Summary
I circa 3-8 milioni di persone negli Stati Uniti soffrono di sindrome interstiziale dolore cistite / vescica (IC / BPS), una condizione debilitante caratterizzata in parte da dolore pelvico. Per studiare contributi del sistema nervoso alla condizione, un modello fisiologico di dolore vescica urinaria è utilizzato in topi e ratti.
Abstract
I circa 3-8 milioni di persone negli Stati Uniti soffrono di sindrome di cistite dolore / vescica interstiziale (IC / BPS), una condizione debilitante caratterizzata da una maggiore urgenza e frequenza della minzione, così come nicturia e dolore pelvico generale, in particolare su riempimento vescicale o svuotamento. Nonostante anni di ricerca, la causa della IC / BPS rimane sfuggente e strategie di trattamento non sono in grado di fornire completo sollievo ai pazienti. Per studiare contributi del sistema nervoso alla condizione, molti modelli animali sono stati sviluppati per imitare il dolore e sintomi associati con IC / BPS. Un tale modello murino è vescica urinaria distensione (UBD). In questo modello, l'aria compressa di una pressione specifica viene consegnato alla vescica di un animale leggermente anestetizzati in un determinato periodo di tempo. Durante tutta la procedura, i fili nei muscoli addominali obliqui superiori registrare l'attività elettrica del muscolo. Questa attività è conosciuta come la risposta visceromotoria (VMR) ed isa misura affidabile e riproducibile di nocicezione. Qui, descriviamo i passi necessari per eseguire questa tecnica sui topi, tra cui le manipolazioni chirurgiche, la registrazione fisiologica, e l'analisi dei dati. Con l'uso di questo modello, il coordinamento tra i neuroni sensoriali primari, midollo spinale afferenze secondarie e aree del sistema nervoso centrale superiore partecipanti dolore vescica può essere dipanato. Questa conoscenza di base della scienza può essere clinicamente tradotto per il trattamento di pazienti affetti da IC / BPS.
Introduction
Il dolore cronico è ufficialmente definito come un dolore che persiste per circa tre mesi, o più a lungo del normale tempo di guarigione del tessuto 1. Questo tipo di dolore è uno dei motivi principali che le persone sono spinti a rivolgersi al medico 2 e può costare fino a 635 miliardi dollari di dollari all'anno 3. Strategie di dolore cronico in corso di coping sono considerati arcaici; dopo decenni di progressi medici, i FANS (farmaci anti-infiammatori non steroidei) e gli oppioidi sono ancora i trattamenti primari prescritti dai medici. Tuttavia questi trattamenti obiettivo tutti i diversi tipi di dolore allo stesso modo, fornendo effetti analgesici tutto il corpo piuttosto che un'attenzione particolare sulla causa che esatta incidente dolore. Per aiutare meglio chi soffre di dolore cronico, l'attenzione la ricerca dovrebbe essere spostata verso l'eziologia e possibili trattamenti specifici per il dolore associato alle più comuni cause di dolore cronico. L'obiettivo di questo manuscript è quello di descrivere un modello utilizzato per comprendere meglio una condizione nota come sindrome di cistite interstiziale / dolorosa della vescica (IC / BPS).
IC / BPS è una condizione debilitante che colpisce milioni di persone, soprattutto donne di età superiore ai 40 4. Le cause esatte della IC / BPS non sono noti, tuttavia la prevalenza è stato collegato alla genetica 5, diete specifiche e livelli di stress elevato 6 . I sintomi di IC / BPS includono ma non sono limitate a: Aumento urgenza di urinare, aumento della frequenza della minzione, dolore, piercing, o bruciore durante il riempimento della vescica e svuotamento, e nicturia 7. I pazienti che manifestano queste condizioni hanno livelli di stress più elevati e sono più ansiosi 8. Ciò ha aumentato i risultati dello stress in aumento del dolore, che aumenta i livelli di stress originali. Studi hanno dimostrato che i livelli di ansia e depressione diminuiscono seguenti trattamenti che alleviano il dolore urinario, così rompendo efficacemente questo ciclo positivo di feedback Per studiare contributi del sistema nervoso alla condizione, molti modelli animali sono stati sviluppati per imitare il dolore e sintomi associati con IC / BPS. Tradizionalmente, cistite è stato ricreato negli animali con l'introduzione di varie sostanze chimiche come olio di senape, acetone, lipopolisaccaride, acido cloridrico, ciclofosfamide e nella vescica. Tuttavia non agenti stranieri sono presenti nelle urine sterile dei pazienti IC / BPS, mettendo in discussione così la validità di questi modelli. Un altro modello murino di dolore urologica è distensione della vescica urinaria (UBD) 10. In questo modello, l'aria compressa di una pressione specifica viene consegnato alla vescica di un animale sveglio o leggermente anestetizzati in un determinato periodo di tempo. Durante tutta la procedura, fili in obliquo muscoli addominali record di activ elettrica superiorelità dal muscolo (con elettromiografia (EMG)). Ciò è noto come la risposta visceromotoria (VMR) ed è affidabile, riproducibile misura di nocicezione 10. Simile cava organo distensione (es. vescica, retto) in volontari sani produce sensazioni di disagio e di aumenti significativi segnalati dolore 11,12, tratti che sono spesso utilizzati per diagnosticare IC / BPS. Così, in combinazione con metodi elettrici, farmacologici, e optogenetic di stimolazione o inibizione, UBD è un modello utile e valida per comprendere entrambe le componenti del sistema nervoso centrale e periferico di nocicezione vescica e dolore. Qui, descriviamo la procedura per UBD come è attualmente utilizzato nel nostro laboratorio entro membri femminili del ceppo topo comune, C57BL/6J. A causa di difficoltà nel processo di cateterizzazione maschi, questa procedura viene eseguita principalmente nei topi femmina. Questo protocollo è stato adattato da quello sviluppato da Ness <em> et al. del 10 e già pubblicato dal nostro laboratorio 13. Il protocollo che segue descrive quattro componenti principali di questo modello in animali anestetizzati: (1) catetere vescicale e chirurgia elettrodo di registrazione (2) induzione di anestesia parziale (3) distensione della vescica e registrazione VMR, e (4) analisi dei dati di prime tracce VMR / EMG . Sottili differenze nella procedura UBD-VMR a causa di scelta dell'organismo, la profondità dell'anestesia e induzione, e la temperatura corporea sono discussi di seguito.
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Protocol
Il seguente protocollo è stato approvato dal Comitato Istituzionale cura degli animali ed uso presso la Duquesne University ed è coerente con le linee guida del National Institutes of Health.
1. Impianto chirurgico di elettrodi Wire e vescica urinaria catetere con tecniche sterili (tempo totale di 5-10 min)
- I seguenti elementi devono essere preparati prima di un intervento chirurgico di partenza:
- Attivamente monitorare e regolare la temperatura corporea di 37,5 ± 0,5 ° C utilizzando il sistema di monitoraggio della temperatura con una piastra elettrica a batteria e sonda temperatura corporea degli animali (Materials List) Collegare sistema automatico per una lampada di calore a bassa potenza per un ulteriore controllo della temperatura corporea.
- Attrezzatura necessaria per l'anestesia isoflurano include aria compressa (ad esempio 100% O 2), vaporizzatore isoflurano, isoflurano, camera di induzione isoflurano (per atterramento iniziale), cono di naso, e il sistema di scarico.
- Montare the strumenti adeguati chirurgici, cateteri IV, ed elettrodi (Materials List)
- Indurre stato anestetico in camera di induzione al 2-3% isoflurano. Rimuovere il mouse dalla camera quando riflesso di raddrizzamento è persa (0-1 min).
- Posizionare il mouse in cono con 2-2,5% isoflurano. Pinch punta a verificare la presenza di anestesia totale. Non ci dovrebbe essere alcuna risposta da parte degli animali. Avviare il timer.
- Mettere 1 goccia di pomata oftalmica per ogni occhio del mouse.
- Girare il mouse sopra in modo lato dorsale è rivolto verso il basso.
- Inserire il catetere attraverso l'uretra e nella vescica.
- Immergere catetere lubrificante chirurgico per lubrificare il catetere.
- Premere delicatamente apertura uretrale con una pinza a punta perpendicolare al corpo dell'animale. Tenendo catetere con il set 2 ° di pinze, inserire delicatamente estremità del catetere in uretra ad un angolo perpendicolare al corpo dell'animale.
- Quando catetere va in uretra ~ 1-2 mm, regolare delicatamente catetere in modo che adesso è parallelo al corpopuntando verso la testa. Questo movimento è necessario per evitare pube.
- Premere delicatamente il catetere attraverso il corpo del mouse. Il catetere deve scorrere nella cavità del corpo uniformemente e senza resistenza. Non forzare il catetere. Se il catetere non entra agevolmente, tornare alla posizione del catetere perpendicolare e ricominciare.
- Con catetere completamente inserito nella vescica, spingere delicatamente verso il basso sull'addome del mouse per espellere il contenuto della vescica. Rimuovere tutte le urine da catetere spingendo un piccolo pezzo di carta assorbente in apertura del catetere. Quando tovagliolo di carta è intrisa di urina, sostituire. Rimuovere urina continuamente durante il protocollo restante anche durante gli esperimenti distensione della vescica (vedi protocollo 3.)
- Inserire due fili d'argento nei muscoli addominali sinistra e un filo d'argento nel petto (come un terreno.)
- Usare alcol o iodio per disinfettare zona laterale a destra del catetere (lato sinistro del corpo dell'animale.)
- Esporre muscolo addominale di sinistra.
- Tenere pelle vicino muscolo addominale sinistra con una pinza. Fai una piccola incisione di 1-2 cm con le forbici chirurgiche medie.
- Inserire la punta di forbici in incisione ed espandersi delicatamente incisione di 2 cm.
- Usare pinze per muovere fascia sovrastante per esporre muscolo addominale obliquo superiore. Fare attenzione a non tagliare / strappare uno dei principali vasi sanguigni che si trovano in questa regione.
- Piegare tre fili d'argento a metà. Utilizzare affilato ago da 21 G a prendere un piccolo morso del muscolo. Quindi, spingere l'ago attraverso il muscolo. Quando si inseriscono nel muscolo attenzione a non forare tutti gli organi interni o indurre inutili danni al muscolo.
- Attaccare una estremità libera di un filo d'argento nell'apertura del 21 ago G. Estrarre delicatamente dell'ago attraverso il muscolo per disegnare il filo d'argento attraverso il morso muscolo. Quando l'ago è libero da muscoli, tirare delicatamente filo d'argento attraverso il muscolo lDansa nel filo è a filo con lamorso muscolare.
- Ripetere i punti 1.7.3-1.7.4 per il secondo filo muscolare. Questo filo deve essere collocato ~ 0,5 centimetri dal primo filo muscolare. È importante che i due fili non tocchino dopo l'inserimento.
- Inserire il terzo filo argento (terra) nel torace inferiore al cuore.
- Utilizzare affilato ago da 21 G a prendere un piccolo morso di pelle (non è necessario fare un'incisione o radersi la pelle) e spingere l'ago attraverso la pelle.
- Inserire il filo d'argento come descritto sopra e tirare attraverso la pelle.
- Mettere una piccola quantità di 37,5 ° C olio minerale sterile sui muscoli esposti per mantenerli umidi e tirare la pelle sopra il muscolo più esposte come possibile.
- Iniettare 0,5 ml di soluzione fisiologica per via sottocutanea per aiutare a mantenere i livelli del fluido durante le fasi successive.
- Rotolare delicatamente animale sul lato in modo che la temperatura corporea può essere facilmente mantenuta.
2. Anestesia procedura step-down parziale (totatempo l ~ 75 min)
Il seguente protocollo anestesia è stato approvato dal Comitato Istituzionale cura degli animali ed uso presso la Duquesne University ed è coerente con le linee guida del National Institutes of Health.
- Subito dopo la sezione I (sopra) è completa, isoflurano inferiore al 1,5%. Mantenere a questo livello per 15 min.
- Isoflurano inferiore in modo tale che l'animale è parzialmente anestetizzato.
- Bassa isoflurano da 0,125% ogni 15 minuti fino reperti animali una risposta flessioni a pizzico punta, ma non vocalizzare o comunque muoversi.
- Tipicamente, un livello di 0,8-1,0% isoflurano è ottimale, ma i livelli possono variare a causa delle differenze di impostazioni anestesia. Vocalizzazione e / o deambulazione sono eventi estremamente rari in cui l'anestesia è al livello corretto.
3. Elettromiogramma (EMG) Registrazione Durante la distensione vescicale con pressioni Graded (15-75 mmHg) (tempo totale - variabile a seconda dell'esperimento)
- Installazione di un amplificatore, un digitalizzatore e software di registrazione. In questa configurazione, il digitalizzatore ha un ingresso per l'amplificatore e due ingressi per il regolatore di pressione (pressione e gli ingressi marcatori stimolo, vedere di seguito la sezione 3.1.2). Configurazione hardware e software esatta è personalizzabile (vedi Materiali Elenco per istruzioni specifiche).
- Installazione di un sistema per consegnare raffiche specifici di pressione atmosferica ad animale. Questo sistema è denominato "regolatore di pressione temporizzata" nella seguente protocollo. Esso consente per la consegna di pressione automatico compresa la digitalizzazione della pressione dell'aria, il controllo della lunghezza di processo, automazione intervallo inter-trial, il controllo del numero di trial, e stimolo segnale digitale esordio (vedi Anderson et al. 14 per schematica di un regolatore di pressione a tempo).
- Impostare il regolatore di flusso a 60 mmHg (pressione di controllo tramite un sfigmomanometro analogico.)
- Impostare il regolatore di pressione temporizzato per fornire un intervallo prepressure 20 sec (questo sarà il segnale di stimolo 2V registrato nel software digitalizzatore) seguito da un 20 sec distensione pressione del polso.
- Avviare il processo (intervallo prepressure + prova distensione pressione). Quando inizia il processo effettivo di pressione, controllare la pressione utilizzando i 3 sfigmomanometri collegati al sistema.
- Durante il processo distensione pressione, deve essere osservato un forte segnale EMG (> 0,5 V), durante ed eventualmente dopo la 20 sec distensione. L'animale può presentare abdomimovimento nale ma l'animale non dovrebbero vocalizzi o altrimenti muoversi. Anche se raro, se si osservano movimenti anomali o vocalizzazioni, aumentare il livello isoflurano.
- Molti studi utilizzano distensioni graduate a partire a bassa pressione (10-15 mmHg) e lavorare fino a pressioni nocive (75-80 mmHg), con incrementi di 10-15 mmHg. Vedere i risultati rappresentativi qui sotto per esempio le tracce a pressioni diverse.
- Prove tipiche includono un intervallo di 20 sec prepressure, un processo distensione pressione 20 sec, e un intervallo tra le prove 1-2 min.
- Effettuare tre distentions ad ogni pressione e poi la media di tutti i tre prove (per ottenere una singola risposta visceromotoria per ogni singola pressione). In un metodo alternativo, peffettuare la giusta cinque distensioni ad ogni pressione, eliminare le prove di alti e bassi, e quindi la media dei restanti tre risposte.
4. Analisi di Tracce Raw EMG
- L'analisi delle risposte visceromotoria (cioè registrazioni EMG) possono essere facilmente effettuata utilizzando il software on-board digitizer o attraverso un programma di terze parti (Materials List) Le seguenti istruzioni sono istruzioni generali che potrebbero essere utilizzati per analizzare i dati utilizzando più programmi o utilizzando l'analisi manuale .
- Per esportare EMG, pressione e dati di segnale di stimolo da software di digitalizzatore effettuare le seguenti operazioni:
- Aprire il file sperimentale.
- Fare clic su "File" "Esporta come."
- Cambiare il tipo di file "di testo foglio di calcolo (. Txt)," nome del file e fare clic su "Salva".
- Nel Pofinestra p-up, cambiare la frequenza di campionamento di uscita da "1000", cambiare l'ora di inizio della raccolta dei dati momento iniziò e modificare l'ora di fine di "MaxTime ()." Seleziona la marcatura "in uscita il time shift scatola così prima riga è un 0.0 sec "e fare clic su" OK ".
- I dati saranno ora esportati come file di testo che può essere aperto in una varietà di programmi. Il file deve contenere quattro colonne (Timer, VMR (EMG), di pressione, di stimolo).
- Per ciascun animale sperimentale testato, eseguire le seguenti operazioni matematiche.
- Rettificare segnale EMG per l'intero set di dati calcolando il valore assoluto di ogni punto.
- Determinare la risposta media EMG durante la sezione dell'esperimento sfondo.
- Sottrarre questo contesto medio di risposta EMG da ogni punto dati rettificati nell'esperimento per ottenere lo sfondo set di dati corretti.
- Determinare l'area sotto la curva (AUC) per ogni 20 sec preintervallo di pressione in background set di dati corretti.
- Determinare l'AUC per ogni prova distensione pressione 20 secondi sullo sfondo set di dati corretti.
- Dividere ogni prova AUC distensione pressione (ottenuta nella fase 4.3.5) con la divisione minima prepressure AUC dal intero esperimento (ottenuta nella fase 4.3.4.). Questo è l'AUC corretta normalizzata e sfondo per ogni prova completa distensione pressione.
- Per ciascun animale sperimentale, diversi studi medi normalizzati da una singola pressione per ottenere l'normalizzato VMR in Volt * sec (Vsec).
- Eseguire le statistiche appropriate sui dati a seconda del disegno sperimentale.
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Representative Results
Un esempio della configurazione generale UBD-VMR può essere visto in Figura 1A. Aumento dei passaggi pressione inducono un aumento del greggio VMR (cioè EMG) (Figura 1B). L'VMR crudo, pressione, e il segnale marcatore stimolo che dovrebbero essere osservati durante la registrazione utilizzando software digitalizzatore può essere visto in Figura 2. Canale superiore visto in Figura 2 è la traccia EMG (in V). Il segnale della traccia EMG sfondo deve essere costante e bassa ampiezza (<0,2 V). Se il fondo è alto o contiene grandi picchi sporadici (> 0,5 V) i cavi e le impostazioni dell'amplificatore possono avere bisogno di essere regolati. In alcune circostanze che avvolgono i fili (da mouse per amplificatore e / o amplificatore Digitizer) in lamina può ridurre il rumore. Il canale centrale nella Figura 2 mostra il segnale di pressione quantificata dal regolatore di pressione temporizzata in mmHg. Si noti che l'insorgenza segnale è una curva. Ciò si verifica perché completa distensionela vescica non è istantanea. Una volta che il segnale di pressione raggiunge il valore massimo per tale processo (ad esempio 75 mmHg in figura 2), la pressione dovrebbe restare a tale valore massimo. Occasionalmente, l'aria può fuoriuscire dell'uretra intorno al catetere. Ciò accade più spesso a pressioni elevate (ad es.> 60 mmHg), si può osservare da un cambiamento di ampiezza del segnale di pressione, e può essere ridotta aggiungendo una piccola quantità di lubrificante chirurgica intorno all'apertura uretrale. Il canale finale (in basso della figura 2) mostra il canale marcatore stimolo. Il canale marcatore stimolo mostra due segnali separati. All'inizio dell'intervallo prepressure c'è un momentaneo marcatore segnale V 2. Questo segnale può essere utilizzato per automatizzare il processo di analisi dei dati per un dato esperimento. In particolare, si può programmare un sistema di analisi dei dati di scansione attraverso un file di dati di ricerca di marcatori stimolo che dominano 1,5 V. Ciò consente al sistema di analisi dei dati per quickly trovare ogni prova completa. Il secondo componente del canale stimolo è un segnale 1 V che si verifica durante l'intero processo distensione pressione. Anche in questo caso, la presenza di questo secondo segnale può essere utilizzato per l'analisi dei dati facile.
Dati indicativi di un singolo animale sperimentale può essere visto nella figura 3 e nella tabella 1 L'animale era dilatato tre volte in ciascuna delle seguenti pressione:. (. Figura 3A; Tabella 1) 15, 30, 45, 60, e 75 mmHg L' tre distentions sono mediati e rappresentati come un unico punto dati nel grafico. Si noti che le normalizzati aumento del segnale gradualmente con l'aumentare della vescica pressioni di distensione. A seguito di questa serie distensione iniziale, questo animale ha ricevuto due ulteriori insiemi di classificato distensione della vescica. Come si vede nella Figura 3B, il secondo e il terzo gruppo di distentions prodotte VMRS simili (ad ogni pressione.) Queste tre serie di distentions avute durante un peri 2,5 hrod dimostrare la stabilità del sistema di registrazione e la riproducibilità dello stimolo UBD e risposta VMR in un singolo animale. È importante sottolineare che la stabilità a lungo termine di questa preparazione avviene solo quando l'anestesia isoflurano è gradualmente passo-down nel corso di 1 ora. Una procedura anestesia più breve può portare ad una progressiva perdita del segnale UBD VMR con ogni set di distentions (osservazioni non pubblicate, Sadler e Kolber.) Un altro fattore critico per la stabilità del sistema UBD VMR è il mantenimento di una temperatura corporea stabile. Come si vede nella figura 4, il UBD VMR (in risposta a 60 mmHg distensione) è notevolmente inferiore a 33,5 ° C della temperatura corporea rispetto a 37,5 ° C.
Figura 1. Risposte visceromotoria (VMR) da UBD. (A) Schematic di configurazione UBD. L'aria compressa viene consegnato in vescica tramite catetere uretrale. Durante distensioni, elettrodi in record di muscolo addominale EMG. Durante l'intero procedimento, la temperatura viene mantenuta con una piastra elettrica a batteria e lampada sovraccarico. (B) Esempio EMG tracce durante UBD. Come aumenta la pressione, produzione di energia elettrica dai muscoli addominali aumenta congruente.
Figura 2. Screen shot che mostra i dati durante il processo UBD. Tre canali sono mostrati. Il canale superiore mostra la traccia prima EMG (in V.) Il canale centrale mostra la pressione (in mmHg) che viene consegnato alla vescica. La traccia inferiore mostra il canale marcatore stimolo che indica l'inizio dell'intervallo prepressure e l'intero processo distensione pressione. L'immagine è per una prova completa 40 sec (20 sec intervallo prepressure più 20 secondi di prova pressione distensione.)
Figura 3. Dati rappresentativi mostrano classificato VMR. (A) I normalizzati aumenta VMR gradualmente con l'aumentare della pressione (15-75 mmHg) consegnati alla vescica del mouse. (B) insiemi successivi di distentions vescica (15-75 mmHg = 1 set) mostrano VMRS simili rispetto al primo set di distentions.
. Figura 4 La temperatura corporea diminuisce UBD VMR Una riduzione della temperatura corporea da 37,5 ° C a 33,5 ° C provoca una diminuzione significativa del UBD VMR. (N = 6;. Paired t-test * P <0.05)
Tabella 1. Dati rappresentativi di una serie completa di distentions. Tabella riporta i dati compresi distensione pressione AUC, prepressure intervallo AUC, fondo corretta AUC distensione pressione, e normalizzata distensione pressione AUC. Per ogni pressione, l'animale ha ricevuto tre prove distensione. La media della pressione normalizzata distensione AUC ad ogni pressione viene tracciata in figura 3A.
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Discussion
Negli esseri umani, la cistite interstiziale / sindrome della vescica dolore (IC / BPS) rappresenta un problema clinico rilevante perché i pazienti hanno dolore debilitante che spesso non risponde al trattamento del dolore regolare 15. Una delle principali sfide nella comprensione e, infine, il trattamento del dolore cronico della vescica è quello di capire i normali processi neurali che sono coinvolti nella risposta al nociva distensione della vescica. Per superare questo problema, è necessario un modello animale di dolore vescicale. Questo modello dovrebbe essere riproducibile, stabile e facilmente misurabile. Fortunatamente, Ness e colleghi 10 hanno sviluppato un sistema che può essere usato per studiare le risposte fisiologiche nociva distensione della vescica.
Configurazione del sistema è semplice e può essere fatto utilizzando principalmente off-the-shelf hardware e software. Il pezzo importante usanza di apparecchiature coinvolte nel sistema UBD VMR è il regolatore di pressione temporizzata. Questa macchina fornisce un analogoA digitale conversione di pressione dell'aria e invia marcatori insorgenza stimolo all'hardware digitalizzatore. L'uso del regolatore di pressione temporizzata semplifica notevolmente l'analisi dei dati sincronizzando automaticamente lo stimolo pressione con il EMG registrato (cioè. VMR) Questo è importante perché il VMR non necessariamente iniziare con precisione quando la vescica è prima disteso e il VMR è spesso mantenuto per un breve periodo (<5 sec) successivo al termine della distensione. Tuttavia, con un'attenta sincronizzazione, si potrebbe facilmente eseguire la procedura UBD VMR con un regolatore on / off per controllare distensione on / off e un timer che è in sincronia con il segnale EMG registrato.
Uno dei principali vantaggi del sistema UBD VMR per interrogare il ruolo del sistema nervoso nel dolore vescicale è che le risposte alle classificati pressioni distensione della vescica cadono lungo una curva standard con crescenti pressioni che inducono maggiori VMRS. Questo consente al ricercatore di determinare facilmente se un uomo sperimentaleipulation provoca un aumento o una diminuzione del VMR a pressioni distensione della vescica sia innocui e nocivi. Inoltre, il segnale da un singolo animale è molto stabile nel tempo in modo che vari cicli di distensione graduata può essere fatto (Figura 3B). Ciò permette ai ricercatori di ottenere una linea di base UBD VMR e poi manipolare l'animale (ad esempio fornire un farmaco) per entro i soggetti corrispondenti 13. I ricercatori hanno utilizzato il sistema UBD-VMR (in topi e ratti) per registrare o manipolare spinali neuroni del corno dorsale spinale 16 e altri neuroni nel sistema nervoso centrale (ad esempio rostrale ventrale midollare 17 o amigdala 13,16). Questi studi ed altri continuano aggiungere alla nostra comprensione scientifica di base del ruolo dei diversi componenti del sistema nervoso nella lavorazione di vescica input sensoriali e infine il dolore personale sentito da questo input nocicettivo. Mentre il sistema UBD VMR include molti vantaggi sperimentalire sono alcune limitazioni al modello. In primo luogo, mentre viscerale distensione della vescica evoca sentimenti soggettivi di "dolore" negli esseri umani è impossibile sapere se addominali registrazioni EMG nei topi sono veramente rappresentativo di dolore. Tuttavia, le risposte UBD VMR sono inibiti da analgesici comuni che suggeriscono che il VMR è una risposta dolore simile. Secondo, nel presente sistema UBD-VMR, animali sono anestetizzati durante la registrazione. Anche se un confronto in tempo reale contro anestetizzato UBD VMR ha convalidato l'uso di anestesia 10, ci sono possibili effetti sconosciuti di isoflurane sulle risposte al dolore simile. In terzo luogo, il protocollo descritto non è un intervento chirurgico sopravvivenza modo più registrazioni di singoli topi nel tempo non sono possibili. Tuttavia, l'uso del modello UBD-VMR nonché altri sistemi dolore viscerale consentirà una più completa comprensione del dolore viscerale e porterà a nuove prospettive terapeutiche per i pazienti affetti da IC / BPS e altre condizioni di dolore viscerale.
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Acknowledgments
Vorremmo riconoscere Drs. Robert Gereau, Henry Lai, e Lara Crock per il loro utile contributo nella creazione di questo sistema. Vorremmo inoltre ringraziare fonti di finanziamento per questo lavoro (BJK - Associazione Internazionale per lo Studio del Dolore Early Career Research Grant dal Scan | Design Foundation da Inger & Jens BRUUN e Hunkele temuto Fondo Malattia Duquesne University).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Infrared heating blanket and monitoring system | Kent Scientific | Right-Temp System | This system is set up to monitor two separate temperatures. This should include the animal and the heating blanket. In addition, the system can automatically adjust the temperature to maintain a set temp. However, this automatic function produces electrical interference during EMG recording and must be turned off. Kent can provide a battery pack for the heating pad for use during the riEMG recording part of the experiment. |
| Isoflurane vaporizer | Draeger | Vapor 19.1 | Any isoflurane vaporizer will work, but it is helpful to have one that has multiple notches between 0-2% isoflurane. |
| Isoflurane | multiple sources | n/a | |
| 100% Oxygen air tank | multiple sources | n/a | For ventilation of animal |
| Air breathing grade | multiple sources | n/a | For bladder distention |
| 24 G 0.56 in IV catheter | BD Biosciences | 381411 | For bladder catheterization |
| Surgilube (sterile) | Savage Laboratories | 0281-0205-02 | Any surgical grade lubricate would work fine. |
| Mineral oil (sterile) | multiple sources | n/a | |
| Saline (sterile) | multiple sources | n/a | |
| AG8W Silver Wire, 2 m, 0.20 mm (.008 in) D, L, No Insulation | Warner Instruments | W4 64-1318 | Any silver wire with these specifications will work. Wire does not need to be "chlorinated." |
| Ophthalmic ointment | multiple sources | n/a | |
| Small surgical scissors | multiple sources | n/a | |
| Sharp forceps | multiple sources | n/a | |
| 21 G Needle | multiple sources | n/a | |
| Grass amplifier P511 with 3-lead input cable | Grass Instruments | P511 (F-P5IC3/REV1) | This is the "amplifier" used in the protocol. Amplifier with the following settings: Calibrator = 1 mV; Lo freq = 300 Hz; Amplification = 20; Hi freq = 10 kHz; Line filter = in. |
| Cambridge Electronic Design (CED) 1401 Plus (or equivalent) | Cambridge Electronic Design | 1401 Plus | This is the "digitizer" used in the protocol. Other digitizer systems from WINDAQ or other companies would work fine; Need inputs for pressure signal, EMG, and stimulus signal. |
| CED Spike2 software | Cambridge Electronic Design | Spike 2 | This is the the "digitizer software" used in the protocol. Should be from same manufacturer as digitizer. Program should be setup with 3 channels for pressure (0-100 mmHg scale), EMG signal (typically -5 to +5 V range), and stimulus marker (0-2 V) range. |
| Flow chart from air tank to bladder catheter | n/a | n/a | Sequence of connections from pressurized air tank to animal bladder: Air tank to 1/4 in tubing to Gilmont flowmeter to y connector. Branch 1 of y connector to to sphygmomanometer. Branch 2 to a single input on the 4-way gang valve to 4-way valve output to the timed pressure regulator to 3/32 tubing from timed pressure regulator to 2nd y connector (branch 1 to sphygmomanometer) with branch 2 to 3/32 tubing to a 3rd y connector. Branch 1 of y connector to a 3rd sphygmomanometer and branch 2 to animal bladder catheter. |
| Gilmont Flowmeter | Gilmont | GF8321-1401 | Multiple brands of flowmeters will work. For bladder distention air, flow meter should be able to handle high pressures (such as this Gilmont meter). For breathing air, flow rate should be adjustable down to 100 ml/min (typical mouse rate is 500-1,000 ml/min). |
| 4-way Gang valve | Elite | This is a specific piece of equipment. The Elite gang valve is designed for fish tanks at low air pressures. In the bladder distention setup, this valve acts as a safety valves in case the pressure spikes. Too high pressure during initial turning on of the tank will ruin the pressure transducer in the Timed pressure regulator and/or the sphygnometers. In addition, by providing a small amount of leak in the system, this valve makes it easier to adjust the pressure between 10-80 mmHg. | |
| 1/4 in Tubing | multiple sources | n/a | |
| 3/32 inch Tubing | multiple sources | n/a | |
| "Y" connectors (1/4 and 3/32 in) | multiple sources | n/a | |
| Sphygmomanometer | CVS | Any analog sphygmomanometer from a drug store will work for this application. | |
| Timed Pressure Regulator | custom | This is a custom built machine (Washington University in St. Louis Machine shop) that allows for automated pressure delivery including digitization of air pressure, control of trial length, inter-trial interval automation, control of trial number, and stimulus onset digital signal. However, the basic components of the system (pressure on and off for a given trial period) could be controlled with a simple on/off in-line switch. Such analog control of a trial would necessitate additional analysis parameters (see Protocol 4). In addition, one would have to manually assign the pressure based on the analog sphygmomanometer during data analysis. | |
| IGOR Pro | Wavemetrics | n/a | For analysis of EMG signal. Many different types of software can be used for data analysis in these experiments. |
References
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