le fichier doit contenir quatre colonnes (minuterie, VMR (EMG), pression, stimulation).
- Pour chaque animal expérimental testé, effectuer les opérations mathématiques suivantes.
- Corriger le signal EMG pour le jeu par le calcul de la valeur absolue de chaque moment ensemble des données.
- Déterminer la réponse EMG moyenne au cours de la section de fond de l'expérience.
- Soustraire cette réponse EMG de fond moyenne de tous les points de données supprimées dans l'expérience pour obtenir de fond corrigée ensemble de données.
- Déterminer l'aire sous la courbe (AUC) pour chaque pré 20 secintervalle de pression dans le fond de l'ensemble de données corrigées.
- Déterminer l'AUC pour chaque essai de distension de pression de 20 secondes en arrière-plan corrigé ensemble de données.
- Diviser chaque essai AUC de distension de pression (obtenu à l'étape 4.3.5) par le bas intervalle de pression préalable AUC de toute l'expérience (obtenu à l'étape 4.3.4.). C'est l'ASC normalisée et fond corrigée pour chaque essai complet de la distension de pression.
- Pour chaque animal expérimental, la moyenne de plusieurs essais normalisés d'une seule pression pour obtenir la VMR normalisée en Volts * s (Vsec).
- Effectuez les statistiques appropriées sur les données en fonction de la conception expérimentale.
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Representative Results
Une illustration de la configuration d'ensemble UBD-VMR peut être vu sur la figure 1A. L'augmentation des stades de pression induisent une augmentation de la VMR brut (c.-à-EMG) (figure 1B). L'VMR brute, la pression, et le signal de marqueur de stimulus qui doit être observée pendant l'enregistrement en utilisant un logiciel de convertisseur analogique-numérique peut être vu dans la figure 2. L'canal haut vu dans La figure 2 est la trace EMG (en V). Le signal de la trace EMG de fond doit être régulière et de faible amplitude (<0,2 V). Si le fond est élevée ou contient de grandes pointes sporadiques (> 0,5 V) les fils et les paramètres de l'amplificateur peuvent avoir besoin d'être ajustée. Dans certaines circonstances emballage fils (de la souris à l'amplificateur et / ou amplificateur de numériseur) dans une feuille peut réduire un peu de bruit. Le canal central de la figure 2 montre le signal de pression, telle que quantifiée par le régulateur de pression chronométré en mmHg. A noter que l'apparition de signaux est une courbe. Cela se produit parce que plein de distensionla vessie n'est pas instantanée. Une fois le signal de pression atteint la valeur maximale de ce procès (par exemple 75 mm Hg de la figure 2), la pression doit rester à cette valeur maximale. À l'occasion, de l'air peut s'échapper de l'urètre à travers le cathéter. Ceci se produit le plus souvent à des pressions élevées (par ex.> 60 mmHg), peut être observé par un changement dans l'amplitude du signal de pression, et peut être réduite en ajoutant une petite quantité de lubrifiant chirurgical autour de l'ouverture de l'urètre. Le canal final (bas de la figure 2) indique le canal de marqueur de stimulus. Le canal de marqueur de relance montre deux signaux distincts. Au début de l'intervalle de pression préalable il est un marqueur momentanée du signal de V 2. Ce signal peut être utilisé pour automatiser le processus d'analyse des données pour une expérience donnée. Plus précisément, on peut programmer un système d'analyse de données pour parcourir un fichier de données à la recherche de marqueurs de relance qui s'élèvent au-dessus de 1,5 V. Cela permet au système d'analyse de données à quickly trouvent chaque essai complet. La deuxième composante de la chaîne de relance est un signal de 1 V qui se produit pendant tout le procès de la distension de pression. Là encore, la présence de ce deuxième signal peut être utilisé pour l'analyse de données facile.
Des données représentatives d'un seul animal expérimental peut être vu dans la figure 3 et tableau 1 L'animal était distendu trois fois à chacun de la pression suivante:. (. Figure 3A; Tableau 1) 15, 30, 45, 60, et 75 mmHg L' trois distentions sont moyennées et représentées sous la forme d'un seul point de données dans le graphique. Notez que les signaux normalisés augmente progressivement avec l'augmentation de la vessie pressions de distension. Après cette série de distension initiale, cet animal a reçu deux séries supplémentaires de gradient distension de la vessie. Comme on le voit sur la figure 3B, les deuxième et troisième ensembles de distentions produites VMRS similaires (à chaque pression.) Ces trois ensembles de distentions survenue sur une péri 2,5 hrod démontrant la stabilité de la configuration de l'enregistrement et de la reproductibilité de la réponse et de stimulus UBD VMR chez un seul animal. Fait important, la stabilité à long terme de cette préparation ne se produit que lorsque l'anesthésie à l'isoflurane est progressivement abaissée au cours d'une heure. Une procédure d'anesthésie plus court peut conduire à une perte progressive du signal DLC VMR avec chaque ensemble de distentions (observations non publiées, Sadler et Kolber.) Un autre facteur essentiel dans la stabilité du système DLC VMR est le maintien d'une température corporelle stable. Comme on le voit sur la figure 4, la VMR UBD (en réponse à la distension 60 mmHg) est sensiblement inférieure à 33,5 ° C la température du corps par rapport à 37,5 ° C.
Figure 1. Réponses viscéromotrice (VMR) de DLC. (A) Schematic de la configuration DLC. L'air comprimé est délivré dans la vessie par l'urètre cathéter. Au cours des distensions, des électrodes dans l'enregistrement des muscles abdominaux EMG. Tout au long de la procédure, la température est maintenue à l'aide d'un coussin chauffant fonctionnant sur batterie et plafonnier. (B) Exemple EMG retrace pendant DLC. Comme la pression augmente, la sortie électrique de muscles abdominaux augmente de manière congruente.
Figure 2. Capture d'écran montrant les données pendant le procès DLC. Trois canaux sont affichés. Le canal du haut montre la trace brut EMG (en V.) Le canal du milieu montre la pression (en mmHg) qui est livré à la vessie. Le tracé inférieur montre le canal de marqueur de stimulation qui indique le début de l'intervalle de pression préalable et l'ensemble de l'essai de distension de pression. L'image est pour un essai complet de 40 sec (20 sec intervalle de pression préalable plus 20 procès sec pression de distension.)
Figure 3. Des données représentatives montrant classés VMR. (A) Les augmentations normalisés VMR progressivement avec une pression croissante (15-75 mmHg) livrés à la vessie de la souris. (B) séries ultérieures de distentions de la vessie (15-75 mmHg = 1 jeu) montrent VMRS similaires par rapport à la première série de distentions.
. Figure 4 température du corps diminue DLC VMR Une réduction de la température corporelle de 37,5 ° C à 33,5 ° C entraîne une diminution significative de la DLC VMR. (N = 6;. Test t apparié * P <0,05)
Tableau 1. Des données représentatives pour un ensemble complet de distentions. Tableau montre les données, y compris la distension de pression AUC, pression préalable intervalle AUC, fond corrigée AUC de distension de pression, et normalisée distension de pression AUC. Pour chaque pression, l'animal a reçu trois essais de distension. La moyenne de la distension de pression normalisée AUC à chaque pression est représentée graphiquement sur la figure 3A.
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Discussion
Chez l'homme, le syndrome de la douleur cystite / de la vessie interstitielle (CI / BPS) représente un problème clinique important parce que les patients ont une douleur débilitante qui est souvent insensible au traitement de la douleur régulière 15. L'un des principaux défis dans la compréhension et le traitement en fin de compte la douleur chronique de la vessie est de comprendre les processus neuronaux normaux qui sont impliqués dans la réponse à la distension de la vessie nocive. Afin de surmonter cette difficulté, un modèle animal de la douleur de la vessie est nécessaire. Ce modèle devrait être reproductible, stable et facile à mesurer. Heureusement, Ness et ses collègues 10 ont développé un système qui peut être utilisée pour étudier les réponses physiologiques à nocive distension de la vessie.
La configuration du système est simple et peut être fait en utilisant principalement du matériel et des logiciels disponibles dans le commerce. La pièce personnalisée majeur de l'équipement impliqué dans le système DLC VMR est le régulateur de pression chronométré. Cette machine fournit un analogue-To-digital conversion de pression d'air et envoie des marqueurs de début de relance pour le matériel du convertisseur analogique-numérique. L'utilisation du régulateur de pression chronométré simplifie grandement l'analyse des données en synchronisant automatiquement le stimulus de pression avec l'EMG enregistrée (c'est à dire. VMR) Ceci est important parce que la VMR ne démarre pas nécessairement précisément lorsque la vessie est d'abord dilaté et la VMR est souvent maintenue pendant une courte période (<5 secondes) après la fin de la distension. Néanmoins, avec la synchronisation attention, on peut facilement effectuer la procédure DLC VMR avec un régulateur marche / arrêt pour contrôler la distension on / off et une minuterie qui est en phase avec le signal EMG enregistrée.
Un avantage majeur du système DLC VMR pour interroger le rôle du système nerveux dans la douleur de la vessie est que les réponses aux gradués pressions de distension de la vessie tombent le long d'une courbe standard avec des pressions croissantes induisant plus VMRS. Cela permet au chercheur de déterminer facilement si un homme expérimentaleipulation entraîne une augmentation ou une diminution de la VMR à des pressions de distension de la vessie à la fois inoffensive et nocives. En outre, le signal d'un seul animal est très stable dans le temps afin que plusieurs cycles de distension graduelle peut être fait (figure 3B). Cela permet aux chercheurs d'obtenir une ligne de base DLC VMR et manipuler l'animal (par exemple, délivrer un médicament) pour intra-sujet correspondant à 13. Les chercheurs ont utilisé le système DLC-VMR (chez les souris et les rats) pour enregistrer ou manipuler les neurones cordon de la corne dorsale de la colonne vertébrale 16 et d'autres neurones dans le système nerveux central (par exemple rostrale ventrale médullaire 17 ou amygdale 13,16.) Ces études et d'autres continuent à ajouter à notre compréhension scientifique de base sur le rôle des différents composants du système nerveux dans le traitement des entrées sensorielles de la vessie et, finalement, la douleur subjective sentir à partir de ce stimulus nociceptif. Bien que le système DLC VMR comprend de nombreux avantages expérimentaux lare certaines limites du modèle. Premièrement, alors que viscérale distension vésicale évoque des sentiments subjectifs de «douleur» dans l'homme, il est impossible de savoir si les enregistrements EMG abdominales chez la souris sont vraiment représentatives de la douleur. Néanmoins, les réponses UBD VMR sont inhibées par les analgésiques communs suggérant que la VMR est une réponse à la douleur comparables. Deuxièmement, dans le présent système UBD-VMR, les animaux sont anesthésiés au cours de l'enregistrement. Bien qu'une comparaison de direct contre anesthésié DLC VMR a validé l'utilisation de l'anesthésie 10, il ya des effets inconnus possibles de l'isoflurane sur les réponses à la douleur, etc. Troisièmement, le protocole décrit n'est pas une chirurgie de survie si plusieurs enregistrements de souris individuelles dans le temps ne sont pas possibles. Néanmoins, l'utilisation du modèle DLC-VMR ainsi que d'autres systèmes de la douleur viscérale permettra une compréhension plus complète de la douleur viscérale et mènera à de nouvelles avenues thérapeutiques pour les patients souffrant d'IC / BPS et autres douleurs viscérales.
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Acknowledgments
Nous tenons à remercier les Drs. Robert Gereau, Henry Lai, et Lara Crock pour leur aide précieuse dans la mise en place de ce système. Nous tenons également à mentionner les sources de financement pour ce travail (BJK - Association internationale pour l'étude de la douleur en début de carrière de subventions de recherche par l'analyse | Conception Fondation par le Fonds terrible maladie Hunkele Université Duquesne INGER & JENS BRUUN et).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Infrared heating blanket and monitoring system | Kent Scientific | Right-Temp System | This system is set up to monitor two separate temperatures. This should include the animal and the heating blanket. In addition, the system can automatically adjust the temperature to maintain a set temp. However, this automatic function produces electrical interference during EMG recording and must be turned off. Kent can provide a battery pack for the heating pad for use during the riEMG recording part of the experiment. |
| Isoflurane vaporizer | Draeger | Vapor 19.1 | Any isoflurane vaporizer will work, but it is helpful to have one that has multiple notches between 0-2% isoflurane. |
| Isoflurane | multiple sources | n/a | |
| 100% Oxygen air tank | multiple sources | n/a | For ventilation of animal |
| Air breathing grade | multiple sources | n/a | For bladder distention |
| 24 G 0.56 in IV catheter | BD Biosciences | 381411 | For bladder catheterization |
| Surgilube (sterile) | Savage Laboratories | 0281-0205-02 | Any surgical grade lubricate would work fine. |
| Mineral oil (sterile) | multiple sources | n/a | |
| Saline (sterile) | multiple sources | n/a | |
| AG8W Silver Wire, 2 m, 0.20 mm (.008 in) D, L, No Insulation | Warner Instruments | W4 64-1318 | Any silver wire with these specifications will work. Wire does not need to be "chlorinated." |
| Ophthalmic ointment | multiple sources | n/a | |
| Small surgical scissors | multiple sources | n/a | |
| Sharp forceps | multiple sources | n/a | |
| 21 G Needle | multiple sources | n/a | |
| Grass amplifier P511 with 3-lead input cable | Grass Instruments | P511 (F-P5IC3/REV1) | This is the "amplifier" used in the protocol. Amplifier with the following settings: Calibrator = 1 mV; Lo freq = 300 Hz; Amplification = 20; Hi freq = 10 kHz; Line filter = in. |
| Cambridge Electronic Design (CED) 1401 Plus (or equivalent) | Cambridge Electronic Design | 1401 Plus | This is the "digitizer" used in the protocol. Other digitizer systems from WINDAQ or other companies would work fine; Need inputs for pressure signal, EMG, and stimulus signal. |
| CED Spike2 software | Cambridge Electronic Design | Spike 2 | This is the the "digitizer software" used in the protocol. Should be from same manufacturer as digitizer. Program should be setup with 3 channels for pressure (0-100 mmHg scale), EMG signal (typically -5 to +5 V range), and stimulus marker (0-2 V) range. |
| Flow chart from air tank to bladder catheter | n/a | n/a | Sequence of connections from pressurized air tank to animal bladder: Air tank to 1/4 in tubing to Gilmont flowmeter to y connector. Branch 1 of y connector to to sphygmomanometer. Branch 2 to a single input on the 4-way gang valve to 4-way valve output to the timed pressure regulator to 3/32 tubing from timed pressure regulator to 2nd y connector (branch 1 to sphygmomanometer) with branch 2 to 3/32 tubing to a 3rd y connector. Branch 1 of y connector to a 3rd sphygmomanometer and branch 2 to animal bladder catheter. |
| Gilmont Flowmeter | Gilmont | GF8321-1401 | Multiple brands of flowmeters will work. For bladder distention air, flow meter should be able to handle high pressures (such as this Gilmont meter). For breathing air, flow rate should be adjustable down to 100 ml/min (typical mouse rate is 500-1,000 ml/min). |
| 4-way Gang valve | Elite | This is a specific piece of equipment. The Elite gang valve is designed for fish tanks at low air pressures. In the bladder distention setup, this valve acts as a safety valves in case the pressure spikes. Too high pressure during initial turning on of the tank will ruin the pressure transducer in the Timed pressure regulator and/or the sphygnometers. In addition, by providing a small amount of leak in the system, this valve makes it easier to adjust the pressure between 10-80 mmHg. | |
| 1/4 in Tubing | multiple sources | n/a | |
| 3/32 inch Tubing | multiple sources | n/a | |
| "Y" connectors (1/4 and 3/32 in) | multiple sources | n/a | |
| Sphygmomanometer | CVS | Any analog sphygmomanometer from a drug store will work for this application. | |
| Timed Pressure Regulator | custom | This is a custom built machine (Washington University in St. Louis Machine shop) that allows for automated pressure delivery including digitization of air pressure, control of trial length, inter-trial interval automation, control of trial number, and stimulus onset digital signal. However, the basic components of the system (pressure on and off for a given trial period) could be controlled with a simple on/off in-line switch. Such analog control of a trial would necessitate additional analysis parameters (see Protocol 4). In addition, one would have to manually assign the pressure based on the analog sphygmomanometer during data analysis. | |
| IGOR Pro | Wavemetrics | n/a | For analysis of EMG signal. Many different types of software can be used for data analysis in these experiments. |
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