Abstract
Bu protokol, tarımsal sularının büyük hacimli Escherichia coli, Salmonella spp. Ve Listeria monocytogenes hızlı kolorimetrik tespitini (10 L) da açıklamaktadır. Burada su bakteri konsantre, plastik bir kartuş içine basit bir ağ filtre oluşur steril Modifiye Moore Swabs (MMS), süzülür. Süzüldükten sonra, hedef bakteriler için seçici olmayan ya da seçici bir zenginleşme MMS gerçekleştirilir. Hedef bakteri kolorimetrik tespiti için, zenginleşmesi sonra bakteri işaret eden alt-tabakalar ile gömülü kağıt bazlı analitik cihazlar (μPADs) kullanılarak deneye tabi tutulur. Her bir alt-tabaka üzerinde görsel μPAD (kalitatif tespiti) tespit edilebilir renkli ürünler üreten, hedef gösterge bakteryel enzimler ile reaksiyona girer. Alternatif olarak, reaksiyona μPADs dijital görüntüler ortak tarama ve çekim cihazları ile ve oluşturulan ImageJ yazılımı al kullanılarak analiz edilebilirsonuçlar daha objektif ve standart yorumlanması için lowing. Biyokimyasal tarama işlemleri yukarıda bahsedilen bakteriyel patojenler belirlemek için tasarlanmış olsa da, enzimler, arka mikrobiyota veya kolorimetrik alt-tabakaların bozulması tarafından üretilen bazı durumlarda yanlış pozitif üretebilir. Bu nedenle, daha ayrımcı teşhis kullanılarak teyit gereklidir. Bununla birlikte, bu bakteriyel konsantrasyon ve algılama platformu bir ilk tarama yöntemi olarak kullanılmasını haklı, (konsantrasyon, zenginleştirme ve algılama yaklaşık 24 saat içinde yapılır), ucuz (0,1 CFU / ml tespit sınırı) duyarlı, gerçekleştirmek kolay ve hızlıdır Tarımsal su mikrobiyolojik kalitesi için.
Introduction
Bu gıda kaynaklı hastalık etmenleri gıda kaynaklı hastalık yükünü azaltmak için alan bazlı ortamlarda hızla ve tercihen tespit edilmesi önemlidir. Gıda kaynaklı bakteriyel patojenler tespit etmek için ortak stratejiler biyokimyasal profil, seçici ve diferansiyel kültürlemenin, immünolojik izolasyon ve algılama ve moleküler algılama vardır. Ancak, bu yöntemler sporadik kirlenme tarafından engellendiğini, test küçük bir örnek boyutları, gıda kaynaklı patojen bakterilerin genellikle düşük konsantrasyonlarda, uzun işlem süreleri gerektiren ve / veya alan ayarları için geçerli değildir. Bundan başka, birçok gıda matrislerdeki bileşiklerin tespit ve teşhis uygulamalarına önleyici bulunmaktadır. Mikrobiyal algılama olasılığını artırmak amacıyla, Amerika Birleşik Devletleri Gıda ve İlaç Dairesi (örneğin, yıkama, su ve sulama suyu olarak) Tarımsal su testi taze ürün büyük bir yüzey alanı ile temas ya da bir araç olarak hizmet eder ya da bu da önerdi produce kontaminasyon gıda 1. doğrudan test için bir alternatiftir. Buna rağmen, temsili tarımsal su numunesi seyreltme etkisi ile birleştiğinde genellikle düşük, doğal patojen-patojen yükü konsantrasyon için numune hazırlama yöntemleri gerekli kılar. Bu tür bir yöntem, su (≥ 10 L), uygun patojen-konsantrasyonu ve alt algılama stratejileri ile uyumluluk geniş hacimli örnekleme gerektirir.
Modifiye Moore bezlerden (MMS) su 2-4 büyük hacimlerde (≥ 10 L) bakterileri konsantre için kullanılan, ucuz, basit ve sağlam cihazlardır. MMS bir peristaltik pompa kullanılarak pompalanmıştır kaset su büyük miktarlar için, bir kaba filtre olarak hizmet gazlı bez, dolu bir plastik kaset oluşur. MMS işlenmiş li mikroorganizmalar da dahil olmak üzere organik ve inorganik tanecikli madde yakalar bakteri konsantrasyonu (≥ 10 kat konsantrasyon) bir ayrım yöntemisterlin örnekleri. Bu, MMS ile hedef mikroorganizma konsantrasyonunun mükemmel etkinliği mikroorganizmalar silt-kil fraksiyonu ya da süspanse edilmiş katı maddelerin 3 organik mikro agrega bağlı olması beklenmektedir gerçeği ile açıklanabilir olasıdır. MMS sağlam tasarımı, bu tür filtrelerin tıkanması, büyük hacimli işleme yetersizlik, yüksek bulanıklık ile filtre örnekleri ve yüksek maliyetler gibi sudan bakteri, yakalanması ve konsantrasyon için diğer filtrasyon yöntemleri ile ilgili en eksikliklerin sağlar. Bu nedenlerle, FDA MMS çevre ve üretmek, ilgili numune toplama prosedürleri 5 resmi işlemleri dahil edilmesi tavsiye edilmektedir.
Burada, bir yöntem olup, konsantrasyon, zenginleştirme ve Escherichia coli algılama, Salmonella spp. Ve tarımsal sularından Listeria monocytogenes için açıklanmıştır. A MMS Bact konsantrasyonu için kullanılıreria ve ayrıca seçici ya da seçici olmayan bakteriyel zenginleştirilmesi için bir kap olarak işlev görür. Bakteriyel algılama kağıt tabanlı analitik cihazları (μPADs) 6 kullanılarak biyokimyasal elde edilir. μPADs akışkan ağları veya Fotolitografi, inkjet baskı, damgalama, ve balmumu 7-11 baskı da dahil olmak üzere çeşitli yöntemler kullanılarak nokta testleri olarak imal edilebilir. Akışkan tasarımları örnekleri, numunenin merkez yatırılır ve daha sonra, numune ya da alt-tabaka merkezine 12 içine kılcal hareket ile kanalın dış rezervuar çekilir edildiği distal rezervuar ya da tek kanal alışkanlıklarına akar dendritik kanal desen olabilir. Bu protokol için, biz burada test mikroorganizmaların göstergesidir enzimler tarafından işlenebilir kromojenik substratları ile ankastre 7 mm çaplı balmumu kağıt nokta diziler için istihdam seçtiniz: Klorofenol kırmızı β-D-galaktopiranosid (CPRG) ve 5 - bromo-4-kloro-3-indolil β-D-glukuronid (X-Gluc)E. tarafından üretilen β-galaktosidaz ve β-glukuronidaz saptanmasında coli; Salmonella spp tarafından üretilen, C8-esteraz tespiti için 5-bromo-6-kloro-3-indolil kaprilat (kırmızı kaprilat).; fosfatidilinositol özgü fosfolipaz C tespiti için ve 5-bromo-4-kloro-3-indolil-miyo-inositol fosfat (X-InP) (PI-PLC) tarafından üretilen L. 6 monocytogenes. Bu nedenle, belirli bir bakteri varlığı, karmaşık ekipman ve veri yorumlama için gerek kalmadan görsel olarak gözlenebilir. Bu özel hedef bakterilerin enzim bazlı kolorimetrik μPAD algılama spesifikliği ve duyarlılığı, daha önce 6 incelenmiştir. Buna ek olarak, bu hedef bakteriler için entegre konsantrasyon algılama yönteminin hassasiyeti mikroorganizmalar (yayınlanmamış veriler ve Bisha et al. 13) önceden belirlenmiş bir seviyede suyun büyük hacimlerde spike ile değerlendirildi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MMS kullanma Tarımsal Su geniş hacimli Bakterilerin 1. Konsantrasyon
- MMS Hazırlık
- 40 x 12 cm boyutlarında 4-katlı tülbent dikdörtgen bir bölümü kesin.
- 20 x 6 cm boyutlarında bir dikdörtgen elde etmek için her iki eksen boyunca tülbent katlayın.
- Boyunda yaklaşık 6 cm ve çapı 3 cm olan silindirik bir çubukla oluşturulması için sıkı uzun ekseni boyunca tülbent döndürün.
- Alüminyum folyo tülbent bez otoklavlayınız kaseti otoklavlamayın yok. % 10 ev tipi ağartıcı içinde 30 dakika için ıslatılarak kaseti dekontamine ve bir sodyum tiosülfat pentahidrat (Na 2S 2 O 3 · 5H 2 O) çözeltisi (50 mg / L, 15 dakika boyunca kaseti ıslatarak kalıntı kloru devre dışı ) steril su içinde hazırlandı.
- MMS kaset içine bezi yerleştirin.
Not: MMS kasetinin olmayan tek versiyonu kullanılırsa, tülbent bir 4-katlı tabaka ile başlamak me80 x 22 cm asuring, 40 x 11 cm katlayın ve çapı yaklaşık 11 cm boyunda ve 6 cm bir silindir oluşturacak şekilde yuvarlayın. - MMS birleştirin.
- Borunun tam spigots yapışır sağlanması, MMS her iki tarafında musluk için vinil tüp takın ve peristaltik pompanın içine boru düzeltmek. Peristaltik pompa boru donanımı üst numune için yeterli uzunlukta olduğundan emin olun.
- Bakterilerin Konsantrasyon
- Yüksek hızda peristaltik pompa çalıştırılarak Tarımsal su numune en az 10 L.
- Örnekleme tamamlandıktan sonra, su numunesi gelen peristaltik pompa girişini çekilme ve hiçbir atık su MMS çıkarken görülmektedir kadar pompayı çalıştırmaya devam.
- Bir manifold, aynı anda birkaç numune çalıştırmak için kullanılan, her MMS çıkış maddesinin toplamak ve 10 L, tek bir MMS içinden süzülür zaman, söz konusu MMS için valfi kapatmak ve pompa çalışmaya devam eder.
- I örnekleme zamantamamlanmış s, tarımsal su peristaltik pompa girişini çekilme manifoldu tüm vanaları açık ve hiçbir atık su mmss çıkarken görülmektedir kadar pompayı çalıştırmaya devam.
- Konsantrasyonu bütün mmss için tamamlandıktan sonra, dikkatli bir şekilde MMS musluk gelen vinil boru kaldırmak ve MMS her iki tarafındaki uçlar kap. Sıkıca kapatılmış MMS zenginleştirme ortamı eklemeden önce en fazla 12 saat saklanabilir.
2.. MMS Zenginleştirme ve Numune Hazırlama
- Zenginleştirme
- MMS kapağını sökün ve aseptik uygun steril zenginleştirme et suyu 20 ml ekleyin. Her seçici zenginleştirme için bir MMS kullanın. Alternatif olarak, aynı örnekteki tüm üç hedef bakteri yaymak için, seçici olmayan bir zenginleştirme gerçekleştirin.
NOT: MMS kasetin olmayan tek sürümü kullanılırsa, aseptik kaset tülbent filtreyi kaldırmak ve reklamdan önce steril bir torbaya koyunUygun zenginleştirme ortamı Ding 225 mi.- E. zenginleştirilmesi için E. coli, vankomisin hidroklorür 8 mg / L içeren tamponlu pepton suyu (BPW) 20 ml.
- Salmonella spp zenginleştirilmesi için., BPW 20 ml Salmonella takviyesi (4 ml / L) ile desteklenmiş ekleyin.
- L. zenginleştirilmesi için monocytogenes, VIDAS UP Listeria (LPT) et suyu 20 ml ekleyin.
- Tek bir MMS kullanarak üç mikroorganizmalar için eş zamanlı olmayan seçici zenginleştirme için, genel ön zenginleştirmeye suyu (UPB) kullanır.
- Geri sıkıca MMS kapağını vidalayın. Spigots sıkıca zenginleştirme sırasında dökülmeleri ve olası kontaminasyonu önlemek için kapatılmış olduğundan emin olun.
- 200 rpm'de bir çalkalama inkübatöründe kadar 18-24 saat için MMS inkübe edin. E. 42 ° C kullanın coli ve Salmonella spp. selektif zenginleşmesi. L. 30 ° C kullanın monocytogenes selektif zenginleştirme ve kullanımı 37 & #176, seçici olmayan bir zenginleştirme C.
- MMS kapağını sökün ve aseptik uygun steril zenginleştirme et suyu 20 ml ekleyin. Her seçici zenginleştirme için bir MMS kullanın. Alternatif olarak, aynı örnekteki tüm üç hedef bakteri yaymak için, seçici olmayan bir zenginleştirme gerçekleştirin.
- Numune Hazırlama
- Kuluçka tamamlandığında, inkübatör MMS kaldırmak spigots birini kapağını açmak, ve yavaşça bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpe yaklaşık 0.5 ml dağıtmak. Alternatif olarak, dışarı MMS ve pipet 0.5 gecede zenginleştirme ml sökün.
Not: MMS kasetinin-olmayan tek versiyonu kullanılırsa, torbadan zenginleştirme 0.5 ml pipetle. - E. kolorimetrik analizi için coli seçici zenginleştirme ya da seçici olmayan zenginleştirme analizi için, 5 W, bir sonda sonikatör kullanarak 20 saniye boyunca 22 kHz'de zenginleştirme 0.5 ml sonikasyon.
- Kuluçka tamamlandığında, inkübatör MMS kaldırmak spigots birini kapağını açmak, ve yavaşça bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpe yaklaşık 0.5 ml dağıtmak. Alternatif olarak, dışarı MMS ve pipet 0.5 gecede zenginleştirme ml sökün.
ΜPADs 3. Hazırlanması ve kolorimetrik alt-tabakalar arasında gömülmesi
- Test edilen her bir numune ve hedef için yeterince μPADs hazırlayın. E. algılamak için coli Salmonella spp, CPRG ve X-Gluc μPADs hazırlamak. algılama MC μPADs hazırlamak, ve L. monocytogenes algılama X-InP μPADs hazırlamak.
- HEPES tamponu hazırlayın kolorimetrik alt-tabakalar için, [0.1 M,% 0.1 Bovine Serum Albumin (BSA) ile HEPES] ve ikinci olacak substrata göre tamponun pH'ının ayarlanması: CPRG ya da X-gluc hazırlanması için pH 7.5, MC pH 9 ve X-InP için pH 7.
- PH substratların stok çözelti hazırlayın 3 mM (CPRG), 62.5 mM (X-Gluc), 15 mM (MC), 100 mM (X-InP) konsantrasyonlarda HEPES tamponu ayarlandı. Işıktan stok çözümleri koruyun.
- Daha sonra her bir taban stok çözeltisinden 24 ul ile μPAD Microspot imbed, steril bir Petri kabı içinde μPADs yerleştirin.
4.. Algılama ve Veri Analizi
- Bulma
- Petri kabı içinde bulunan her bir uygun μPAD Microspot için zenginleştirilmiş örnek 6 ul ekleyin.
- Petri kabı kapağını geri yerleştirin ve Parafilm ile mühür.
- Örnek inkübemicrospots renk gelişimi ve kurutma için izin verecek şekilde 3 saat boyunca 37 ° C'de μPAD ile.
- Sonuçların görsel incelenmesi
- ΜPADs renk değişiklikleri basit görsel muayene ile tespit gerçekleştirin.
NOT: Genellikle, kesin renk değişiklikleri üretmek güçlü tepkiler daha fazla açıklama için ihtiyacı ortadan kaldıracak olmalı ve pozitif olarak düşünülmelidir zenginleşme 18-24 saat, aşağıdaki bekleniyor. - Bir E. varlığını belirlemek kırmızı-mor ve mavi-yeşil renksiz X-Gluc değişikliği ile ankastre microspots sarıdan CPRG değişikliği ile ankastre microspots gözlemleyerek coli pozitif örnek.
- Bir L. varlığını belirlemek renksiz gelen indigo X-InP değişikliği ile ankastre microspots gözlemleyerek olumlu örnek monocytogenes.
- Salmonella spp varlığını belirler. col gelen MC değişikliği ile ankastre gözlemleyerek microspots pozitif numunemor-leylak rengi için orless.
- ΜPADs renk değişiklikleri basit görsel muayene ile tespit gerçekleştirin.
- Yazılım Destekli Veri Analizi
NOT: Açıkça zayıf reaksiyonlar olumlu ya da olumsuz olup olmadığını belirlemek için ve sonuçların bir yarı-kantitatif analiz sağlamak için yürütülen.- ΜPADs tamamen kurumasını bekleyin.
- Düz yataklı tarayıcı kullanarak μPAD tarayın.
- Görüntü işleme ImageJ yazılımı kullanın.
- Ana menüden (veya basın "Clt + O") üzerindeki "Dosya" sekmesi altında bulunan ImageJ analiz edilecek, taranan görüntüyü "aç".
- ("Clt + Shift +" ya basın) ana menüde "Edit" sekmesinin altında bulunan "Dönüştür" seçerek görüntüyü ters çevirin.
- Ana menüde "Analiz" sekmesini kullanın ve analiz rapor ölçüleri seçmek için "Set Ölçümleri ..." seçeneğini seçin.
- Emin "Mean gri yoğunluk", "eşik Limit emin olun" ve "Display etiket" kutularıkontrol ve basın "Tamam." Bu yazılım, seçilen her alanda analiz nasıl ayarlar ve nasıl bunu bildiriyor.
- Eğer içinde ölçmek istediğiniz alanı ana hatlarıyla bir daire çizmek için "Oval" aracını kullanın.
- "Analiz" sekmesinde "Tedbir," (ya da basın "Clt + M") seçin. Yazılım tanımlı alanı içinde ortalama gri yoğunluğunu ölçmek ve kopyalanabilir ve daha fazla analiz için excel yapıştırılabilir bir pop-up ekranında rapor edecektir.
NOT: Tam bir analiz için, her numunenin en az iki teknik çoğaltır yapılmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokolde tarif edildiği gibi, MMS kullanarak bakteri konsantrasyonu (Şekil 1), yaklaşık 15-20 dakika içinde yapılabilir. Iki ayrı bileşenleri, akrilonitril butadien stiren (ABS) 'den meydana in MMS; silindirik bir tülbent çubuk içine sokulduğu entegre bir mil kasnağı montajı (Şekil 1A) ile her ikisi de, bir kapak ve bir kartuş. Her iki bileşen de daha sonra birlikte MMS (Şekil 1 B) oluşturan vidalanır. MMS-tabanlı işleme alan ortamlarda yoğun olarak numuneler için izin, bir pilli peristaltik pompa ile tahrik edilir. MMS konsantrasyon, seçici zenginleşmeler (18-24 saat), ve μPADs bağlanması ile; tarımsal su kolayca, (yaklaşık 24 saat) hızla olabilir ve ucuza E. gibi önemli gıda kaynaklı patojenlerin ve indikatör mikroorganizmalar için elenmiş olabilir E. coli, Salmonella spp. ve L. monocytogenes. Bu protokol ile, bu hedef bakteriler tespit edilebilir0,1 CFU / ml kadar düşük seviyelerde ed. ΜPAD kolorimetrik tahlilleri, alt-tabakalar ile (Şekil 2) reaksiyona bakteri gösterge enzimlerin saptanması dayanmaktadır. E. tespit Tahliller coli değil, E. E. coli O157: H7, mavi-yeşil ürün (Şekil 2A) üretirler. Benzer şekilde, E bir çoğunluğu tespit deneyi coli suşları kırmızı-mor reaksiyon ürünü (Şekil 2B) üretir. Salmonella spp tespit deneyleri. (Şekil 2C) ve L. monocytogenes (Şekil 2B) sırasıyla, mor-leylak ve indigo renkleri üretirler. Test göz (kalitatif) tarafından yorumlanabilir ve görsel yargılar genellikle pozitif ve negatif örnekler arasında ayrım için tatmin edicidir. Alternatif olarak, dijital görüntüleri daha objektif ve standart veri yorumlama (Şekil 3B) için izin ImageJ yazılımı (Şekil 3A) kullanılarak manipüle edilebilir.
Şekil 1.. Modifiye Moore sürüntü (MMS) kaset. (A) demonte MMS. MMS akrilonitril bütadien stiren (ABS) bir 3-D yazıcıda üretilen ve üç ana bileşenden oluşmaktadır: (4-kat katlanmış) silindirik bir tülbent sürüntü sokulur ve bir ile kaplı olduğu içine dahil tıkaç montaj ile bir kartuş entegre bir spigot tertibatına sahip kapak. (B) monte MMS.
Şekil 2,. Bakteri-gösterge kolorimetrik reaksiyonları. Substratlar (X-Gluc, CPRG, MC, ve X-InP) μPADs en microspots ankastre bakteri gösterge enzimleri ile reaksiyona girdiği (&# 946, bir kolorimetrik değişim üretmek için-glukuronidaz, β-galaktosidaz, C8 esteraz ve PI-PLC). (A), pozitif bir X-Gluc, reaksiyon genel E: bir göstergesidir coli değil, E. E. coli O157: H7; (B) bir pozitif tepki CPRG bir göstergesi olduğunu E. coli mevcut; (C) bir pozitif reaksiyon MC Salmonella spp varlığını gösterir.; (D) ve bir pozitif X-InP reaksiyon L. varlığını gösterir monocytogenes.
.. (-) Ve pozitif (+) testi Şekil 3, görsel ve ImageJ bakteri gösterge μPAD kolorimetrik testlerin çözümleyen bir, negatif hem de her bir tayin için kolorimetrik dijital görüntüleri gösterir. Negatif testler bakteriyel speci lizatları kullanılarak gerçekleştirilmiştires ki hedef bakterilerin lizatlarına veya zenginleşme ile hedef enzimleri ve pozitif testler kodlamak yok. (1) Modifikasyonlaştırılmamış taranmış görüntüleri. (2) Taranan görüntüleri ImageJ yazılımı kullanarak gri tonlama dönüştürülür, ve (3) gri renk yoğunluğu sonraki yorumlanması için görüntüleri ters. (4) (bir örnek microspot sarı bir ok ve bir daire ile gösterilir) μPAD her Microspot içinde ImageJ kullanılarak ölçülen ortalama gri yoğunluk. B Her kolorimetrik μPAD pozitif ve negatif test için (ImageJ tarafından belirlenen) ortalama gri yoğunlukları göstermektedir. Lütfen Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, E. saptanması için entegre bir yöntem tarif E. coli, Salmonella spp. ve L. Tarımsal suda monocytogenes. Burada, tarım büyük hacimlerde suyun bakterilerin MMS konsantrasyonu (10 L), bakteriyel zenginleştirme ile birleştiğinde ve bakteri gösterge kolorimetrik tespiti μPADs kullanıyor. Bakteriler 10 kat konsantre olurken MMS prosedürü su örneklerinde yüksek partikül içeriği ile başa çıkabilir, sağlam ve az eğitimli personel tarafından saha uygulamaları için yeterince basit ve az maliyet ile yapılabilir. Bakteriyel bir zenginleştirme adımı ilave etmek suretiyle, canlı bakteri tespit edilir ve yöntemin hassasiyeti büyük ölçüde artırılmıştır. Zenginleştirme tahlil edilecek olan hedef güçlendirir ve seçici büyüme ortamı ile bir araya getirildiğinde, yanlış pozitif sonuçlara katkıda bulunabilir örneklerde istenmeyen Mikrobiyota büyümesini azaltır. Final tespiti basit sağlamak μPADs ile yapılır,önemli gıda kaynaklı patojenler için ekrana çözüm yorumlamak, etkili ve kolay maliyet. MMS konsantrasyonu, gece boyunca zenginleştirme ve kolorimetrik tespiti de dahil olmak üzere tüm işlem, bir gün içinde gerçekleştirildi ve 0.1 CFU / ml kadar az düzeyde bakteri kirlenmesini tespit edilebilir.
Yöntem basitleştirmek ve bulaşma olasılığını azaltmak için, MMS bakteri zenginleştirilmesi için bir kap olarak kullanılmaktadır. Prosedüre bu zenginleştirme ekleme, duyarlılık, özgüllük artar yönteme esneklik katar. Sadece üç seçici zenginleşme burada kullanıldı, ancak bakteriler için geliştirilmiş zenginleşme geliştirilebilir. Örneğin, kolorimetrik tespiti için kullanılan raportör enzim üretimini artırmak için zenginleştirme ortamı içine belli uyarıcılar birleştiren hedeflenmiştir.
Patojen tespiti için kullanılan μPADs basit-kullanmak gibi az $ 0 maliyet tek nokta diziler vardırÖnceden kolorimetrik haberci substratın ilavesinden .002/device. Hatta zenginleştirme reaktifler ve kolorimetrik alt-tabakalar için muhasebe, her bir testin maliyeti L. haricinde birkaç cent nedeniyle X-InP şu anda yüksek maliyet $ 1.28/test tahmin ediliyor testi monocytogenes. Bununla birlikte, bu maliyet kaynaklı patojenlerin 6 akımı algılama yöntemleri olumlu karşılaştırır. Mevcut formda, μPADs alt-tabaka, zayıf kararlılık testten önce derhal hazır olmalıdır. Bu sınırlamayı aşmak için, katkı maddeleri stabilize ve alt tabaka / μPAD raf ömrünü artırmak için kuru depolama değerlendirme eklenmesini test edilir. Ayrıca, mikroakışkan kanal ile birbirine bağlı birkaç numune / reaktif bölgeleri kullanılarak birden fazla mesaj göndermiş μPADs geliştirmektedir.
Daha önce μPAD test için ayrıntılı olarak açıklanan avantajlara rağmen, deney özgüllük ile ilgili sorunlar mümkündür: 1) raportör enzimler pozitif sıcaklık katsayılı değildirsively hedef bakteriler tarafından üretilen, böylece kirletici arka Mikrobiyota bir yanlış pozitif sonuç katkıda bulunabilir. Koyu renkli parçacık zenginleştirme medyada devam ederse μPAD transfer olduğunda 2), görsel ve İmageJ analiz belirsiz olabilir. 3) Geçerli tahlil özellikle E. tespit edemez E. coli O157: H7. Dolayısıyla, yöntem ayrıca, test ve yürütülecek için onay bir başlangıç tarama testi sunan ivme olarak daha uygundur. Bununla birlikte, bu eksikliklerin çok kolayca ele alınmaktadır. Gösterge kolorimetrik alt tabakalar daha geniş bir panel, E de dahil olmak üzere, hedef bakterinin daha hassas belirlenmesi için izin verecek E. coli O157: H7. Benzer şekilde, ilave seçici zenginleştirme prosedürleri örnek içindeki kirletici Mikrobiyota en aza indirmek olabilir. Zenginleşme partiküllü etkisini azaltmak için, kaba filtre önce μPAD numune uygulanması için kullanılabilir.
Sonuç, this çalışma zenginleştirme ve μPADs ile birlikte MMS E düşük seviyelerde tespit etmek için kullanılabileceğini gösterir E. coli, Salmonella spp. ve L. Tarımsal suda monocytogenes. Birkaç modifikasyonlar ile, bu prosedür, taşınabilir ve alan ortamlarda uygulanmalıdır edebilmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agricultural water | Irrigation water, produce wash water, well water, etc. | ||
| Vinyl tubing | Wilmar | BN-CVT1005 | 1/4" inner diameter, 3/8" outer diameter, available at: http://www.wilmar.com |
| Modified Moore Swab cartridge | Lumiere Diagnostics | 11 ½ cm in length and 4 ½ cm in width, available at: http://www.lumierediagnostics.com. Alternativelly, a non-disposable version of the cartridge can be used (refer to the text) | |
| Cheesecloth | Chesapeake Wiper & Supply, Inc. | CC90 | Grade #90, 44 x 36 weave, available at: www.raglady.com |
| Household Bleach | Various | Sodium hypochlorite concentration approx. 6% | |
| Sodium thiosulphate 5-hydrate | Mallinckrodt Baker Inc | 8100-04 | |
| Manifold | Built in-house | Optional, device can be constructed from PVC pipes and appropriate fittings | |
| Peristaltic pump | Micron Meters | RPP1300 | Available at: http://www.micronmeters.com |
| Serological pipette | Various | Disposable, 10 ml | |
| Universal preenrichment broth | Difco | 223510 | |
| Buffered peptone water | Difco | 218105 | |
| Salmonella supplement | Biomérieux Industry | 42650 | http://www.biomerieux-usa.com |
| VIDAS UP Listeria (LPT) Broth | Biomérieux Industry | 410848 | http://www.biomerieux-usa.com |
| Vancomycin | Sigma-Aldrich | 861987 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Pipet-Aid | Various | Drummond DP-110 used here | |
| Shaking incubator | Various | Excella E25, New Brunswick Scientific used here | |
| Micropipette | Various | 10 μl, 1 ml | |
| Micropipette tips | Various | Barrier, 10 μl, 1 ml | |
| 1.5 microcentrifuge tubes | Various | RNase- and DNase-free | |
| Probe sonicator | Q Sonica LLC | XL-2000 series | |
| µPADs | Avant | Wax printed 7 mm diameter circles, with 4 pt line thickness. Contact Dr. Charles Henry for additional information | |
| HEPES [N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-2-ethanesulfonic acid] | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A8022 | |
| Chlorophenol red-galactopyranoside (CPRG) | Sigma-Aldrich | 59767 | |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide (X-Gluc) | Sigma-Aldrich | B8174 | |
| 5-bromo-6-chloro-3 indolylcaprylate (magenta caprylate) | Sigma-Aldrich | 53451 | |
| 5-Bromo-4-chloro-myo-inositol phosphate (X-InP) | Sigma-Aldrich | 38896 | |
| Petri dishes, polystyrene 100 mm by 15 mm | Various | Sterile | |
| Flat bed scanner | Various | Xerox USB scanner | |
| ImageJ software | National Institutes of Health | http://rsb.info.nih.gov/ij/ |
References
- Guidance for industry: Guide to minimize microbial food safety hazards for fresh fruits and vegetables. , U.S. Dept. of Health and Human Service, Food and Drug Administration, Center for Food Safety and Applied Nutrition (CFSAN). (1998).
- Bisha, B., Pérez-Méndez, A., Danyluk, M. D., Goodridge, L. D. Evaluation of Modified Moore swabs and continuous flow centrifugation for concentration of Salmonella and Escherichia coli O157:H7 from large volumes of water). J Food Prot. 74, 1934-1937 (2011).
- Sbodio, A., Maeda, S., Lopez-Velasco, G., Suslow, T. V. Modified Moore swab optimization and validation in capturing E. coli O157:H7 and Salmonella enterica in large volume field samples of irrigation water. Food Res Int. 51, 654-662 (2013).
- McEgan, R., et al. Detection of Salmonella spp. from large volumes of water by modified Moore swabs and tangential flow filtration. Lett Appl Microbiol. 56, 88-94 (2013).
- Solicitation Number: FDA-SS-1116253. , Administration USFaD. (2013).
- Jokerst, J. C., et al. Development of a paper-based analytical device for colorimetric detection of select foodborne pathogens. Analytical Chemistry. 84, 2900-2907 (1021).
- Martinez, A. W., Phillips, S. T., Butte, M. J., Whitesides, G. M. Patterned paper as a platform for inexpensive, low-volume, portable bioassays. Angew Chem Int Edit. 46, 1318-1320 (2007).
- Martinez, A. W., Phillips, S. T., Wiley, B. J., Gupta, M., Whitesides, G. M. FLASH: A rapid method for prototyping paper-based microfluidic devices. Lab on a Chip. 8, 2146-2150 (1039).
- Abe, K., Suzuki, K., Citterio, D. Inkjet-printed microfluidic multianalyte chemical sensing paper. Analytical Chemistry. 80, 6928-6934 (1021).
- Cheng, C. M., et al. Millimeter-scale contact printing of aqueous solutions using a stamp made out of paper and tape. Lab on a Chip. 10, 3201-3205 (1039).
- Lu, Y., Shi, W. W., Jiang, L., Qin, J. H., Lin, B. C. Rapid prototyping of paper-based microfluidics with wax for low-cost, portable bioassay. Electrophoresis. 30, 1497-1500 (2009).
- Jokerst Rapid detection of pathogens using paper devices. US patent. Charles, S., Henry, L. D. G., Jana, C. , WO2012125781 A3 (2012).
- T10-06 Colorimetric paper-based detection of Salmonella spp. and Escherichia coli from artificially contaminated irrigation river water. Bisha, B., et al. Internation Association for Food Protection Annual Meeting, Providence, RI, , (2012).
