Abstract
本协议描述快速比色检测农产品水域的大肠杆菌 ， 沙门氏菌和李斯特菌的大量（10升）。这里，水通过无菌改性摩尔棉签（MMS），它由装在一个塑料盒的简单纱布过滤器的过滤，浓缩的细菌。过滤后，非选择性或选择性富集的靶细菌在MMS中进行。对于比色法检测目标细菌的富集，然后用纸张为基础的嵌入式细菌指示基板分析设备（μPADs）测定。每个基片会与目标指示细菌的酶，产生可以目视（定性检测）上μPAD来检测有色产物。可替换地，可以使用公共扫描或摄影装置生成并使用ImageJ软件，人分析了反应μPADs的数字图像仰角调整器的结果更加客观和标准化的解释。尽管生化筛查程序的设计，以确定上述的细菌病原体，在某些情况下背景微生物或比色底物的降解酶的产生可能会产生假阳性。因此，需要确认使用的是更多的歧视诊断。然而，这种细菌浓度和检测平台价格低廉，敏感（0.1 CFU / ml的检测限），易于操作，快速的（是在大约24小时进行浓缩，富集和检测），其理由作为初步筛选的使用方法对农业用水的微生物质量。
Introduction
重要的是，食源性疾病代理人，以减少食源性疾病的负担迅速，最好在检测场为基础的环境。共同战略，以检测食源性致病菌包括生化分析，选择性和鉴别培养，免疫隔离和检测和分子检测。然而，这些方法是由零星污染的阻碍，测试样本量小，则往往低浓度的食源性致病菌，需要很长的处理时间，和/或不适用于字段设置。此外，在许多食物基质的化合物是抑制到检测和诊断应用。为了提高微生物检测的可能性，美国食品和药物管理局已提出，测试农业用水（如洗涤用水和灌溉用水），其中任一接触到新鲜产品有很大的表面积接触或用作车辆对produce污染是一个可行的替代食品1的直接测试。即便如此，往往低自然病原体负担再加上代表性的农业水样的稀释作用使样品制备方法的病原体浓度至关重要。这种方法将需要采样大量的水（≥10 L），适当的病原体浓度，并与下游检测策略的兼容性。
修改摩尔拭子（MMS）是用于从浓缩水2-4大容量（≥10L）细菌便宜，简单，坚固耐用的设备。彩信由一个塑料盒填充用纱布，它作为一个粗过滤器，大体积的水，用蠕动泵通过盒泵入的。彩信是细菌浓度（≥10倍浓缩）的非歧视性的方法，捕捉有机和无机颗粒材料，包括在处理里的微生物镑样品。它很可能是由MMS靶微生物的浓度的优良功效可通过一个事实，即微生物预期将附着在粉砂质粘土组分或有机微聚集的悬浮物3进行说明。坚固耐用的设计，彩信允许克服与其它过滤方法捕获从水中细菌，如堵塞的过滤器，无法处理大量，过滤器样品浊度高，而且成本高和浓度有关的大多数缺点。由于这些原因，美国食品药品管理局的建议将彩信的纳入环境和生产相关的样品收集程序5官方程序。
这里，描述了一种方法用于浓缩，富集和检测大肠杆菌 ， 沙门氏菌 ， 单增李斯特菌来自农业的水域。彩信用于BACT的浓度ERIA，并且还用作用于选择性或非选择性富集细菌的容器。使用的纸张为基础的分析设备（μPADs）6达到细菌检测生化。 μPADs可以被制造为流体网络，或使用了多种方法，包括光刻法，喷墨印刷，压印，和蜡印7-11斑点试验。的流体设计的例子可以是其中样品被沉积在中间，并随后流入其中样品或基底被从通道的外储层被拉通过毛细作用进入中心12前端水库或单声道模式的树突状通道模式。对于这个协议，我们选择采用的嵌有显色底物7毫米直径的腊纸点阵列，可以通过指示在这里测试的微生物的酶进行处理：氯酚红-β-D-吡喃半乳糖苷（CPRG）和5 - 溴-4 - 氯-3 - 吲哚基β-D-葡糖苷酸（X-GLUC）用于检测β-半乳糖苷酶和β-葡糖苷酸酶由大肠杆菌产生大肠杆菌 ; 5 -溴-6 -氯-3 -吲哚辛酸盐（品红辛酸盐），用于由沙门菌属生产的C8-酯酶的检测;和5 -溴-4 -氯-3 -吲哚基- 肌醇 -磷酸（X-磷化铟），用于检测磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C（PI-PLC）制作的L。菌等 6。因此，一个特定的细菌的存在下，可以目视观察，而不需要复杂的设备或数据的解释。的基于酶的比色μPAD检测这些特定的目标细菌的特异性和灵敏度先前已探索6。此外，对于这些靶细菌的集成浓度检测方法的灵敏度由尖峰的大体积的水的微生物（未发表数据和比沙等人 13）的预先确定的水平进行评价。
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Protocol
细菌1。从农业用水的使用MMS大体积浓度
- 彩信准备
- 剪下的4层纱布测量40×12厘米的矩形截面。
- 折沿两个轴的干酪，得到20×6厘米的矩形。
- 滚动纱布沿其长轴紧密，形成大约6公分，直径3厘米的圆柱形棒。
- 在高压灭菌铝箔粗棉布擦拭，不要高压磁带。净化盒通过浸泡在10％家用漂白剂30分钟，浸泡在盒15分钟，在一个五水合硫代硫酸钠（的Na 2 S 2 O 3·5H 2 O）溶液（50 mg / L的失活的残留氯在无菌水中制备）。
- 将拭子插入彩信磁带。
注意：如果MMS盒的非一次性使用的版本，从粗棉布的4 - 层片我asuring 80×22厘米，把它折叠40×11厘米，把它卷成圆筒状约11公分，直径6厘米。 - 组装彩信。
- 连接乙烯管到轴颈上的彩信的两侧，保证了管材完全粘在轴颈，并修复管道进入蠕动泵。确保该蠕动泵的管道上游有足够的长度用于采样。
- 细菌浓度
- 样品至少10个通过运行蠕动泵在高速升农业用水。
- 取样结束后，从水样品撤回蠕动泵的进，继续运行泵，直到没有出水观察退出MMS。
- 如果歧管是用来在同一时间执行多个样品，收集每个MMS的流出物，并且当10 L被通过一个单一的MMS过滤关闭该阀用于该特定MMS和继续运行泵。
- 当采样我已落成，从农业用水撤回蠕动泵的入口，打开歧管的所有阀门，并继续运行泵，直到没有出水观察退出彩信。
- 当浓度已经完成所有彩信，小心地从彩信轴颈除去乙烯管和盖在轴颈上的彩信的两侧。盖紧彩信可以添加丰富的媒体之前存储长达12小时。
2，彩信富集和样品制备
- 丰富
- 拧开彩信的盖子，并在无菌条件下加入20毫升无菌适当浓缩肉汤。使用一个彩信每个选择性富集。另外，执行非选择性富集传播这三个目标细菌在同一样品中。
注意：如果MMS盒的非一次性使用的版本，在无菌条件下从纸盒中取出粗棉布过滤，并放置在无菌袋广告之前鼎225毫升适当浓缩介质。- 对于E的浓缩大肠杆菌 ，加入20毫升缓冲蛋白胨水（BPW）补充有盐酸万古霉素的8毫克/升。
- 对于沙门氏菌的富集。，添加20毫升BPW的补充与补充沙门氏菌 （4毫升/升）。
- 对于L的浓缩菌 ，加入20毫升VIDAS UP李斯特菌（LPT）肉汤。
- 同时对于非选择性富集使用单一MMS的全部三种微生物，使用通用preenrichment肉汤（UPB）。
- 用螺丝将彩信的后盖盖上紧。确保轴颈盖紧，以免富集过程中泄漏和可能的污染。
- 孵育MMS长达18-24小时，在摇动培养箱中于200转。用42°C为E。大肠杆菌和沙门氏菌 。选择性富集。用30℃L。菌选择性富集，并用37＆＃176，C为非选择性富集。
- 拧开彩信的盖子，并在无菌条件下加入20毫升无菌适当浓缩肉汤。使用一个彩信每个选择性富集。另外，执行非选择性富集传播这三个目标细菌在同一样品中。
- 样品制备
- 当孵化完成后，从孵化器中删除彩信，开盖的轴颈之一，并轻轻免除约0.5ml至1.5 ml离心管中。另外，拧开MMS和吸管出0.5毫升一夜致富。
注意：如果MMS磁带的未一次性使用的版本，吸取0.5毫升从包里富集。 - 对于E的比色分析大肠杆菌选择性富集，或用于非选择性富集的分析，超声处理0.5毫升富集于5瓦，22千赫，持续20秒使用探针超声波仪。
- 当孵化完成后，从孵化器中删除彩信，开盖的轴颈之一，并轻轻免除约0.5ml至1.5 ml离心管中。另外，拧开MMS和吸管出0.5毫升一夜致富。
3，准备和比色法基质嵌入在μPADs
- 准备足够的μPADs每个样品和目标进行测试。为了检测大肠杆菌大肠杆菌准备CPRG和X-GLUCμPADs，为沙门氏杆菌 。检测准备管委会μPADs，和L。 monocytogenes检测准备的X磷化铟μPADs。
- 准备HEPES缓冲液[0.1M的HEPES和0.1％牛血清白蛋白（BSA）]的比色底物并根据基板，是要被用于调节缓冲液的pH：pH为7.5制备CPRG或X-GLUC的， pH值为9为MC，和pH为7的X的InP。
- 制备储备溶液的pH值在基板中的3毫米（CPRG），62.5毫米（X-GLUC），15毫米（MC），100毫米（X-InP）材料的浓度调节HEPES缓冲液。避光股票的解决方案。
- 将μPADs无菌培养皿内，然后嵌入的μPAD微点与24微升底物各原液。
4，检测和数据分析
- 发现
- 加入6微升的富集样品中所含的培养皿中各适当μPAD微点。
- 将外盖放回培养皿中，并用封口膜密封。
- 孵育样品与μPAD在37℃达3小时，以允许发色微光点和干燥。
- 结果的目视检查
- 通过的μPADs的颜色变化的简单视觉检查进行检测。
注：通常情况下，产生最终的颜色变化的强烈反应，预计下18-24小时富集，应避免需要进一步澄清，应视为阳性。 - 确定大肠杆菌的存在通过观察微光嵌有从黄色CPRG变化到红紫色和微光嵌有由无色的X GLUC变化至蓝绿色的大肠杆菌阳性样品。
- 确定L的存在通过观察嵌入微光使用X-InP的变化由无色变成靛蓝菌阳性样品。
- 确定沙门氏菌的存在。由嵌有从山坳MC变化观测微光阳性样品orless到紫色紫红色。
- 通过的μPADs的颜色变化的简单视觉检查进行检测。
- 软件辅助数据分析
注：传导，以明确判断弱反应是正还是负，以使结果的半定量分析。- 让μPADs充分干燥。
- 使用平板扫描器扫描μPAD。
- 使用ImageJ的软件来处理图像。
- “打开”扫描图像中的ImageJ位于主菜单（或按“CLT + O”）上的“文件”选项卡下进行分析。
- 反转图像选择“反转”位于主菜单上的“编辑”选项卡下（或按“CLT + SHIFT + I”）。
- 使用主菜单上的“分析”选项卡，并选择“设置测量...”，选择分析报告的测量。
- 确保“平均灰度强度”，“限阈值”和“显示标签”框勾选，然后按“确定”，这是如何设置的软件分析所选择的每个领域，以及它如何报告它。
- 使用“椭圆”工具，绘制一个圆，列出您希望在测量区域。
- 在“分析”选项卡中选择“测量”（或按“CLT + M”）。该软件将测量的平均灰度值定义的区域内，并在可以复制并粘贴到Excel作进一步分析一个弹出式屏幕举报。
注：为了更准确的分析，每个样品至少两个技术复制应该被执行。
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Representative Results
如本方案所述，可以在约15-20分钟来进行浓度使用MMS细菌（ 图1）。在MMS从丙烯腈 - 丁二烯 - 苯乙烯（ABS）在两个分开的部件构成;一个盖和盒都带有集成轴颈组件被插入其中的圆筒形干酪拭子（ 图1A）。然后这两个组件被拧在一起形成MMS（ 图1B）。基于MMS的处理是由一个电池供电的蠕动泵驱动的，允许样品被集中在字段设置。通过耦合MMS浓度，选择性富集（18-24小时），并μPADs;农业用水可迅速（约24小时），方便，廉价地筛选出重要的食源性致病菌和微生物指标，包括大肠杆菌大肠杆菌 ， 沙门氏菌和L。菌等。有了这个协议，这些目标细菌可以被检测教育署的水平低至0.1 CFU /毫升。该μPAD测定是基于细菌的指示酶，与比色底物发生反应（ 图2）的检测。实验检测大肠杆菌大肠杆菌 ，但并不E.大肠杆菌 O157：H7，产生蓝绿色产品（ 图2A）。类似地，可检测的多数大肠杆菌的测定大肠杆菌菌株产生红紫色的反应产物（ 图2B）。化验检测沙门氏杆菌 。 （ 图2C）和L。单核细胞增生 （ 图2D）产生紫色紫红色和靛蓝的颜色，分别为。该测试可以通过眼睛（定性）进行解释和视觉的判断通常是令人满意的阳性和阴性样品之间的区分。另外，数字化图像可以使用ImageJ软件（ 图3A），以便更客观和标准化的数据解释（ 图3B）进行操作。
图1：修改摩尔棉签（MMS）磁带（A）的反汇编彩信。彩信是产生于由丙烯腈 - 丁二烯 - 苯乙烯（ABS）的三维打印机，它由三个主要部分组成：带有注册成立插口组件A盒插入其中一个圆柱形的纱布拭（折叠4层）插入并加盖了盖具有集成插口组装。 （B）将组装的MMS。
图2。细菌-表示比色反应。基材（X-GLUC，CPRG，MC，和X-的InP）嵌入在μPADs的微光点与细菌的指示性的酶反应（与＃946;-葡糖苷酸酶，β-半乳糖苷酶，C8-酯酶，和PI-PLC），以产生一个色度变化。 （A）正X-GLUC反应是通用的大肠杆菌的指示大肠杆菌 ，但并不E.大肠杆菌 O157：H7; （B）一种正CPRG反应是一个迹象表明大肠杆菌大肠杆菌存在; （ 三）积极管委会反应表明沙门氏菌的存在。 （D）和一个正X-InP的反应表明L的存在菌等 。
。图3中的细菌的指示比色μPAD测试的视觉和ImageJ的分析A示出的数字化比色图像的每个检测与两个负（ - ）和正（+）的测试。负面测试使用细菌SPECI的裂解液进行ES不编码靶酶和正面测试与靶细菌的溶胞产物或富集。 （1）未修改的扫描图像。 （2）扫描的图像转换使用ImageJ软件，灰度，和（3）彩色反转图像灰度值的后续解释。 （4）使用ImageJ的μPAD的各个微点内（一例微点是由黄色箭头和圆圈表示）测定的平均灰度强度。B显示的平均灰度强度（用ImageJ的测定）对于各比色μPAD正和负测试。 请点击此处查看此图的放大版本。
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Discussion
本协议描述了用于检测大肠杆菌集成方法大肠杆菌 ， 沙门氏菌和L。菌在农业用水。这里，细菌从大量的农业用水MMS浓度（10升），被加上细菌富集，并使用μPADs细菌，指示比色检测。彩信程序可以应付水样中高颗粒含量而集中的细菌10倍，是强大和现场应用通过微创培训的人员足够简单，并且可以以最小的成本来完成。通过将细菌富集步骤，活细菌进行检测，该方法的灵敏度大大提高。富集放大待测定的靶标，并且当具有选择性生长培养基结合，减少不必要的微生物生长的样品，可以有助于假阳性结果。与μPADs，它提供了一种简单进行最终检测，成本效率的，并且易于解释溶液来筛选重要食源性病原体。整个过程，包括MMS浓度，过夜富集，并且比色检测，可以在一天内进行，并检测细菌污染少至0.1 CFU / ml的水平。
简化方法，并减少了污染的可能性，彩信被用作一个容器，用于细菌的富集。添加此富集的过程会提高敏感度，特异度，增加灵活性入法。虽然只有三个选择性富集这里被利用，可以提高开发富集的细菌。例如，我们正在探索结合特异性诱导成富集媒体加强生产用于比色法检测记者酶的可能性。
用于病原体检测的μPADs简单易用的单点阵列，成本只有0美元.002/device之前，除了色度记者衬底。即使算上富集试剂和显色底物，每个测试的成本是几毛钱，除L。菌测试估计为$ 1.28/test由于对X磷化铟的目前成本高。尽管如此，这个成本比目前的检测方法对食源性致病菌6。在其目前的形式，μPADs必须立即在测试前准备由于不良的基材稳定性。为了克服这种限制，我们测试了加入稳定添加剂和评价干燥存储，以增加衬底/μPAD保质期。此外，我们正在开发多路μPADs利用微流体通道相互连接的几个样品/试剂的网站。
尽管先前的μPAD测试详述的优势，问题与测定特异性是可能的：1）报告酶不是相异由目标细菌sively产生，从而污染背景菌群可能有助于假阳性结果。 2）如果深色颗粒持续在浓缩的媒体，它可以在转移到μPAD掩盖视觉和ImageJ的分析。 3）当前测定不能特异性检测大肠杆菌大肠杆菌 O157：H7。因此，该方法更适合作为初始筛选试验提供动力进行进一步的测试和确认来进行。然而，许多这些缺点很容易解决。纳入的指示比色底物较大的面板将允许更精确地确定目标细菌，包括大肠杆菌大肠杆菌 O157：H7。同样地，附加的选择性富集程序可以尽量减少与样品中的微生物污染。为了减少微粒在富集的影响，一个粗过滤器可用于施加样品的μPAD之前。
总之，氏书房表明，MMS结合浓缩和μPADs可用于检测大肠杆菌的低水平大肠杆菌 ， 沙门氏杆菌 。和L。菌在农业用水。与一些修改，程序是便携式的，能够在现场设置应用。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agricultural water | Irrigation water, produce wash water, well water, etc. | ||
| Vinyl tubing | Wilmar | BN-CVT1005 | 1/4" inner diameter, 3/8" outer diameter, available at: http://www.wilmar.com |
| Modified Moore Swab cartridge | Lumiere Diagnostics | 11 ½ cm in length and 4 ½ cm in width, available at: http://www.lumierediagnostics.com. Alternativelly, a non-disposable version of the cartridge can be used (refer to the text) | |
| Cheesecloth | Chesapeake Wiper & Supply, Inc. | CC90 | Grade #90, 44 x 36 weave, available at: www.raglady.com |
| Household Bleach | Various | Sodium hypochlorite concentration approx. 6% | |
| Sodium thiosulphate 5-hydrate | Mallinckrodt Baker Inc | 8100-04 | |
| Manifold | Built in-house | Optional, device can be constructed from PVC pipes and appropriate fittings | |
| Peristaltic pump | Micron Meters | RPP1300 | Available at: http://www.micronmeters.com |
| Serological pipette | Various | Disposable, 10 ml | |
| Universal preenrichment broth | Difco | 223510 | |
| Buffered peptone water | Difco | 218105 | |
| Salmonella supplement | Biomérieux Industry | 42650 | http://www.biomerieux-usa.com |
| VIDAS UP Listeria (LPT) Broth | Biomérieux Industry | 410848 | http://www.biomerieux-usa.com |
| Vancomycin | Sigma-Aldrich | 861987 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Pipet-Aid | Various | Drummond DP-110 used here | |
| Shaking incubator | Various | Excella E25, New Brunswick Scientific used here | |
| Micropipette | Various | 10 μl, 1 ml | |
| Micropipette tips | Various | Barrier, 10 μl, 1 ml | |
| 1.5 microcentrifuge tubes | Various | RNase- and DNase-free | |
| Probe sonicator | Q Sonica LLC | XL-2000 series | |
| µPADs | Avant | Wax printed 7 mm diameter circles, with 4 pt line thickness. Contact Dr. Charles Henry for additional information | |
| HEPES [N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-2-ethanesulfonic acid] | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A8022 | |
| Chlorophenol red-galactopyranoside (CPRG) | Sigma-Aldrich | 59767 | |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide (X-Gluc) | Sigma-Aldrich | B8174 | |
| 5-bromo-6-chloro-3 indolylcaprylate (magenta caprylate) | Sigma-Aldrich | 53451 | |
| 5-Bromo-4-chloro-myo-inositol phosphate (X-InP) | Sigma-Aldrich | 38896 | |
| Petri dishes, polystyrene 100 mm by 15 mm | Various | Sterile | |
| Flat bed scanner | Various | Xerox USB scanner | |
| ImageJ software | National Institutes of Health | http://rsb.info.nih.gov/ij/ |
References
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