Summary
Ca 3-8 millioner mennesker i USA lider av interstitiell cystitt / blære smertesyndrom (IC / BPS), en ødeleggende tilstanden kjennetegnes blant annet ved bekkensmerter. For å studere nervesystemet bidrag til tilstanden, er en fysiologisk modell av urinblæren smerte benyttet i mus og rotter.
Abstract
Ca 3-8 millioner mennesker i USA lider av interstitiell cystitt / blære smertesyndrom (IC / BPS), en ødeleggende tilstand karakterisert ved økt haster, og hyppighet av vannlating, samt nokturi og generell bekkensmerter, spesielt på blæren fylling eller vannlating. Til tross for mange års forskning, årsaken til IC / BPS forblir unnvikende og behandlingsstrategier er ute av stand til å gi fullstendig lindring til pasienter. For å studere nervesystemet bidrag til tilstanden, har mange dyremodeller blitt utviklet for å etterligne den smerte og symptomer assosiert med IC / BPS. En slik murine modell er urinblæren distensjon (UBD). I denne modellen blir trykkluft av et bestemt trykk leveres til blæren av en lett bedøvet dyr over en angitt tidsperiode. Gjennom hele prosedyren, ledninger i den overlegne skrå magemusklene registrere elektrisk aktivitet fra muskelen. Denne aktivitet er kjent som visceromotor respons (VMR) og jegSA pålitelig og reproduserbar mål på nociception. Her beskriver vi de nødvendige skritt for å utføre denne teknikken i mus inkludert kirurgiske manipulasjoner, fysiologisk registrering, og dataanalyse. Med bruk av denne modellen, kan samordning mellom primære sensoriske nerveceller, ryggmarg sekundære afferenter, og høyere sentralnervesystemet områder involvert i blæren smerte bli avslørt. Denne grunnleggende vitenskap kunnskap kan da bli klinisk settes for å behandle pasienter som lider av IC / BPS.
Introduction
Kronisk smerte er offisielt definert som smerter som varer i ca tre måneder, eller lengre enn normalt vev healing tid en. Denne typen smerte er en av de viktigste grunnene til at folk blir drevet til å søke legehjelp 2 og kan koste opp til $ 635 milliard dollar årlig tre. Nåværende kroniske smerter mestringsstrategier anses arkaisk; etter tiår med medisinske fremskritt, NSAIDs (ikke-steroide anti-inflammatoriske legemidler) og opioider er fortsatt den primære behandlinger foreskrevet av leger. Men disse behandlinger rettet mot alle forskjellige typer av smerte på samme måte, noe som gir analgetiske virkninger i hele kroppen, i motsetning til spesifikt å fokusere på årsaken til at nøyaktige smerte hendelsen. For bedre å kunne hjelpe de som lider av kroniske smerter, bør forskning oppmerksomhet forskyves mot etiologi og mulige smertespesifikke behandlinger knyttet til de vanligste årsakene til kronisk smerte. Målet med denne manuscript er å beskrive en modell som brukes til å bedre forstå en tilstand som kalles interstitiell cystitt / smertefull blære (IC / BPS).
IC / BPS er en invalidiserende tilstand som rammer millioner av mennesker, først og fremst kvinner over 40 år fire. Den nøyaktige årsakene til IC / BPS er ikke kjent, men utbredelsen har vært knyttet til genetikk 5, bestemte dietter, og høyt stressnivå 6 . Symptomer på IC / BPS omfatter, men er ikke begrenset til: Økt haster å urinere, økt hyppighet av vannlating, verkende, piercing, eller brennende smerte under blæren fylling og tømming, og nokturi 7. Pasienter som opplever slike forhold har høyere stressnivå og er mer engstelig åtte. Denne økte stress-resultater i økt smerte, noe som forsterker den opprinnelige stressnivå. Studier har vist at depresjon og angst nivåer redusere følgende behandlinger som lindrer urinveisproblem, og dermed effektivt bryte positive-feedback denne syklusen For å studere nervesystemet bidrag til tilstanden, har mange dyremodeller blitt utviklet for å etterligne den smerte og symptomer assosiert med IC / BPS. Tradisjonelt har cystitt blitt gjenskapt i dyr med innføring av ulike kjemikalier som for eksempel sennepsolje, aceton, lipopolysakkarid, saltsyre, og cyklofosfamid inn i blæren. Men ingen utenlandske agenter er til stede i steril urin av IC / BPS pasienter, og dermed spørsmål ved gyldigheten av disse modellene. En annen murine modell av urologisk smerte er urinblæren distensjon (UBD) 10. I denne modellen blir trykkluft av et bestemt trykk leveres til blæren i en våken eller lett bedøvet dyr over en angitt tidsperiode. Gjennom hele prosedyren, ledninger i den overlegne skrå magemusklene rekord elektrisk activligheten fra muskelen (med en electromyogram (EMG)). Denne aktivitet er kjent som visceromotor respons (VMR) og er pålitelig og reproduserbar måling av nociception 10.. Lignende hul organ oppblåsthet (f.eks blære, endetarm) hos friske frivillige produserer følelser av ubehag og betydelige økninger i rapportert smerte 11,12, egenskaper som ofte brukes til å diagnostisere IC / BPS. Således, i forbindelse med el, farmakologiske og optogenetic metoder for stimulering eller inhibering, er UBD en nyttig og gyldig modell for forståelse av både det perifere og sentrale nervesystemet komponenter av blæren nocicepsjon og smerte. Her beskriver vi fremgangsmåten for UBD som brukes i dag i vårt laboratorium innen kvinnelige medlemmer av den vanlige mus belastning, C57BL/6J. På grunn av vanskeligheter i kateteriseringen av menn, er denne fremgangsmåten først og fremst utført i hunnmus. Denne protokollen er blitt tilpasset fra at utviklet av Ness <em> et al. 10 og tidligere publisert fra vår lab 13. Følgende protokoll beskriver fire primære komponenter av denne modellen i bedøvede dyr: (1) blære kateter og opptak elektrode kirurgi (2) delvis anestesi induksjon (3) blæren oppblåsthet og VMR opptak, og (4) dataanalyse av rå VMR / EMG spor . Subtile forskjeller i UBD-VMR prosedyre på grunn av valg av organismen, anestesi dybde og induksjon, og kroppstemperaturen er omtalt nedenfor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Følgende protokoll er godkjent av Institutional Animal Care og bruk Utvalget ved Duquesne University og er i samsvar med retningslinjer fra National Institutes of Health.
En. Kirurgisk Implantasjon av Wire Elektroder og urinblæren kateter ved hjelp av sterile teknikker (total tid 5-10 min)
- Følgende elementer bør være forberedt før du starter operasjonen:
- Aktivt overvåke og justere kroppstemperaturen til 37,5 ± 0,5 ° C ved hjelp av temperatur overvåking system med en batteridrevet varmepute og dyr kroppstemperatur probe (Materialer List) Koble automatiske systemet til en lav-wattstyrke varmelampe for ekstra kontroll av kroppstemperatur.
- Nødvendig utstyr for isoflurananestesi inkluderer komprimert luft (f.eks 100% O 2), isofluran vaporizer, isofluran, isofluran induksjonskammeret (for første knockdown), nese kjegle, og eksosanlegg.
- Monter the riktige kirurgiske instrumenter, IV kateter, og elektroder (Materialer List)
- Indusere bedøvelse stat i induksjonskammeret på 2-3% isofluran. Fjern mus fra kammeret når rettende refleks er tapt (0-1 min).
- Plasser musen i nese kjegle med 2-2,5% isofluran. Knip tå for å sjekke for fulle anestesi. Det bør ikke være noen respons fra dyret. Start tidtaker.
- Plasser en dråpe oftalmisk salve på hvert øye hos mus.
- Snu musen over så ryggsiden vender ned.
- Sett inn kateter gjennom urinrøret og inn i blæren.
- Dypp kateter i kirurgisk lube å smøre kateter.
- Hold forsiktig urinrørsåpning med spisse pinsett vinkelrett på dyrets kropp. Holde kateter med to nd sett av pinsetter, forsiktig inn kateter enden i urinrøret i en vinkel vinkelrett på dyrets kropp.
- Når kateter ble satt inn i urinrøret ~ 1-2 mm, forsiktig justere kateter, slik at det nå er parallell med kroppsikter mot hodet. Denne bevegelse er nødvendig for å unngå skambenet.
- Skyv kateteret mot musens kropp. Kateteret skal gli inn i kroppens hulrom jevnt og uten motstand. Ikke tving kateter. Hvis kateteret går ikke jevnt, går du tilbake til den vinkelrett kateterposisjon og starte på nytt.
- Med kateter satt helt inn i blæren, skyv ned på musens magen å utvise blære innholdet. Fjern all urin fra kateteret ved å skyve et lite stykke papir håndkle inn kateter åpningen. Når papirhåndkle er gjennomvåt med urin, erstatte. Fjern urin kontinuerlig gjennom hele den gjenværende protokoll også under blæren oppblåsthet eksperimenter (se protokoll 3 nedenfor.)
- Sett to sølv ledninger inn i venstre magemusklene og ett sølv wire inn i brystet (som jording.)
- Bruk av alkohol eller jod for å desinfisere område sideveis til høyre for kateteret (dyrets venstre side av kroppen.)
- Expose venstre magemuskelen.
- Hold huden nær venstre abdominal muskel med tang. Lag en liten 1-2 cm snitt med middels kirurgisk saks.
- Sett tuppen av saksen i snitt og forsiktig utvide snitt til 2 cm.
- Bruk pinsett til å flytte liggende fascia å eksponere overlegen skrå magemuskelen. Vær forsiktig med å kutte / rive noen av de store blodårene som finnes i denne regionen.
- Bøy tre sølvtråder i halvparten. Bruk skarp 21 G nål for å ta en liten bit av muskelen. Deretter skyver nålen gjennom muskelen. Når du setter inn i muskelen være forsiktig for ikke å punktere eventuelle indre organer eller indusere unødig skade på muskelen.
- Pinne, en fri ende av en sølvtråd inn i åpningen av det 21 G nål. Trekk forsiktig nålen tilbake gjennom muskelen å trekke sølv wire gjennom muskelen bite. Når nålen er fri fra muskel, trekker forsiktig sølv wire gjennom muskler til løkken i ledningen er i flukt medmuskel bite.
- Gjenta trinn 1.7.3-1.7.4 for andre muskel wire. Denne ledning må plasseres ~ 0,5 cm fra den første muskeltråd. Det er viktig at de to ledninger ikke berører etter innsetting.
- Sett den tredje sølvtråd (bakken) i brystet dårligere til hjertet.
- Bruk skarp 21 G nål for å ta en liten bit av huden (det er ikke nødvendig å gjøre et snitt eller barbere huden) og skyve nålen gjennom huden.
- Sett sølv wire som beskrevet ovenfor, og trekk den gjennom huden.
- Plasser en liten mengde på 37,5 ° C sterile mineralolje i de eksponerte musklene for å holde dem i fuktig og trekke huden over så mye eksponert muskel som mulig.
- Injisere 0,5 ml saltvann subkutant for å opprettholde væskenivået i løpet av påfølgende trinn.
- Forsiktig rulle dyret på siden, slik at kroppstemperaturen lett kan opprettholdes.
2. Partial Anesthesia Step-down Prosedyre (total tid ~ 75 min)
Følgende anestesi protokollen er godkjent av Institutional Animal Care og bruk Utvalget ved Duquesne University og er i samsvar med retningslinjer fra National Institutes of Health.
- Umiddelbart etter at avsnitt I (ovenfor) er fullført, lavere isofluran til 1,5%. Hold på dette nivået i 15 min.
- Lavere isofluran slik at dyret er bedøvet delvis.
- Lavere isofluran med 0,125% hver 15 min til dyr utstillinger en fleksjon respons på tå klemme, men ikke vocalize eller på annen måte bevege seg.
- Vanligvis er et nivå på 0,8-1,0% isofluran optimal, men nivåene kan variere på grunn av forskjeller i anestesi oppsett. Vokalisering og / eller bevegelse og er svært sjeldne hendelser når anestesi er på riktig nivå.
. 3 Elektromyogram (EMG) Opptak Under Blære distensjon med Gradert trykk (15-75 mmHg) (total tid - variabel avhengig av eksperimentet)
- Setup en forsterker, en digitaliserer, og innspillingen programvare. I dette oppsettet har digitaliserings en inngang for forsterkeren og to innganger for trykkregulatoren (trykk og stimulans markør innganger, se nedenfor avsnitt 3.1.2). Nøyaktig maskinvare og programvareoppsett kan tilpasses (se Materialer Liste for spesifikke instruksjoner).
- Setup et system for å levere konkrete utbrudd av lufttrykket til dyr. Dette system er referert til som "tidsstyrt trykkregulator» i den følgende protokoll. Det gir mulighet for automatisert press levering inkludert digitalisering av lufttrykk, kontroll av prøvelengde, inter-rettssaken intervall automasjon, kontroll av prøvenummer og stimulans utbruddet digitalt signal (se Anderson et al. 14 for skjematisk av en tidsbestemt trykkregulator).
- Sett flyt regulator til 60 mmHg (sjekk trykk ved hjelp av en analog sphygmomanometer.)
- Sett tidsstyrt trykkregulator for å levere en 20 sek prepressure intervallet (dette vil være 2V stimulans-signal registreres i digitaliserer Programvaren) etterfulgt av en 20 sek trykk oppblåsthet puls.
- Starter rettssaken (prepressure intervall + press oppblåsthet rettssak). Når den faktiske trykkprøve begynner, doble kontrollere trykket ved hjelp av de tre blodtrykksmålere er koblet til systemet.
- Under trykk oppblåsthet prøve, bør en sterk EMG signal (> 0,5 V) holdes under og eventuelt etter den 20 sek oppblåsthet. Dyret kan utvise abdominal bevegelse, men dyret bør ikke vocalize eller på annen måte flytte. Selv om sjeldne, hvis unormale bevegelser eller vokaliseringer er observert, øke isofluran nivå.
- Mange studier bruker gradert distensions starter på lavt trykk (10-15 mmHg) og jobbe seg opp til skadelige press (75-80 mmHg) i 10-15 mmHg trinn. Se representative resultater under for eksempel spor ved forskjellige trykk.
- Typiske studier inkluderer en 20 sek prepressure intervall, en 20 sek press oppblåsthet rettssaken, og en 1-2 min intertrial intervall.
- Utføre tre distentions ved hvert trykk, og deretter gjennomsnittet for de tre forsøk (for å få et enkelt visceromotor respons for hvert trykk). I en alternativ metode, perform fem distensions ved hvert trykk, forkaste de høye og lave prøvelser, og deretter gjennomsnitt de resterende tre svar.
4. Analyse av Raw EMG Traces
- Analyse av visceromotor svar (dvs. EMG opptak) er lett gjøres ved hjelp av on-board digitaliserer programvare eller gjennom en tredjeparts program (Materialer List) Følgende instruksjoner er generelle instrukser som kan brukes til å analysere disse dataene ved hjelp av flere programmer eller bruke manuell analyse .
- Slik eksporterer EMG, press, og stimulans signaldata fra digitaliserer programvare trenger du følgende:
- Åpne eksperimentell fil.
- Klikk på "File", "Eksporter som."
- Endre filtypen til "regneark tekst (. Txt)," navnet på filen og klikk på "Lagre".
- I den pop-up vindu, endre utgangssamplingsfrekvensen til "1000," endre starttiden til det øyeblikket datainnsamling begynte og endre sluttid til «MaxTime ()." Velg boksen merking "time shift-utgang slik at første linje er en 0,0 sek, "og klikk" OK. "
- Disse dataene vil nå bli eksportert som en tekstfil som kan åpnes i en rekke programmer. Filen skal inneholde fire kolonner (Timer, VMR (EMG), trykk, stimulus).
- For hvert forsøksdyr testet, utføre følgende matematiske operasjoner.
- Korriger EMG-signal for hele datasettet ved å beregne den absolutte verdien av hvert tidspunkt.
- Bestem gjennomsnittlig EMG-respons i løpet av bakgrunnsdelen av forsøket.
- Trekk fra denne gjennomsnittsbakgrunns EMG respons fra hver korrigert datapunkt i eksperimentet for å skaffe bakgrunnen korrigert datasett.
- Bestem arealet under kurven (AUC) for hver 20 sek pretrykkintervall i bakgrunnen korrigert datasett.
- Bestem AUC for hver 20 sek press distensjon rettssaken i bakgrunnen korrigert datasett.
- Dele hver trykk distensjon prøve AUC (oppnådd i trinn 4.3.5) av den laveste prepressure intervallet AUC fra hele eksperimentet (oppnådd i trinn 4.3.4.). Dette er den normaliserte AUC og bakgrunns korrigert for hver fullstendig trykk oppblåsthet prøving.
- For hvert forsøksdyr, til gjennomsnittlig flere normalisert forsøk fra et enkelt trykk oppnå normal VMR i volt * sek (Vsec).
- Utfør de nødvendige statistikk på data avhengig av eksperimentell design.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En illustrasjon av den generelle UBD-VMR oppsett kan sees i figur 1A. Økende trykk-trinn indusere en økning i det rå VMR (dvs. EMG) (figur 1B.) Den rå VMR, trykk, og stimulus markør signal som må overholdes under opptaket ved bruk av digitaliserer Programvaren kan sees i figur 2. Toppen kanalen sett i Fig. 2 viser EMG spor (i V). Bakgrunnssignalet til EMG spor bør være jevn og lav amplitude (<0,2 V). Hvis bakgrunnen er høy eller inneholder sporadiske store pigger (> 0,5 V) ledninger og forsterker innstillinger må kanskje justeres. I noen tilfeller innpakning ledninger (fra mus til forsterker og / eller forsterker digitaliseringskretsen) i folie kan redusere noe støy. Den midtre kanal i Figur 2 viser trykksignal som kvantifiseres ved den tidsbestemte trykkregulator i mmHg. Legg merke til at signal utbruddet er en kurve. Dette skjer fordi full oppblåsthet avblæren er ikke umiddelbar. Når trykksignal når den maksimale verdien for denne studie (f.eks 75 mm Hg i figur 2), bør trykket ligge på den maksimale verdi. Av og til kan luft lekke ut av urinrøret rundt kateteret. Dette skjer oftest ved høye trykk (f.eks.> 60 mm Hg), kan observeres ved en forandring i amplituden av trykksignalet, og kan reduseres ved å tilsette en liten mengde av kirurgisk smøremiddel rundt urinrørsåpningen. Den avsluttende kanal (nederst på figur 2) viser stimulus markør kanal. Den stimulans markør kanal viser to separate signaler. Ved begynnelsen av den prepressure intervall er det en momentan 2 V signalmarkør. Dette signalet kan brukes for å automatisere prosessen dataanalyse for et gitt eksperiment. Nærmere bestemt, kan man programmere en dataanalyse system for å skanne gjennom en datafil på jakt etter stimulans markører som stiger over 1,5 V. Dette gjør at dataanalyse system å quickly finne hver hele rettssaken. Den andre komponenten av stimulus kanal er en 1 V signal som opptrer i løpet av hele trykk oppblåsthet prøving. Igjen, kan nærværet av dette andre signal benyttes for enkel dataanalyse.
Representative data fra en enkelt eksperimentell dyre kan sees i figur 3 og tabell 1 Dyret var oppblåst tre ganger ved hver av de følgende trykk:. (. Figur 3A, Tabell 1) 15, 30, 45, 60, og 75 mmHg Den tre distentions er gjennomsnitt og representert som en enkelt datapunkt i grafen. Legg merke til at de normaliserte signal øker gradvis med økende blæren oppblåsthet press. Etter denne innledende distensjon set, mottas dette dyret ytterligere to sett av graderte blæren oppblåsthet. Som vist i figur 3B, andre og tredje sett av distentions produserte lignende VMRs (ved hvert trykk.) Disse tre sett av distentions skjedde over en 2,5 timers period å demonstrere stabiliteten av opptaket er konfigurert og reproduserbarheten til UBD stimulus og VMR respons i et enkelt dyr. Viktigere, langtidsstabilitet av denne prep kun oppstår når isofluran anestesi gradvis trappet ned i løpet av 1 time. En kortere anestesiprosedyre kan føre til et progressivt tap i UBD VMR signal med hvert sett av distentions (upubliserte observasjoner, Sadler og Kolber.) En annen kritisk faktor for stabiliteten i UBD VMR-system er å opprettholde en stabil kroppstemperatur. Som vist i figur 4, den UBD VMR (som reaksjon på 60 mmHg oppblåsthet) er vesentlig lavere ved 33,5 ° C kroppstemperatur sammenlignet med 37,5 ° C.
Figur 1. Visceromotor responser (VMR) fra UBD. (A) skjematiskc av UBD oppsett. Komprimert luft blir levert inn i blæren via uretralt kateter. Under distensions, elektroder i magemuskelen rekord EMG. Gjennom hele prosedyren, blir temperaturen opprettholdt ved hjelp av en batteridrevet varmeputen, og overliggende lampe. (B) Eksempel EMG spor under UBD. Som trykket øker, elektriske produksjonen fra magemusklene øker congruently.
Figur 2. Skjermdump som viser data under UBD rettssaken. Tre kanaler som skal vises. Den øverste kanal viser rå EMG spor (i V.) Den midtre kanalen viser trykket (i mmHg) som blir levert til blæren. Den nederste kurven viser stimulus markør kanal som indikerer starten av prepressure intervall og hele trykk oppblåsthet prøving. Bildet er en 40 sek komplett studie (20 sek prepressure intervall pluss 20 sek press oppblåsthet rettssaken.)
Figur 3. Representative data som viser gradert VMR. (A) De normaliserte VMR øker gradvis med økende trykk (15-75 mmHg) levert til blæren av musen. (B) Etterfølgende sett av blære distentions (15-75 mmHg = 1 sett) viser lignende VMRs sammenlignet med første settet med distentions.
. Figur 4 kroppstemperaturen synker UBD VMR En reduksjon i kroppstemperatur fra 37,5 ° C til 33,5 ° C fører til en betydelig reduksjon i UBD VMR. (N = 6,. Paret t-test * P <0,05)
Tabell 1. Representative data for et komplett sett med distentions. Tabell viser data inkludert press oppblåsthet AUC, prepressure intervall AUC, bakgrunn korrigert press oppblåsthet AUC, og normalisert trykk oppblåsthet AUC. For hvert trykk, fikk dyret tre oppblåsthet forsøk. Gjennomsnittet av det normaliserte trykk oppblåsthet AUC ved hvert trykk er plottet i figur 3A.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hos mennesker, representerer interstitiell cystitt / blære smertesyndrom (IC / BPS) en betydelig klinisk problem fordi pasienter har invalidiserende smerter som ofte ikke svarer til vanlig smertebehandling 15. En av de store utfordringene i forståelse og til slutt behandle kronisk blæren smerte er å forstå de normale nevrale prosesser som er involvert i respons til giftige blæren oppblåsthet. For å overvinne denne utfordringen er det nødvendig med en dyremodell av blæren smerte. Denne modellen bør være reproduserbar, stabil, og lett måles. Heldigvis, Ness og kolleger 10 utviklet et system som kan brukes til å undersøke fysiologiske responser til skadelige blæren oppblåsthet.
Systemoppsett er enkel og kan gjøres ved hjelp primært off-the-sokkel maskinvare og programvare. Den store tilpasset stykke av utstyret som er involvert i UBD VMR systemet er tidsbestemt trykkregulator. Denne maskinen gir en analog-Til-digital konvertering av lufttrykk og sender stimuleringselle markørene til digitaliserings maskinvare. Bruken av den tidsbestemte trykkregulator forenkler data-analyse ved automatisk å synkronisere trykk stimulus med den innspilte EMG (f.eks. VMR) Dette er viktig fordi den VMR ikke nødvendigvis starter nøyaktig når blæren er oppblåst, og først den VMR blir ofte opprettholdt en kort periode (<5 sek) etter utløpet av oppblåsthet. Likevel, med forsiktig synkronisering, kunne man enkelt utføre UBD VMR prosedyren med en on / off regulator for å kontrollere oppblåsthet on / off og en timer som er synkronisert med den innspilte EMG-signalet.
En stor fordel med UBD VMR system for avhør nervesystemet rolle i blæren smerte er at svarene på gradert blæren oppblåsthet presset faller langs en standard kurve med økende press induserer større VMRs. Dette gjør det mulig for forskeren å lett finne ut om en eksperimentell mannipulation fører til en økning eller reduksjon i VMR på både ufarlige og skadelige blæren oppblåsthet press. I tillegg, er signalet fra en enkelt dyr meget stabile over tid, slik at flere runder med gradert distensjon kan utføres (figur 3B). Dette tillater forskere for å skaffe en grunnlinje UBD VMR og deretter manipulere dyret (f.eks levere et legemiddel) for innenfor-faget matchende 13. Forskere har brukt UBD-VMR system (i mus og rotter) for å ta opp eller manipulere ryggmargen dorsalhorn nevroner 16 og andre nerveceller i sentralnervesystemet (f.eks rostral ventral medulla 17 eller amygdala 13,16.) Disse studiene og andre fortsetter å legge til vår grunnleggende vitenskapelig forståelse av rollen til ulike komponenter i nervesystemet i behandlingen av blæren sanseinntrykk og til slutt den subjektive smerte følte fra denne nociceptiv innspill. Mens UBD VMR system inkluderer mange eksperimentelle fordeler denre er noen begrensninger i modellen. Først, mens visceralt blæren oppblåsthet fremkaller subjektive følelser av "smerte" hos mennesker er det umulig å vite om mage EMG opptak i mus er virkelig representativ for smerte. Likevel er UBD VMR responser hemmet av vanlige smertestillende som tyder på at VMR er en smerte-lignende respons. For det andre, i den nåværende UBD-VMR system, blir dyrene bedøvet under opptak. Selv om en sammenligning av levende versus bedøvet UBD VMR har validert ved bruk av anestesi 10, er det mulige ukjente effekter av isofluran med smertelignende responser. For det tredje er den beskrevne protokollen ikke en overlevelse kirurgi så flere innspillinger av enkelte mus over tid er ikke mulig. Likevel, vil bruk av UBD-VMR modellen samt andre viscerale smertesystemer gi rom for en mer fullstendig forståelse av visceral smerte og vil føre til nye terapeutiske muligheter for pasienter som lider av IC / BPS og andre viscerale smertetilstander.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi ønsker å takke legene. Robert Gereau, Henry Lai, og Lara Crock for sine nyttig hjelp til å sette opp dette systemet. Vi ønsker også å erkjenne finansieringskilder for dette arbeidet (BJK - International Association for Study of Pain Early Career Forskning Grant ved Scan | Design Foundation ved INGER & JENS BRUUN og Duquesne University Hunkele fryktede sykdommen Fund).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Infrared heating blanket and monitoring system | Kent Scientific | Right-Temp System | This system is set up to monitor two separate temperatures. This should include the animal and the heating blanket. In addition, the system can automatically adjust the temperature to maintain a set temp. However, this automatic function produces electrical interference during EMG recording and must be turned off. Kent can provide a battery pack for the heating pad for use during the riEMG recording part of the experiment. |
| Isoflurane vaporizer | Draeger | Vapor 19.1 | Any isoflurane vaporizer will work, but it is helpful to have one that has multiple notches between 0-2% isoflurane. |
| Isoflurane | multiple sources | n/a | |
| 100% Oxygen air tank | multiple sources | n/a | For ventilation of animal |
| Air breathing grade | multiple sources | n/a | For bladder distention |
| 24 G 0.56 in IV catheter | BD Biosciences | 381411 | For bladder catheterization |
| Surgilube (sterile) | Savage Laboratories | 0281-0205-02 | Any surgical grade lubricate would work fine. |
| Mineral oil (sterile) | multiple sources | n/a | |
| Saline (sterile) | multiple sources | n/a | |
| AG8W Silver Wire, 2 m, 0.20 mm (.008 in) D, L, No Insulation | Warner Instruments | W4 64-1318 | Any silver wire with these specifications will work. Wire does not need to be "chlorinated." |
| Ophthalmic ointment | multiple sources | n/a | |
| Small surgical scissors | multiple sources | n/a | |
| Sharp forceps | multiple sources | n/a | |
| 21 G Needle | multiple sources | n/a | |
| Grass amplifier P511 with 3-lead input cable | Grass Instruments | P511 (F-P5IC3/REV1) | This is the "amplifier" used in the protocol. Amplifier with the following settings: Calibrator = 1 mV; Lo freq = 300 Hz; Amplification = 20; Hi freq = 10 kHz; Line filter = in. |
| Cambridge Electronic Design (CED) 1401 Plus (or equivalent) | Cambridge Electronic Design | 1401 Plus | This is the "digitizer" used in the protocol. Other digitizer systems from WINDAQ or other companies would work fine; Need inputs for pressure signal, EMG, and stimulus signal. |
| CED Spike2 software | Cambridge Electronic Design | Spike 2 | This is the the "digitizer software" used in the protocol. Should be from same manufacturer as digitizer. Program should be setup with 3 channels for pressure (0-100 mmHg scale), EMG signal (typically -5 to +5 V range), and stimulus marker (0-2 V) range. |
| Flow chart from air tank to bladder catheter | n/a | n/a | Sequence of connections from pressurized air tank to animal bladder: Air tank to 1/4 in tubing to Gilmont flowmeter to y connector. Branch 1 of y connector to to sphygmomanometer. Branch 2 to a single input on the 4-way gang valve to 4-way valve output to the timed pressure regulator to 3/32 tubing from timed pressure regulator to 2nd y connector (branch 1 to sphygmomanometer) with branch 2 to 3/32 tubing to a 3rd y connector. Branch 1 of y connector to a 3rd sphygmomanometer and branch 2 to animal bladder catheter. |
| Gilmont Flowmeter | Gilmont | GF8321-1401 | Multiple brands of flowmeters will work. For bladder distention air, flow meter should be able to handle high pressures (such as this Gilmont meter). For breathing air, flow rate should be adjustable down to 100 ml/min (typical mouse rate is 500-1,000 ml/min). |
| 4-way Gang valve | Elite | This is a specific piece of equipment. The Elite gang valve is designed for fish tanks at low air pressures. In the bladder distention setup, this valve acts as a safety valves in case the pressure spikes. Too high pressure during initial turning on of the tank will ruin the pressure transducer in the Timed pressure regulator and/or the sphygnometers. In addition, by providing a small amount of leak in the system, this valve makes it easier to adjust the pressure between 10-80 mmHg. | |
| 1/4 in Tubing | multiple sources | n/a | |
| 3/32 inch Tubing | multiple sources | n/a | |
| "Y" connectors (1/4 and 3/32 in) | multiple sources | n/a | |
| Sphygmomanometer | CVS | Any analog sphygmomanometer from a drug store will work for this application. | |
| Timed Pressure Regulator | custom | This is a custom built machine (Washington University in St. Louis Machine shop) that allows for automated pressure delivery including digitization of air pressure, control of trial length, inter-trial interval automation, control of trial number, and stimulus onset digital signal. However, the basic components of the system (pressure on and off for a given trial period) could be controlled with a simple on/off in-line switch. Such analog control of a trial would necessitate additional analysis parameters (see Protocol 4). In addition, one would have to manually assign the pressure based on the analog sphygmomanometer during data analysis. | |
| IGOR Pro | Wavemetrics | n/a | For analysis of EMG signal. Many different types of software can be used for data analysis in these experiments. |
References
- Merskey, H., Bogduk, N. Classification of Chronic Pain. , IASP Press. (1994).
- Gureje, O., Korff, M. V., Simon, G. E., Gater, R. Peristent pain and well-being. A World Health Organization study in primary care. J. Am. Med. Assoc. 280, 147-151 (1998).
- Gaskin, D. J., Richard, P. The economic costs of pain in the United States. J. Pain. 13, 715-754 (2012).
- Berry, S. H., et al. Prevalence of Symptoms of Bladder Pain Syndrome/Interstitial Cystitis Among Adult Females in the United States. J. Urol. 186, 540-544 (2011).
- Tunitsky, E., et al. Bladder Pain Syndrome/Interstitial Cystitis in twin sisters. J. Urol. 187, 148-152 (2012).
- Tettamanti, G., et al. Influence of smoking, coffee, and tea consumption on Bladder Pain Syndrome in female twins. Urology. 77, 1313-1317 (2011).
- Warren, J. W., et al. Harrison's Principles of Internal Medicine. Longo, D. L., et al. , McGraw-Hill. New York. (2012).
- Baldoni, F., Ercolani, M., Baldaro, B., Trombini, G. Stressful events and psychological symptoms in patients with functional urinary disorders. Perceptual Motor Skills. 80, 605-606 (1995).
- Tannenbaum, C., Gray, M., Hoffstetter, S., Cardozo, L. Comorbidities associated with bladder dysfunction. Int. J. Clin. Practice. 67, 105-113 (2013).
- Ness, T. J., Elhefni, H. Reliable visceromotor responses are evoked by noxious bladder distention in mice. J. Urol. 171, 1704-1708 (2004).
- Ness, T. J., Richter, H. E., Varner, R. E., Fillingim, R. B. A psychophysical study of discomfort produced by repeated filling of the urinary bladder. Pain. 76, 61-69 (1998).
- Ness, T. J., Gebhart, G. F. Visceral pain: a review of experimental studies. Pain. 41, 167-234 (1990).
- Crock, L. W., et al. Central amygdala metabotropic glutamate receptor 5 in the modulation of visceral pain. J. Neurosci. 32, 14217-14226 (2012).
- Anderson, R. H., Ness, T. J., Gebhart, G. F. A distension control device useful for quantitative studies of hollow organ sensation. Physiol. Behav. 41, 635-638 (1987).
- Dimitrakov, J., et al. Pharmacologic Management of Painful Bladder Syndrome/Interstitial Cystitis: A Systematic Review. Arch. Intern. Med. 167, 1922-1929 (2007).
- Qin, C., Van Meerveld, B. G. reenwood-, Foreman, R. D. Spinal neuronal responses to urinary bladder stimulation in rats with corticosterone or aldosterone onto the amygdala. J. Neurophysiol. 90, 2180-2189 (2003).
- Randich, A., Mebane, H., DeBerry, J. J., Ness, T. J. Rostral ventral medulla modulation of the visceromotor reflex evoked by urinary bladder distension in female rats. J. Pain. 9, 920-926 (2008).
