Summary
Aproximadamente 3-8 million de personas en Estados Unidos sufren de síndrome de dolor cistitis intersticial / vejiga (IC / BPS), una condición debilitante que se caracteriza en parte por el dolor pélvico. Con el fin de estudiar las contribuciones del sistema nervioso a la condición, un modelo fisiológico de dolor en la vejiga urinaria se utiliza en ratones y ratas.
Abstract
Aproximadamente 3-8 million de personas en Estados Unidos sufren de síndrome de cistitis dolor / vejiga intersticial (IC / BPS), una condición debilitante que se caracteriza por el aumento de la urgencia y la frecuencia de la micción, así como la nicturia y dolor pélvico general, especialmente en el llenado de la vejiga o micción. A pesar de años de investigación, la causa de la IC / BPS sigue siendo difícil de alcanzar y las estrategias de tratamiento no son capaces de proporcionar un alivio completo a los pacientes. Con el fin de estudiar las contribuciones del sistema nervioso a la condición, se han desarrollado muchos modelos animales para imitar el dolor y los síntomas asociados con IC / BPS. Uno de estos modelos murinos es la distensión de la vejiga urinaria (UBD). En este modelo, el aire comprimido de una presión determinada se entrega a la vejiga de un animal ligeramente anestesiados durante un período determinado de tiempo. Durante todo el procedimiento, los cables de los músculos abdominales oblicuos superiores registran la actividad eléctrica del músculo. Esta actividad se conoce como la respuesta visceromotor (VMR) eisa medida fiable y reproducible de la nocicepción. A continuación, describimos los pasos necesarios para llevar a cabo esta técnica en ratones, incluyendo manipulaciones quirúrgicas, grabación fisiológica, y el análisis de datos. Con el uso de este modelo, la coordinación entre las neuronas sensoriales primarias, la médula espinal aferentes secundarias, y áreas del sistema nervioso central superior que participan en dolor de la vejiga puede ser descifrado. Este conocimiento básico de la ciencia puede entonces ser clínicamente traducido para el tratamiento de pacientes que padecen IC / BPS.
Introduction
El dolor crónico se define oficialmente como el dolor que persiste durante aproximadamente tres meses, o por más tiempo que el tiempo normal de curación de los tejidos 1. Este tipo de dolor es una de las principales razones por las que las personas se ven obligadas a buscar atención médica de 2 y puede llegar a costar hasta $ 635 mil millones de dólares anuales 3. Las estrategias de afrontamiento del dolor crónico actual se consideran arcaica; después de décadas de avances médicos, los AINE (medicamentos anti-inflamatorios no esteroideos) y los opiáceos siguen siendo los principales tratamientos prescritos por los médicos. Sin embargo, estos tratamientos se dirigen a todos los diferentes tipos de dolor de la misma manera, proporcionar efectos analgésicos en todo el cuerpo en lugar de centrado específicamente en la causa de ese incidente exacta dolor. Con el fin de ayudar mejor a las personas que sufren de dolor crónico, atención de la investigación debe ser desplazado hacia la etiología y los posibles tratamientos para el dolor específico asociado con las causas más comunes de dolor crónico. El objetivo de este manuscript es describir un modelo utilizado para comprender mejor una condición conocida como síndrome de la cistitis intersticial / dolorosa de la vejiga (IC / BPS).
IC / BPS es una condición debilitante que afecta a millones de personas, principalmente mujeres mayores de 40 años 4. Las causas exactas de la IC / BPS no se conocen, sin embargo la prevalencia se ha relacionado con la genética 5, dietas específicas, y altos niveles de estrés 6 . Los síntomas de la IC / BPS incluyen pero no se limitan a: Aumento de la urgencia de orinar, aumento de la frecuencia de la micción, dolor, perforación, o ardor durante el llenado de la vejiga y la micción, nicturia y 7. Los pacientes que experimentan estas condiciones tienen mayores niveles de estrés y son más ansiosos 8. Esto aumentó el estrés resulta en un aumento del dolor, lo que aumenta los niveles de estrés originales. Los estudios han demostrado que los niveles de depresión y ansiedad disminuyen siguientes tratamientos que alivian el dolor urinaria, rompiendo así eficazmente este ciclo de retroalimentación positiva Con el fin de estudiar las contribuciones del sistema nervioso a la condición, se han desarrollado muchos modelos animales para imitar el dolor y los síntomas asociados con IC / BPS. Tradicionalmente, la cistitis se ha recreado en animales con la introducción de diversos productos químicos tales como aceite de mostaza, acetona, lipopolisacárido, ácido clorhídrico, y ciclofosfamida en la vejiga. Sin embargo no hay agentes extranjeros están presentes en la orina estéril de pacientes IC / BPS, cuestionando así la validez de estos modelos. Otro modelo murino de dolor urológico es la distensión de la vejiga urinaria (UBD) 10. En este modelo, el aire comprimido de una presión determinada se entrega a la vejiga de un animal despierto o ligeramente anestesiados durante un período determinado de tiempo. Durante todo el procedimiento, los alambres en el oblicuo músculos abdominales registro activ eléctrico superiordad del músculo (con un electromiograma (EMG)). Esta actividad se conoce como la respuesta visceromotor (VMR) y es fiable medida, reproducible de la nocicepción 10. Similar distensión órgano hueco (por ejemplo, la vejiga, el recto) en voluntarios humanos sanos produce sentimientos de malestar y aumentos significativos en el dolor reportado 11,12, rasgos que se utilizan a menudo para diagnosticar IC / BPS. Por lo tanto, en conjunción con métodos eléctricos, farmacológicos, y optogenetic de estimulación o inhibición, UBD es un modelo útil y válida para comprender tanto los componentes del sistema nervioso periférico y central de la nocicepción y el dolor de la vejiga. Aquí se describe el procedimiento para UBD que se utiliza actualmente en nuestro laboratorio dentro de los miembros femeninos de la cepa de ratón común, C57Bl/6J. Debido a las dificultades en el proceso de cateterismo de machos, este procedimiento se lleva a cabo principalmente en ratones hembra. Este protocolo ha sido adaptado de la desarrollada por Ness <em> et al 10. y publicado previamente en nuestro laboratorio 13. El siguiente protocolo describe cuatro componentes principales de este modelo en animales anestesiados: (1) del catéter de la vejiga y cirugía electrodo de registro (2) inducción de la anestesia parcial (3) distensión de la vejiga y de grabación VMR, y (4) de análisis de datos de huellas primas VMR / EMG . Las diferencias sutiles en el procedimiento UBD-VMR debido a la elección del organismo, la profundidad de la anestesia y la inducción, y la temperatura corporal se discuten a continuación.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
El siguiente protocolo ha sido aprobado por el Comité de Cuidado de Animales institucional y el uso en la Universidad de Duquesne y está en consonancia con las directrices de los Institutos Nacionales de Salud.
1. Implante quirúrgico de alambre Electrodos y vejiga urinaria Catéter utilizando técnicas estériles (tiempo total de 5 a 10 min)
- Los siguientes artículos deben estar preparados antes de la cirugía de partida:
- Activamente controlar y ajustar la temperatura corporal a 37,5 ± 0,5 ° C usando el sistema de monitorización de la temperatura con una almohadilla eléctrica a pilas y de los animales de la sonda de la temperatura corporal (Lista de Materiales) Conecte el sistema automático para una lámpara de calor de baja potencia para el control adicional de la temperatura corporal.
- Equipo necesario para la anestesia isoflurano incluye aire comprimido (por ejemplo, 100% O 2), vaporizador de isoflurano, isoflurano, cámara de inducción con isoflurano (por caída inicial), cono de la nariz, y el sistema de escape.
- Ensamble ªe instrumentos adecuados quirúrgicos, catéter intravenoso, y electrodos (Lista de Materiales)
- Inducir el estado anestésico en la cámara de inducción a un 2-3% isoflurano. Retire del ratón de la cámara cuando reflejo de enderezamiento se pierde (0-1 min).
- Coloque el ratón en el cono de la nariz con el 2-2,5% de isoflurano. Apriete los dedos para comprobar si la anestesia completa. No debería haber ninguna respuesta por parte del animal. Inicie el temporizador.
- Coloque 1 gota de pomada oftálmica en cada ojo de ratón.
- Gire ratón sobre tan cara dorsal quede hacia abajo.
- Inserte catéter a través de la uretra y en la vejiga.
- Sumergir catéter en lubricante quirúrgico para lubricar catéter.
- Aplique suavemente la abertura uretral con unas pinzas puntiagudas perpendiculares al cuerpo del animal. Sosteniendo el catéter con el conjunto 2 º de pinzas, inserte con cuidado extremo de catéter en la uretra en un ángulo perpendicular al cuerpo del animal.
- Cuando el catéter ha entrado en la uretra ~ 1-2 mm, ajuste suavemente catéter de modo que ahora está paralela al cuerpoapuntando hacia la cabeza. Este movimiento es necesario para evitar el hueso púbico.
- Empuje suavemente el catéter hacia el cuerpo del ratón. El catéter debe deslizarse en la cavidad corporal sin problemas y sin resistencia. No fuerce el catéter. Si el catéter no entra sin problemas, vuelva a la posición del catéter perpendicular y empezar de nuevo.
- Con el catéter completamente insertado en la vejiga, empuje suavemente hacia abajo en el abdomen del ratón para expulsar el contenido de la vejiga. Quite toda la orina de catéter empujando un pequeño pedazo de toalla de papel en la abertura del catéter. Cuando toalla de papel está empapado de orina, reemplazar. Retire la orina continuamente durante todo el protocolo que queda incluida en los experimentos distensión vesical (véase el Protocolo 3 a continuación.)
- Inserte dos alambres de plata en los músculos abdominales a la izquierda y un alambre de plata en el pecho (como un suelo.)
- Use alcohol o yodo para desinfectar el área lateral a la derecha del catéter (lado izquierdo del cuerpo de los animales.)
- La exposicion músculo abdominal izquierda.
- Mantenga la piel cerca del músculo abdominal izquierda con fórceps. Haga una pequeña incisión de 1-2 cm con tijeras quirúrgicas medianas.
- Inserte la punta de la tijera en la incisión y expandir suavemente la incisión hasta 2 cm.
- El uso de fórceps para mover fascia suprayacente para exponer el músculo abdominal oblicuo superior. Tenga cuidado de no cortar / copiar cualquiera de los principales vasos sanguíneos que se encuentran en esta región.
- Doblar tres alambres de plata en medio. Utilice afilada aguja 21 G para tomar un pequeño bocado del músculo. A continuación, empuje la aguja a través del músculo. Cuando se inserta en el músculo tenga cuidado de no perforar ningún órgano interno o inducir daño innecesario al músculo.
- Pegue un extremo libre de un alambre de plata en la abertura de la aguja de calibre 21. Tire suavemente la aguja hacia atrás a través del músculo para dibujar el alambre de plata a través de la picadura del músculo. Cuando la aguja está libre de músculo, tire suavemente de alambre de plata a través del músculo hasta que el bucle en el cable esté alineado con lamordedura muscular.
- Repita los pasos 1.7.3-1.7.4 para alambre segundo muscular. Este cable debe ser colocado ~ 0,5 cm de la primera cable muscular. Es importante que los dos cables no se toquen después de la inserción.
- Inserte la tercera alambre de plata (suelo) en el pecho inferior a la del corazón.
- Utilice afilada aguja 21 G para tomar un pequeño bocado de la piel (no es necesario hacer una incisión o afeitar la piel) y empujar la aguja a través de la piel.
- Inserte el alambre de plata como se describió anteriormente y pasar a través de la piel.
- Coloque una pequeña cantidad de 37.5 ° C el aceite mineral estéril sobre los músculos expuestos para mantenerlos húmedos y tire de la piel sobre el músculo tanto expuestos como sea posible.
- Inyectar 0,5 ml de solución salina por vía subcutánea para ayudar a mantener los niveles de líquido en los pasos siguientes.
- Rodar suavemente sobre el lado de los animales de manera que la temperatura del cuerpo se puede mantener fácilmente.
2. Procedimiento Step-down anestesia parcial (total Tiempo de ~ 75 min)
El siguiente protocolo de anestesia ha sido aprobado por el Comité de Cuidado de Animales institucional y el uso en la Universidad de Duquesne y está en consonancia con las directrices de los Institutos Nacionales de Salud.
- Inmediatamente después de la Sección I (arriba) es completa, isoflurano inferior a 1,5%. Se mantiene a este nivel durante 15 min.
- Baja isoflurano tal que el animal se anestesia parcialmente.
- Bajo isoflurano por 0,125% cada 15 minutos hasta exhibiciones de animales de una respuesta a la flexión pizca dedo del pie pero no vocalizar o mover de otra manera.
- Típicamente, un nivel de 0,8-1,0% de isoflurano es óptimo, sin embargo los niveles pueden variar debido a las diferencias en las configuraciones de la anestesia. La vocalización y / o la deambulación son eventos extremadamente raros en que la anestesia está en el nivel adecuado.
. 3 electromiografía (EMG) de grabación Durante la vejiga Distensión con presiones Graded (15-75 mmHg) (tiempo total - variable según el experimento)
- Configuración de un amplificador, un digitalizador, y el software de grabación. En esta configuración, el digitalizador tiene una entrada para el amplificador y dos entradas para el regulador de presión (presión y entradas de marcador de estímulo, véase la sección 3.1.2). Configuración del hardware y el software de Exact es personalizable (ver Lista de materiales para obtener instrucciones específicas).
- Configurar un sistema para entregar ráfagas específicas de presión de aire al animal. Este sistema se conoce como el "regulador de presión temporizada" en el siguiente protocolo. Permite el suministro de presión automatizado incluyendo digitalización de presión de aire, el control de la duración del ensayo, la automatización intervalo entre ensayos, el control del número de prueba, y el estímulo de la señal digital de inicio (ver Anderson et al. 14 para esquemática de un regulador de presión temporizada).
- Ajuste el regulador de flujo a 60 mmHg (presión cheque utilizando un esfigmomanómetro analógica.)
- Ajuste el regulador de presión temporizada para suministrar un intervalo de presión previa 20 seg (esta será la señal de estímulo 2V grabada en software digitalizador) seguido por un pulso de presión de distensión 20 seg.
- Inicie el ensayo (intervalo de presión previa + juicio distensión de presión). Cuando comience el juicio presión real, vuelva a comprobar la presión con los 3 esfigmomanómetros conectados al sistema.
- Durante el juicio, la distensión de presión, una fuerte señal de EMG (> 0,5 V) se debe observar durante y posiblemente después de la distensión seg 20. El animal puede mostrar abdomimovimiento nal pero el animal no deben vocalizar o moverse de otro modo. Aunque es raro, si se observan movimientos anormales o vocalizaciones, aumentar el nivel de isoflurano.
- Muchos estudios utilizan distensiones graduadas comenzando a baja presión (10-15 mmHg) y trabajar hasta presiones nocivas (75-80 mmHg) en incrementos de 10 a 15 mmHg. Ver resultados representativos se muestran a continuación por ejemplo rastros a diferentes presiones.
- Ensayos típicos incluyen un intervalo de 20 segundos de presión previa, una prueba de presión de distensión 20 seg, y un intervalo entre 1-2 min.
- Haz tres distensiones en cada presión y que la media en los tres ensayos (para obtener una sola respuesta para cada visceromotor presión). En un método alternativo, perform cinco distensiones en cada presión, descartar los ensayos de alta y baja, y luego un promedio de las tres respuestas restantes.
4. Análisis de Raw EMG Traces
- Análisis de las respuestas visceromotor (es decir, registros de EMG) se realiza fácilmente utilizando el software digitalizador de a bordo oa través de un programa de terceros (Lista de Materiales) Las siguientes instrucciones son instrucciones generales que podrían ser utilizados para analizar estos datos mediante múltiples programas o utilizando el análisis manual .
- Para exportar EMG, presión y datos de señal de estímulo de software digitalizador hacer lo siguiente:
- Abra el archivo experimental.
- Haga clic en "Archivo" "Exportar como".
- Cambiar el tipo de archivo a "texto de hoja de cálculo (. Txt)," un nombre al archivo y haga clic en "Guardar".
- En la poventana de p-up, cambiar la frecuencia de muestreo de salida a "1000", cambiar la hora de inicio de la recolección de datos se inició momento y cambiar la hora de finalización a "MaxTime ()". Seleccione el cuadro de marcación "de salida de cambio de hora por lo que la primera línea es un 0.0 seg ", y haga clic en" OK ".
- Los datos ahora pueden exportar como un archivo de texto que se puede abrir en una variedad de programas. El archivo debe contener cuatro columnas (Timer, VMR (EMG), de presión, de estímulo).
- Para cada animal experimental probado, realice las siguientes operaciones matemáticas.
- Rectificar señal EMG para el conjunto mediante el cálculo del valor absoluto de cada punto de tiempo completo de datos.
- Determine el promedio de respuesta de EMG durante la sección de antecedentes del experimento.
- Reste este fondo media EMG respuesta desde todos los puntos de datos rectificados en el experimento para obtener el fondo conjunto de datos corregida.
- Determinar el área bajo la curva (AUC) para cada 20 seg de preintervalo de presión en el fondo conjunto de datos corregida.
- Determinar las AUC para cada 20 seg juicio distensión de presión en el fondo conjunto de datos corregida.
- Divide cada AUC juicio distensión de presión (que se obtiene en el paso 4.3.5) por el intervalo de presión previa más baja AUC de todo el experimento (obtenido en el paso 4.3.4.). Este es el AUC corregido normalizado y el fondo de cada ensayo completo distensión presión.
- Para cada animal experimental, múltiples ensayos normalizados promedio de una sola presión para obtener el VMR normalizada en voltios * seg (Vsec).
- Realizar las estadísticas apropiadas sobre los datos dependiendo del diseño experimental.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Un ejemplo de la configuración general UBD-VMR se puede ver en la Figura 1A. El aumento de las medidas de presión inducen un aumento en la VMR en bruto (es decir, EMG) (Figura 1B). La VMR prima, la presión, y la señal de marcador de estímulo que debe ser observado durante la grabación usando el software digitalizador se puede ver en la Figura 2. El canal superior visto en La figura 2 es la huella EMG (en V). La señal de fondo de la traza EMG deberá ser regular y baja amplitud (<0,2 V). Si el fondo es alto o contiene grandes picos esporádicos (> 0,5 V) de los cables y la configuración del amplificador puede ser necesario ajustar. En algunas circunstancias que envuelven los cables (de ratón al amplificador y / o amplificador al digitalizador) en papel de aluminio puede reducir algo de ruido. El canal central en la Figura 2 muestra la señal de presión tal como se cuantifica por el regulador de presión temporizada en mmHg. Tenga en cuenta que la aparición de la señal es una curva. Esto se debe a la distensión total dela vejiga no es instantánea. Una vez que la señal de presión alcanza el valor máximo para ese ensayo (por ejemplo, 75 mmHg en la Figura 2), la presión debe permanecer en ese valor máximo. En ocasiones, el aire puede salir de la uretra alrededor del catéter. Esto ocurre más a menudo a altas presiones (por ejemplo.> 60 mmHg), se puede observar por un cambio en la amplitud de la señal de presión, y se puede reducir mediante la adición de una pequeña cantidad de lubricante quirúrgico alrededor de la abertura uretral. El canal final (parte inferior de la figura 2) muestra el canal marcador de estímulo. El canal marcador de estímulo muestra dos señales separadas. En el comienzo del intervalo de presión previa no es una señal momentánea marcador de 2 V. Esta señal se puede utilizar para automatizar el proceso de análisis de datos para un experimento dado. En concreto, se puede programar un sistema de análisis de datos para buscar a través de un archivo de datos en busca de marcadores de estímulo que se elevan por encima de 1,5 V. Esto permite que el sistema de análisis de datos para quickly encontrar cada ensayo completo. El segundo componente del canal de estímulo es una señal de 1 V que se produce durante todo el juicio distensión presión. Una vez más, la presencia de esta segunda señal se puede utilizar para el análisis de datos fácil.
Los datos representativos de un solo animal de experimentación se puede ver en la Figura 3 y la Tabla 1 El animal estaba distendido tres veces en cada una de las siguientes presiones:. (. Figura 3 A, Tabla 1) 15, 30, 45, 60 y 75 mmHg la tres distensiones se promedian y se representan como un único punto de datos del gráfico. Tenga en cuenta que los normalizados señal aumenta gradualmente con el aumento de las presiones de distensión de la vejiga. A raíz de este conjunto distensión inicial, este animal recibió dos conjuntos adicionales de distensión de la vejiga clasificado. Como se observa en la Figura 3B, la segunda y tercera series de distensiones producen VMRs similares (en cada presión.) Estos tres conjuntos de distensiones se produjeron más de 2,5 peri hrOD demostrando la estabilidad de la configuración de la grabación y la reproducibilidad de la UBD estímulo y la respuesta VMR en un solo animal. Es importante destacar que, la estabilidad a largo plazo de esta preparación sólo se produce cuando la anestesia con isoflurano está escalonada hacia abajo gradualmente a lo largo de 1 h. Un procedimiento de anestesia más corta puede conducir a una pérdida progresiva de la señal UBD VMR con cada juego de distensiones (observaciones no publicadas, Sadler y Kolber.) Otro factor crítico en la estabilidad del sistema UBD VMR es el mantenimiento de una temperatura corporal estable. Como se ve en la Figura 4, la UBD VMR (en respuesta a 60 mmHg distensión) es significativamente inferior a 33,5 ° C de temperatura corporal en comparación con 37,5 º C.
Figura 1. Respuestas visceromotor (VMR) de UBD. (A) esquemáticamentec de configuración UBD. El aire comprimido se entregó en la vejiga a través del catéter uretral. Durante distensiones, los electrodos de registro EMG de los músculos abdominales. A lo largo de todo el procedimiento, la temperatura se mantiene mediante una almohadilla eléctrica a pilas y lámpara de techo. (B) Ejemplo EMG traza durante UBD. A medida que aumenta la presión, la salida eléctrica de los músculos abdominales aumenta congruentemente.
Figura 2. Captura de pantalla que muestra los datos durante el juicio UBD. Tres canales se muestran. El canal de la parte superior se muestra la cruda EMG trace (en V.) El canal central muestra la presión (en mmHg) que se está entregando a la vejiga. La traza del fondo muestra el canal marcador estímulo que indica el comienzo del intervalo de presión previa y la prueba entera distensión de presión. La imagen es para una prueba completa de 40 segundos (2Intervalo de presión previa 0 segundos más 20 juicio distensión presión seg.)
Figura 3. Los datos representativos que muestran graduada VMR. (A) Los incrementos normalizados VMR gradualmente con el aumento de la presión (15-75 mmHg) entregados a la vejiga del ratón. (B) conjuntos subsiguientes de distensiones vejiga (15-75 mmHg = 1 juego) muestran VMRs similares en comparación con el primer conjunto de distensiones.
. Figura 4 La temperatura del cuerpo disminuye UBD VMR Una reducción de la temperatura corporal de 37,5 ° C a 33,5 ° C causa una disminución significativa en la UBD VMR. (N = 6;. Prueba t pareada * P <0,05)
Tabla 1. Los datos representativos de un conjunto completo de distensiones. Tabla muestra los datos incluidos AUC distensión de presión, presión previa intervalo de AUC, con corrección de fondo AUC distensión de presión, y la AUC normalizada distensión presión. Para cada presión, el animal recibió tres ensayos distensión. La media de la AUC normalizada distensión presión en cada presión se representa en la Figura 3A.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En los seres humanos, la cistitis / vejiga síndrome de dolor intersticial (IC / BPS) representa un problema clínico importante porque los pacientes han dolor que es a menudo no responde al tratamiento del dolor regular de 15 debilitante. Uno de los principales retos en la comprensión y tratamiento de última instancia, el dolor crónico de la vejiga es entender los procesos neuronales normales que están implicados en la respuesta a la distensión de la vejiga nocivo. Con el fin de superar este reto, un modelo animal de dolor en la vejiga es necesario. Este modelo debe ser reproducible, estable y fácil de medir. Afortunadamente, Ness y sus colegas desarrollaron un sistema 10 que se puede utilizar para investigar las respuestas fisiológicas a la distensión de la vejiga nociva.
Configuración del sistema es sencillo y se puede hacer utilizando principalmente off-the-shelf hardware y software. El mayor pedazo de encargo de los equipos involucrados en el sistema UBD VMR es el regulador de presión programado. Esta máquina proporciona un análogo-A digital de presión de aire y envía marcadores del inicio de estímulo al hardware digitalizador. El uso del regulador de presión temporizada simplifica en gran medida el análisis de datos mediante la sincronización automáticamente el estímulo de presión con la EMG registrada (es decir. VMR) Esto es importante porque la VMR no necesariamente se inicia precisamente cuando la vejiga está distendida primera y la VMR se mantiene a menudo para un período corto (<5 segundos) después del final de la distensión. Sin embargo, con la sincronización cuidadosa, uno puede fácilmente realizar el procedimiento UBD VMR con un regulador de encendido / apagado para controlar la distensión de encendido / apagado y un temporizador que está en sincronía con la señal EMG registrado.
Una de las principales ventajas del sistema UBD VMR para interrogar el papel del sistema nervioso en el dolor de la vejiga es que las respuestas a las presiones de distensión vesical graduadas caen a lo largo de una curva estándar con el aumento de las presiones que inducen mayores VMRs. Esto permite al investigador determinar fácilmente si un hombre experimentalipulation provoca un aumento o disminución en la VMR a presiones de distensión de la vejiga tanto inocuos y nocivos. Además, la señal de un solo animal es muy estable a través del tiempo de manera que múltiples rondas de distensión gradual se pueden hacer (Figura 3B). Esto permite a los investigadores para obtener una línea de base UBD VMR y luego manipular el animal (por ejemplo, administrar un fármaco) para intra-sujeto a juego 13. Los investigadores han utilizado el sistema UBD-VMR (en ratones y ratas) para registrar o manipular las neuronas del asta dorsal de la médula espinal 16 y otras neuronas en el sistema nervioso central (por ejemplo rostral ventral médula 17 o amígdala 13,16). Estos estudios y otros continúan para agregar a nuestra comprensión científica básica sobre el papel de los diversos componentes del sistema nervioso en el procesamiento de la información sensorial de la vejiga y en última instancia el dolor subjetivo sentía de esta entrada nociceptivo. Mientras que el sistema UBD VMR incluye muchas ventajas experimentales delre algunas limitaciones del modelo. En primer lugar, mientras que la distensión de la vejiga visceral evoca sentimientos subjetivos de "dolor" en los seres humanos, es imposible saber si abdominales registros de EMG en los ratones son verdaderamente representativas de dolor. No obstante, las respuestas UBD VMR son inhibidas por los analgésicos comunes que sugieren que el VMR es una respuesta de dolor similares. En segundo lugar, en el presente sistema de UBD-VMR, los animales se anestesiaron durante la grabación. Aunque una comparación de vivo frente anestesiado UBD VMR ha validado el uso de la anestesia 10, hay posibles efectos desconocidos de isoflurano sobre las respuestas al dolor similar. En tercer lugar, el protocolo descrito no es una cirugía de supervivencia por lo que múltiples grabaciones de ratones individuales a través del tiempo no son posibles. Sin embargo, el uso del modelo de UBD-VMR, así como otros sistemas de dolor visceral permitirá una comprensión más completa de dolor visceral y dará lugar a nuevas vías terapéuticas para los pacientes que sufren de IC / BPS y otras condiciones de dolor viscerales.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Nos gustaría agradecer a los Dres. Robert Gereau, Henry Lai, y Lara Crock por su valiosa asistencia en la creación de este sistema. También nos gustaría agradecer a las fuentes de financiamiento para este trabajo (BJK - Asociación Internacional para el Estudio del Dolor Early Career Beca de Investigación por el Scan | Fundación de Diseño de Inger & Jens BRUUN y la Hunkele Fondo terrible enfermedad Duquesne University).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Infrared heating blanket and monitoring system | Kent Scientific | Right-Temp System | This system is set up to monitor two separate temperatures. This should include the animal and the heating blanket. In addition, the system can automatically adjust the temperature to maintain a set temp. However, this automatic function produces electrical interference during EMG recording and must be turned off. Kent can provide a battery pack for the heating pad for use during the riEMG recording part of the experiment. |
| Isoflurane vaporizer | Draeger | Vapor 19.1 | Any isoflurane vaporizer will work, but it is helpful to have one that has multiple notches between 0-2% isoflurane. |
| Isoflurane | multiple sources | n/a | |
| 100% Oxygen air tank | multiple sources | n/a | For ventilation of animal |
| Air breathing grade | multiple sources | n/a | For bladder distention |
| 24 G 0.56 in IV catheter | BD Biosciences | 381411 | For bladder catheterization |
| Surgilube (sterile) | Savage Laboratories | 0281-0205-02 | Any surgical grade lubricate would work fine. |
| Mineral oil (sterile) | multiple sources | n/a | |
| Saline (sterile) | multiple sources | n/a | |
| AG8W Silver Wire, 2 m, 0.20 mm (.008 in) D, L, No Insulation | Warner Instruments | W4 64-1318 | Any silver wire with these specifications will work. Wire does not need to be "chlorinated." |
| Ophthalmic ointment | multiple sources | n/a | |
| Small surgical scissors | multiple sources | n/a | |
| Sharp forceps | multiple sources | n/a | |
| 21 G Needle | multiple sources | n/a | |
| Grass amplifier P511 with 3-lead input cable | Grass Instruments | P511 (F-P5IC3/REV1) | This is the "amplifier" used in the protocol. Amplifier with the following settings: Calibrator = 1 mV; Lo freq = 300 Hz; Amplification = 20; Hi freq = 10 kHz; Line filter = in. |
| Cambridge Electronic Design (CED) 1401 Plus (or equivalent) | Cambridge Electronic Design | 1401 Plus | This is the "digitizer" used in the protocol. Other digitizer systems from WINDAQ or other companies would work fine; Need inputs for pressure signal, EMG, and stimulus signal. |
| CED Spike2 software | Cambridge Electronic Design | Spike 2 | This is the the "digitizer software" used in the protocol. Should be from same manufacturer as digitizer. Program should be setup with 3 channels for pressure (0-100 mmHg scale), EMG signal (typically -5 to +5 V range), and stimulus marker (0-2 V) range. |
| Flow chart from air tank to bladder catheter | n/a | n/a | Sequence of connections from pressurized air tank to animal bladder: Air tank to 1/4 in tubing to Gilmont flowmeter to y connector. Branch 1 of y connector to to sphygmomanometer. Branch 2 to a single input on the 4-way gang valve to 4-way valve output to the timed pressure regulator to 3/32 tubing from timed pressure regulator to 2nd y connector (branch 1 to sphygmomanometer) with branch 2 to 3/32 tubing to a 3rd y connector. Branch 1 of y connector to a 3rd sphygmomanometer and branch 2 to animal bladder catheter. |
| Gilmont Flowmeter | Gilmont | GF8321-1401 | Multiple brands of flowmeters will work. For bladder distention air, flow meter should be able to handle high pressures (such as this Gilmont meter). For breathing air, flow rate should be adjustable down to 100 ml/min (typical mouse rate is 500-1,000 ml/min). |
| 4-way Gang valve | Elite | This is a specific piece of equipment. The Elite gang valve is designed for fish tanks at low air pressures. In the bladder distention setup, this valve acts as a safety valves in case the pressure spikes. Too high pressure during initial turning on of the tank will ruin the pressure transducer in the Timed pressure regulator and/or the sphygnometers. In addition, by providing a small amount of leak in the system, this valve makes it easier to adjust the pressure between 10-80 mmHg. | |
| 1/4 in Tubing | multiple sources | n/a | |
| 3/32 inch Tubing | multiple sources | n/a | |
| "Y" connectors (1/4 and 3/32 in) | multiple sources | n/a | |
| Sphygmomanometer | CVS | Any analog sphygmomanometer from a drug store will work for this application. | |
| Timed Pressure Regulator | custom | This is a custom built machine (Washington University in St. Louis Machine shop) that allows for automated pressure delivery including digitization of air pressure, control of trial length, inter-trial interval automation, control of trial number, and stimulus onset digital signal. However, the basic components of the system (pressure on and off for a given trial period) could be controlled with a simple on/off in-line switch. Such analog control of a trial would necessitate additional analysis parameters (see Protocol 4). In addition, one would have to manually assign the pressure based on the analog sphygmomanometer during data analysis. | |
| IGOR Pro | Wavemetrics | n/a | For analysis of EMG signal. Many different types of software can be used for data analysis in these experiments. |
References
- Merskey, H., Bogduk, N. Classification of Chronic Pain. , IASP Press. (1994).
- Gureje, O., Korff, M. V., Simon, G. E., Gater, R. Peristent pain and well-being. A World Health Organization study in primary care. J. Am. Med. Assoc. 280, 147-151 (1998).
- Gaskin, D. J., Richard, P. The economic costs of pain in the United States. J. Pain. 13, 715-754 (2012).
- Berry, S. H., et al. Prevalence of Symptoms of Bladder Pain Syndrome/Interstitial Cystitis Among Adult Females in the United States. J. Urol. 186, 540-544 (2011).
- Tunitsky, E., et al. Bladder Pain Syndrome/Interstitial Cystitis in twin sisters. J. Urol. 187, 148-152 (2012).
- Tettamanti, G., et al. Influence of smoking, coffee, and tea consumption on Bladder Pain Syndrome in female twins. Urology. 77, 1313-1317 (2011).
- Warren, J. W., et al. Harrison's Principles of Internal Medicine. Longo, D. L., et al. , McGraw-Hill. New York. (2012).
- Baldoni, F., Ercolani, M., Baldaro, B., Trombini, G. Stressful events and psychological symptoms in patients with functional urinary disorders. Perceptual Motor Skills. 80, 605-606 (1995).
- Tannenbaum, C., Gray, M., Hoffstetter, S., Cardozo, L. Comorbidities associated with bladder dysfunction. Int. J. Clin. Practice. 67, 105-113 (2013).
- Ness, T. J., Elhefni, H. Reliable visceromotor responses are evoked by noxious bladder distention in mice. J. Urol. 171, 1704-1708 (2004).
- Ness, T. J., Richter, H. E., Varner, R. E., Fillingim, R. B. A psychophysical study of discomfort produced by repeated filling of the urinary bladder. Pain. 76, 61-69 (1998).
- Ness, T. J., Gebhart, G. F. Visceral pain: a review of experimental studies. Pain. 41, 167-234 (1990).
- Crock, L. W., et al. Central amygdala metabotropic glutamate receptor 5 in the modulation of visceral pain. J. Neurosci. 32, 14217-14226 (2012).
- Anderson, R. H., Ness, T. J., Gebhart, G. F. A distension control device useful for quantitative studies of hollow organ sensation. Physiol. Behav. 41, 635-638 (1987).
- Dimitrakov, J., et al. Pharmacologic Management of Painful Bladder Syndrome/Interstitial Cystitis: A Systematic Review. Arch. Intern. Med. 167, 1922-1929 (2007).
- Qin, C., Van Meerveld, B. G. reenwood-, Foreman, R. D. Spinal neuronal responses to urinary bladder stimulation in rats with corticosterone or aldosterone onto the amygdala. J. Neurophysiol. 90, 2180-2189 (2003).
- Randich, A., Mebane, H., DeBerry, J. J., Ness, T. J. Rostral ventral medulla modulation of the visceromotor reflex evoked by urinary bladder distension in female rats. J. Pain. 9, 920-926 (2008).
