Summary
Stabil isotop mærkning af peptider ved reduktiv dimethylation (redi mærkning) er en hurtig, billig strategi for nøjagtige massespektrometri-baserede kvantitative proteomics. Her demonstrerer vi en robust metode til forberedelse og analyse af proteinblandinger hjælp Redi tilgang, der kan anvendes til næsten enhver prøvetype.
Abstract
Stabil isotop mærkning af peptider ved reduktiv dimethylation (redi mærkning) er en metode til præcist at kvantificere protein udtryk forskelle mellem prøver ved anvendelse af massespektrometri. Redi mærkningen udføres ved hjælp af enten regelmæssige (lys) eller deutereret (tunge) former af formaldehyd og natriumcyanoborhydrid at tilføje to methylgrupper til hver fri amin. Her demonstrerer vi en robust protokol for redi mærkning og kvantitativ sammenligning af komplekse proteinblandinger. Protein prøver til sammenligning er fordøjet i peptider, mærket til at bære enten lette eller tunge methyl tags, blandet, og co-analyseret ved LC-MS/MS. Relative protein mængderne kvantificeres ved at sammenligne ionkromatogram Toparealerne for tunge og lette mærkede versioner af det konstituerende peptid ekstraheres fra den fulde MS-spektre. Den her beskrevne metode omfatter prøveforberedelse ved omvendt fase fastfaseekstraktion, Redi mærkning på kolonne af peptider, peptid fraktionering ved basisk pH reversed-fase (BPRP) kromatografi og StageTip peptidoprensning. Vi diskuterer fordele og begrænsninger ved Redi mærkning med hensyn til andre metoder for stabil isotop inkorporering. Vi fremhæver nye applikationer ved hjælp redi mærkning som en hurtig, billig og præcis metode til at sammenligne protein overflod i næsten enhver form for prøve.
Introduction
Måling koncentrationsforskelle af mange proteiner mellem komplekse prøver er en central udfordring i proteomics. Stigende grad, dette bliver gjort af mærkning af proteiner i hver prøve med forskellige isotopiske tags, der kombinerer prøverne, og ved hjælp af massespektrometri til at kvantificere koncentrationsforskelle. Der findes flere metoder til stabil isotop-mærkning af proteiner og peptider. 15 N mærkning 1 og SILAC 2 indfører isotopiske etiketter metabolisk in vivo, mens ICAT 3, iTRAQ 4 og reduktion dimethylation 5 tilføje stabile isotop tags efter proteinekstraktion og fordøjelse. Blandt disse metoder er reduktiv dimethylation (redi mærkning) stigende popularitet som en billig og reproducerbar metode til at kvantificere proteinkoncentration forskelle i næsten enhver form for prøve.
Redi mærkning involverer reagerende peptider med formaldehyd til dannelse af en Schiff-base, som derefter reduceresved cyanoborhydrid. Denne reaktion dimethylates frie aminogrupper på N-Termini og lysinsidekæder og monomethylates N-terminale proliner. Protokollen beskrevet her methylerer peptider i prøve 1 med en "let" label anvendelse af reagenser med hydrogenatomer i deres naturlige isotopiske distribution og prøve 2 med en "tung" etiket ved hjælp deutereret formaldehyd og natriumcyanborhydrid (figur 1). Hver dimethylerede aminogruppe på et peptid resulterer i en massiv forskel på 6,0377 Da mellem lette og tunge former, der anvendes til at skelne mellem de to former ved hjælp af et massespektrometer. Specifikt relative peptid hyppighed kvantificeret som forholdet MS1 ekstraherede ionkromatogram områder (MS1 toparealforhold) af lette og tunge version for hvert peptid ionpar. Den relative forekomst af et protein er beregnet som den mediane MS1 toparealforhold blandt alle peptider i proteinet. I denne rapport beskriver vi en robust protokol for adfærdning Redi mærkning eksperimenter ved LC-MS/MS, der omfatter omvendt-fase peptid fast fase-ekstraktion, Redi mærkning af kolonnen, peptid fraktionering ved basisk pH-omvendt fase (BPRP) kromatografi og oprensning af peptidblandinger hjælp StageTips (figur 2) . Vi diskuterer fordele og begrænsninger ved brug af Redi mærkning for kvantitative proteomics.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Denne metode er tidligere beskrevet 12.
1. Protein Isolation
Klargør 1 mg celleprotein ved lyserende celler, fortrinsvis ved fysiske fremgangsmåder, såsom franske presse bead beating eller sonikering. Undgå lysozym-medieret cellelysis fordi enzymet vil forvirre massespektrometri målinger.
2.. TCA-præcipitation af proteiner
Tilsæt 1 volumen trichloreddikesyre (TCA) til 4 volumener protein og chill på is i 10 minutter til udfældning af proteiner. Der centrifugeres ved 12.000 xg i 5 minutter ved 4 ° C, og supernatanten fjernes. Pellet resuspenderes i 1 ml iskold acetone og centrifugeres ved 12.000 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Supernatanten fjernes, og invertere røret på bænken til at tørre pelleten i 15 min. Store protein pellets ved -80 ° C.
3.. Denaturere proteiner og reducere disulfidbindingerne
Resuspendere proteiner til ~ 2 mg / ml i 500 pi denaturering og reduktion puffer (enten 4 M urinstof eller 3% SDS i 50 mM HEPES, pH 8,5, 5 mM DTT). Eventuelt omfatter en proteaseinhibitor i bufferen. Inkuber proteiner i 30 min ved 56 ° C efterfulgt af 10 minutter ved stuetemperatur.
4.. Aklylate frie sulfhydrylgrupper til irreversibelt sprænges disulfidbindingsdannelse
Forbered frisk 0,3 M iodacetamid i vand. ADVARSEL! Iodacetamid er meget giftigt. Tilsæt 25 gl 0,3 M iodacetamid (15 mM slutkoncentration) til 500 pi protein og inkuberes i 20 minutter i mørke ved stuetemperatur. Quench iodacetamid ved tilsætning af 10 pi af 300 mM DTT (5 mM endelig DTT koncentration). Opbevar alkylerede proteiner ved -80 ° C.
5.. Protein Digestion
TCA udfælde proteiner (som beskrevet i trin 2) og resuspender i 1 ml 50 mM HEPES (pH 8,2), 1 M urinstof. Forbered en stamopløsning af lysyl endoproteinase (Lys-C) i vand ved en koncentration på 2 pg / pl og tilsættes 5 ul til proteinopløsningen. Inkuber blandingen i 16 timer ved stuetemperatur. Sørg endelig Lys-C-koncentration er 10 ng / ul og protein-til-LysC ratio (w / w) er 1/50 1/200. Resuspender 20 ug sekventering trypsin i 40 pi af 50 mM eddikesyre, tilsættes 5 ul (10 ug trypsin) til Lys-C-fordøjelse, og der inkuberes i 6 timer ved 37 ° C. Brug samme protease-koncentration og protease-til-protein-forhold for Lys-C, som anvendes til trypsin.
6.. Omvendt fase peptid Extraction
- Forsure peptider ved tilsætning af trifluoreddikesyre (TFA) til en slutkoncentration på 0,5% (pH ≈ 2). Vedhæft en C18-kolonne til en ekstraktion manifold. Brug den højeste mulige flow for alle trin undtagen lastning og eluering af peptider.
- Våd kolonne med 6 ml acetonitril (ACN). Vask søjlen med 6 ml 80% ACN, 0,1% TFA, derefter ækvilibrere med 6 ml 0,1% TFA. Lad ikkekolonne til at køre tør mellem trin.
- Stop vakuumtrykket og indlæse 500 ug af peptider på søjlen ved en strømningshastighed på cirka 1 ml / min. Når peptider er bundet til søjlen, genstart vakuum og vaskes med 6 ml 0,1% TFA og derefter med 3 ml citronsyre-puffer (0,09 M citronsyre, 0,23 M Na 2 HPO 4, pH 5,5).
Bemærk: Højere peptid beløb kan mærkes, men C18-søjle bindingskapacitet skal være mindst to gange højere end peptidet mængde for at undgå tab af prøve.
7.. On-kolonne Peptid Mærkning ved reduktiv Dimethylation (Redi Mærkning)
Udfør dette trin under en kemisk hætte som hydrogencyanid frigives i lav koncentration under mærkning processen.
- Forbered 12 ml "lette" og "tunge" redi buffere til methylere peptid frie aminer. Lys Redi buffer består af 0,8% formaldehyd og 0,12 M natriumcyanoborhydrid bærer hydrogenatomer i thEIR naturlige isotopiske udlodninger i citronsyrepuffer. Heavy Redi buffer består af 0,8% deutereret formaldehyd og 0,12 M deutereret natriumcyanoborhydrid i citronsyrebuffer.
- Inkuber søjle indeholdende peptider ved tilsætning af 10 ml enten lette eller tunge redi buffer til peptid-indeholdende kolonner strømningshastighed på 1 ml / min og gentag for at sikre fuldstændig mærkning. Vask kolonne med 6 ml 0,1% TFA og derefter med 1 ml 0,5% eddikesyre.
- Stop vakuum, og der elueres mærkede peptider først med 1 ml 40% ACN, 0,5% eddikesyre, derefter med 1 ml 80% ACN, 0,5% eddikesyre under anvendelse af en strømningshastighed på cirka 0,5 ml / min. Hvis det ønskes, måle mærkning effektiviteten af individuelle prøver ved massespektrometri før blanding tunge og lette prøver (se "Repræsentative resultater"). Bland 01:01 tunge og lette-mærket peptid prøver, der skal kvantificeres ved massespektrometri.
8.. Separat Peptid Blanding af Basic pH omvendt fase (BPRP) Chromatography </ P>
Grundlæggende pH-omvendt fase (BPRP) kromatografi for at adskille peptidblanding i flere fraktioner, som uafhængigt analyseret ved LC-MS/MS at øge proteom dækning.
- Fraktionere peptidblanding på en C18-HPLC-søjle ved anvendelse af en gradient af stigende ACN koncentration i 10 mM ammoniumhydrogencarbonat (pH 8). Start med 5% (v / v) ACN i 5 minutter, stige til 35% ACN i 60 minutter og derefter til 90% ACN i 1 min. Behold 90% ACN i 4 min før reducere ACN til 5% til at re-ligevægt kolonnen for 9 min. Collect 96 fraktioner af samme volumen i en 96-brønds plade (A1 til H12). Overvåg fraktionering under anvendelse af en UV-detektor ved 220 nm, mens peptider eluerer fra søjlen (10-70 min til de betingelser, der er beskrevet her).
- Kombiner fraktionerne fra brønde A1, C1, E1, og G1 (fraktion A1) fra brønde B1, D1, F1 og H1 (fraktion B1) fra brønde A2, C2, E2 og G2 (fraktion A2) og dermed for den resterende fraktioner. Fjern solvent ved hjælp af en vakuum centrifuge. Resuspender peptider fra fraktioner A1, B2, A3, B4, A5, B6, A7, B8, A9, B10, A11 og B12 i 130 pi 1 M urea/0.5% TFA og renses ved hjælp af StageTips som beskrevet i trin 9. Store fraktioner B1, A2, B3, A4, B5, A6, B7, A8, B9, A10, B11 og A12 ved -20 º C.
9.. Purify Peptider af Stop & Go Extraction (StageTips)
Forbered C18-StageTip 7 mikrosøjler ved at pakke 200 ul pipettespidser med to C18 diske med en indvendig diameter (ID) på 1,07 mm. Put Stage Tips til Eppendorf-rør. Brug en mikrocentrifuge for at vaske tips med 130 pi methanol, derefter 130 ul 80% ACN, 0,5% eddikesyre. Ækvilibrer StageTips med 130 pi 0,1% TFA. Overfør peptidblanding til StageTips og vaskes med 130 pi 0,1% TFA, derefter 40 ul 0,1% TFA, derefter 40 ul 0,5% eddikesyre. Eluere peptiderne først med 20 pi 40% ACN, 0,5% eddikesyre, derefter 20 ul 80% ACN, 0,5% eddikesyre. Kombiner eluaterne ennd tørre ved vakuumfiltrering.
10. Mikrokapillær LC-MS/MS
- Opløses peptider i 1-5 pi 5% myresyre, 5% ACN til en koncentration på cirka 1 pg / pl. Løse ~ 1 ug peptider på en 100 um x 20 cm C18-omvendt fase-HPLC-søjle med en gradient af 6-22% ACN i 0,125% myresyre anvendes over 75 eller 100 minutter ved en strømningshastighed på ~ 300 nl / min.
- Identificere peptider ved hjælp af en LTQ Orbitrap Velos 12 eller lignende væskekromatografi-massespektrometri platform med et massespektrometer levere høj opløsning og høj masse nøjagtighed. Betjen massespektrometer i data-afhængig tilstand med en fuld MS-scanning (beslutning af 60.000) erhvervede i Orbitrap analysatoren. Generer lineær ionfælde MS / MS spektre for de 20 mest udbredte ioner detekteres i den fulde MS-spektrum. Sæt automatisk gain (AGC) mål til 1 x 10 6 for den fulde MS og 2.000 for MS / MS. Set maksimale ion akkumulerende gange til 1.000 msekfor MS og 150 msek for MS / MS. Udeluk fragmenterede peptid precursor ioner fra yderligere udvælgelse fra MS / MS for 20-60 sek.
11.. MS / MS Data Acquisition
Identificere peptider ved at sammenligne MS / MS spektre RAW-filer til en teoretisk database med en algoritme som SEQUEST 8 ved hjælp af disse parametre (tabel 1).
Tabel 1.. Peptid Database Søgeparametre.
| Generelle parametre | fuldt trypsinfordøjelse med op til 2 ubesvarede spaltninger |
| 25 ppm prækursor-ion tolerance | |
| 1,0 Da fragment ion tolerance | |
| Statiske Ændringer | 57,02146 Da på cystein, carboxyamidomethylation |
| 28,03130 Da om lysin og peptid N-terminalen, lys dimethylation etiket | |
| Dynamiske Ændringer | 15,99491 Da på methionin, oxidation |
| 6,03766 Da om lysin og peptid N-terminalen, tung dimethylation etiket |
- Filter peptider til en 1% falsk opdagelse sats med en metode som mål-lokkedue 9 strategi ved hjælp af en database over åbne læserammer i den faktiske og den tilbageførte orienteringer.
12.. Peptid Kvantificering
Arealerne af tunge og lette par af MS1 udvundet ion kromatogrammer (MS1 peak områder) og peptid signal-til-støj (S / N) forhold 10. Medtag peptid par kun, når deres gennemsnitlige signal-noise forholdet er større end fem. Kvantificere relative forekomst af et peptid i de to prøver som forholdet MS1 Toparealerne for tunge og lette versioner af det samme peptid (MS1 toparealforhold). Beregn relative protein hyppighed som den mediane MS1 toparealforhold for alle peptider i proteinet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi evaluerede nøjagtighed, præcision og reproducerbarhed Redi mærkning hjælp Saccharomyces cerevisiae og Clostridium phytofermentans helcellelysater. Vi først kvantificeret Redi mærkning effektiviteten af en blanding af C. phytofermentans proteinlysater fra cellulose (tung mærket H) og glucose (lys etiket, L) kulturer. Når filtreret til et peptid falsk opdagelse 1%, denne prøve indeholdt 11.194 unikke peptidsekvenser med en 98% redi mærkning effektivitet. Ufraktioneret S. cerevisiae proteinlysat blev ligeledes mærkes med H-eller L reagenser blandes i forskellige forhold, og analyseres. Proteinekspression forskelle (log 2 (median MS1 toparealer)) reproducerbart afspejler de forhold, hvor de H-og L prøver blev blandet på tværs af en bred vifte af blandingsforhold (figur 3). Specifikt blev den fold-ændring på 99% af de proteiner, målt som er mindre end 1,6 gange for 1:1 blandede prøver. I1:10 og 10:01 prøver, 99% proteiner var inden for 3,8 gange den forventede forhold, som viser en stigning i standardafvigelsen på større afstand fra en 1:1-blanding. Når Redi mærkning blev påført Clostridium phytofermentans proteom vi kvantificeret mere end 2.000 proteiner med 94% proteiner målt i 2-fold niveauer for replikatkulturer vokser på glucose (figur 4A). Protein fold ændringer for dublerede par af kulturer (glukose versus cellulose), blev også stærkt korrelerede (r 2 = 0,82), (figur 4B). S. cerevisiae sammenligninger (figur 3) er fra en enkelt kultur, og viser således, teknisk reproducerbarhed Redi baserede kvantitative proteomics. C. phytofermentans målinger (figur 4A, B) sammenligne replikere kulturer så udtryk forskelle udgør både målefejl og biologisk variation mellem kulturer. Tilsammen udgør disse erfaringermenter understøtte denne Redi proteomics er en nøjagtig og reproducerbar metode til at kvantificere protein udtryk forskelle mellem komplekse prøver.
Fig. 1. Reduktiv dimethylation af peptider under anvendelse af tunge og lette reagenser dimethylate frie aminer. Det samme peptid mærket med tung versus lette reagenser har en 6,0377 Da masse skift pr fri amin. Den her viste peptid mærkes både ved N-terminalen og en lysin-sidekæde. Billede tilpasset fra Henvisning 11. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2.. Oversigt over protokol for kvantitative proteomics ved reduktiv dimethylation. Røde tal over pile svarer til trin beskrevet i protokollen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Fig. 3. Evaluering af redi mærkning ved hjælp af Saccharomyces cerevisiae helcellelysater. Prøver fra en enkelt kultur blev mærket med enten tunge (H) og lette (L)-reagenser, blandet i forskellige forhold (1H: 10L, 1H: 5L, 1H: 2L, 1H: 1L, 2H: 1L, 5H: 1L og 10H: 1L), og protein forskelle mellem H-og L-prøver blev kvantificeret som log 2 median MS1 toparealforhold (log 2 H / L ratio). R 2-værdi af en lineær trend linie gennem alle datapunkter var 0,96 (sort linje); Pearson korrelation var 0,98. Confidence grænser (røde linjer) påvise den absolutte vinkelrette afstand fra den tendens linje, inden for hvilken 95% af datapunkter blev fundet for hver prøve. Billede tilpasset fra Henvisning 12. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4.. Kvantificering af Redi-mærket Clostridium phytofermentans proteiner fra kulturer vokser forskellige kulstof-kilder. A) Protein udtryk i en glukose kultur i forhold til en gengivelse glukose kultur, en hemicellulose kultur, og en cellulose kultur. Fraktionen af proteiner udtrykt inden for det dobbelte niveauer: glucose-glucose (94%), glukose-hemicellulose (80%) og glucose-cellulose (49%). B) Fold ændringer i proteinekspression for glucose versus kulturer cellulose er stærkt korreleret (r2 = 0,82) for dubletter par af kulturer. Billeder tilpasset fra Henvisning 12. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flere punkter gør stabil isotop mærkning af peptider ved hjælp af reduktiv dimethylation (redi mærkning) en attraktiv metode til kvantitative proteomics: billige mærkningsreagenser (reagenser koste mindre end $ 1 pr prøve), hurtig reaktionshastighed (~ 10 min), fravær af sideprodukter, høje reproducerbarhed (figur 3, 4), stabile reaktionsprodukter, evne til at bruge enhver protease og høj ionisering effektivitet af mærkede peptider. Kemisk mærkning af Redi er også fordelagtig i forhold til metabolisk mærkning, da det ikke kræver stammer eller cellelinier med specifikke aminosyre auxotrofier eller vækst på et syntetisk medium. Som sådan kan Redi anvendes på næsten enhver type protein prøve herunder nye mikrober 12, for hvilke nogle mutantstammer er tilgængelige 13 og menneskelige stamceller 14, blandt andre 15.
En begrænsning af redi mærkning er en lavere evne til at multiplex prøver i forhold til othendes metoder såsom isobar mærkning (f.eks iTRAQ eller TMT), som for tiden op til 8 prøver kan være samtidigt kvantificeres 16. Den metode, vi beskriver her tillader kvantitativ sammenligning af to differentielt mærkede prøver. Yderligere isotope kombinationer af formaldehyd og natriumcyanborhydrid kan anvendes til at producere op til 3 etiketter, der afviger med mindst 4 Da 17 og redi mærkning er for nylig blevet udvidet til 5 multipleksede prøver 18. En anden udfordring for Redi mærkning er, at deutererede peptider eluerer lidt før lyse dem, når du bruger modfasekromatografi. For at kontrollere for denne "deuterium effekt", bør peptid kvantificering altid være baseret på hele udvundet ionkromatogram (MS1 toparealet) i stedet for intensiteter fra én scanning.
Redi proteomics protokollen beskrevet her indeholder en række forbedringer 11,15,17 foretaget siden den første beskrivelse af reduktion dimethyl mærkningaf peptider for massespektrometri 5. Vi beskrev en "on-kolonnen" mærkning metode til at give højere peptid beløb og mærkning effektivitet kan kontrolleres, før prøven blanding, men "i opløsning" og "online" mærkningsfremgangsmåder eksistere som godt 19. Ud over proteomet kvantificering bliver anvendt Redi mærkning isoform bestemmelse 20 og kan kombineres med andre metoder til at analysere posttranslationelle modifikationer såsom phosphorylering 11,18 acetylering 21 og glycosylering 22. På grund af sin alsidighed og billig, kvantitativ kemi vil Redi mærkning i stigende grad blive anvendt til kvantitative proteomics på nye og spændende måder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser eller andre interessekonflikter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | T9159 | protein precipitation |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 650501 | protein precipitation |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | 71736 | denature, reduce protein |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | denature, reduce protein |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43816 | denature, reduce, alkylate protein |
| Protease Inhibitor Complete Mini Cocktail | Roche | 4693124001 | denature, reduce protein |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I6125 | alkylate protein |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7523 | resuspend, extract, label protein |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | resuspend protein |
| Lysyl Endoprotease | Wako Chemicals | 129-02541 | protein digestion |
| Sequencing grade trypsin | Promega | V5111 | protein digestion |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | protein digestion |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 299537 | Reversed-phase peptide extraction |
| tC18 Sep-Pak C18 cartridges | Waters | WAT054960 | Reversed-phase peptide extraction |
| Extraction manifold | Waters | WAT200609 | Reversed-phase peptide extraction |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 14261 | various |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | “light” peptide labeling |
| Cyanoborohydride | Sigma-Aldrich | 71435 | “light” peptide labeling |
| Deuterated formaldehyde | Sigma-Aldrich | 492620 | “heavy” peptide labeling |
| Sodium cyanoborodeuteride | CDN isotopes | D-1797 | “heavy” peptide labeling |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | peptide labeling |
| C18-HPLC column (4.6 x 250 mm, 5 µm particle size) | Agilent | 770450-902 | basic pH reversed-phase chromatography |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | 399388 | various |
| C18 Empore Disks | 3M | 14-386-3 | STAGE tips |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 494437 | STAGE tips |
References
- Washburn, M. P., Ulaszek, R., Deciu, C., Schieltz, D. M., Yates III, J. R. Analysis of quantitative proteomic data generated via multidimensional protein identification technology. Analytical chemistry. 74 (7), 1650-1657 (2002).
- Ong, S. -E., Blagoev, B., et al. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Molecular & cellular proteomics: MCP. 1 (5), 376-386 (2002).
- Gygi, S. P., Rist, B., Gerber, S. A., Turecek, F., Gelb, M. H., Aebersold, R. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nature biotechnology. 17 (10), 994-999 (1999).
- Ross, P. L., et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Molecular & cellular proteomics: MCP. 3 (12), 1154-1169 (2004).
- Hsu, J. -L., Huang, S. -Y., Chow, N. -H., Chen, S. -H. Stable-isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Analytical Chemistry. 75 (24), 6843-6852 (2003).
- Chick, J. M., Haynes, P. A., Molloy, M. P., Bjellqvist, B., Baker, M. S., Len, A. C. L. Characterization of the rat liver membrane proteome using peptide immobilized pH gradient isoelectric focusing. Journal of Proteome Research. 7 (3), 1036-1045 (2008).
- Rappsilber, J., Ishihama, Y., Mann, M. Stop and go extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics. Analytical chemistry. 75 (3), 663-670 (2003).
- Eng, J. K., McCormack, A. L., Yates III, J. R. An approach to correlate tandem mass spectral data of peptides with amino acid sequences in a protein database. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 5 (11), 976-989 (1994).
- Elias, J. E., Gygi, S. P. Target-decoy search strategy for increased confidence in large-scale protein identifications by mass spectrometry. Nature methods. 4 (3), 207-214 (2007).
- Bakalarski, C. E., et al. The impact of peptide abundance and dynamic range on stable-isotope-based quantitative proteomic analyses. Journal of Proteome Research. 7 (11), 4756-4765 (2008).
- Wilson-Grady, J. T., Haas, W., Gygi, S. P. Quantitative comparison of the fasted and re-fed mouse liver phosphoproteomes using lower pH reductive dimethylation. Methods (San Diego, Calif.). , (2013).
- Tolonen, A. C., Haas, W., Chilaka, A. C., Aach, J., Gygi, S. P., Church, G. M. Proteome-wide systems analysis of a cellulosic biofuel-producing microbe. Molecular Systems Biology. 7, 461 (2011).
- Tolonen, A. C., Chilaka, A. C., Church, G. M. Targeted gene inactivation in Clostridium phytofermentans shows that cellulose degradation requires the family 9 hydrolase Cphy3367. Molecular Microbiology. 74 (6), 1300-1313 (2009).
- Munoz, J., et al. The quantitative proteomes of human-induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells. Molecular systems biology. 7, 550 (2011).
- Kovanich, D., Cappadona, S., Raijmakers, R., Mohammed, S., Scholten, A., Heck, A. J. R. Applications of stable isotope dimethyl labeling in quantitative proteomics. Analytical and bioanalytical chemistry. 404 (4), 991-1009 (2012).
- McAlister, G. C., et al. Increasing the multiplexing capacity of TMTs using reporter ion isotopologues with isobaric masses. Analytical chemistry. 84 (17), 7469-7478 (2012).
- Boersema, P. J., Aye, T. T., Van Veen, T. A. B., Heck, A. J. R., Mohammed, S. Triplex protein quantification based on stable isotope labeling by peptide dimethylation applied to cell and tissue lysates. Proteomics. 8 (22), 4624-4632 (2008).
- Wu, Y., et al. Five-plex isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Chemical communications (Cambridge, England). , (2014).
- Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. R. Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics. Nature Protocols. 4 (4), 484-494 (2009).
- She, Y. -M., Rosu-Myles, M., Walrond, L., Cyr, T. D. Quantification of protein isoforms in mesenchymal stem cells by reductive dimethylation of lysines in intact proteins. Proteomics. 12 (3), 369-379 (2012).
- Chen, S. -H., Chen, C. -R., Chen, S. -H., Li, D. -T., Hsu, J. -L. Improved N(α)-acetylated Peptide Enrichment Following Dimethyl Labeling and SCX. Journal of proteome research. 12 (7), 3277-3287 (2013).
- Sun, Z., et al. Capture and Dimethyl Labeling of Glycopeptides on Hydrazide Beads for Quantitative Glycoproteomics Analysis. Analytical Chemistry. 84 (20), 8452-8456 (2012).
