Summary
Stabile Isotopenmarkierung von Peptiden durch reduktive Dimethylierung (Redi-Markierung) ist eine schnelle, kostengünstige Strategie für genaue Massenspektrometrie-basierte quantitative Proteomik. Hier zeigen wir ein robustes Verfahren für die Aufbereitung und Analyse von Proteingemischen mit Hilfe der redi Ansatz, der auf fast jedem Probentyp angewandt werden kann.
Abstract
Stabile Isotopenmarkierung von Peptiden durch reduktive Dimethylierung (Redi Kennzeichnung) ist eine Methode, um genau zu quantifizieren Proteinexpressionsunterschiede zwischen den Proben mit Hilfe der Massenspektrometrie. Redi Kennzeichnung erfolgt mit entweder regelmäßig (Licht) oder deuteriertes (Schwer-) Formen von Formaldehyd und Natriumcyanoborhydrid zu zwei Methylgruppen an jedem freien Amin hinzufügen. Hier zeigen wir, einen robusten Protokoll für REDi Kennzeichnung und quantitativen Vergleich von komplexen Proteingemischen. Proteinproben für den Vergleich sind in Peptide, beschriftet, entweder leicht oder schwer Methyl-Tags, gemischt und mittels LC-MS/MS analysiert Co-tragen verdaut. Relative Protein Häufigkeiten werden durch den Vergleich der Ionenchromatogramm Peakflächen von schweren und leichten markierten Versionen der Peptidbestandteil von der vollen MS-Spektren extrahiert quantifiziert. Das hier beschriebene Verfahren umfasst die Probenvorbereitung durch Umkehrphasen-Festphasenextraktion, On-Column-Redi Markierung von Peptiden, Peptid-Fraktionierung durch basischen pH-reversed-Phase (BPRP) Chromatographie und StageTip Peptidreinigung. Wir diskutieren Vorteile und Grenzen der redi Kennzeichnung gegenüber anderen Methoden zur stabilen Isotopen Gründung. Wir zeigen neue Anwendungen mit Redi Kennzeichnung als eine schnelle, kostengünstige und genaue Methode, um die Proteinhäufigkeiten in fast jeder Art von Probe zu vergleichen.
Introduction
Messkonzentrationsunterschiede vieler Proteine zwischen komplexen Proben ist eine zentrale Herausforderung in der Proteomik. Zunehmend wird dies durch Markierung von Proteinen in jeder Probe mit unterschiedlichen Isotopen-Tags, die Kombination der Proben und mit Hilfe der Massenspektrometrie, um Konzentrationsunterschiede zu quantifizieren getan. Es gibt verschiedene Verfahren für stabile Isotopenmarkierung von Proteinen und Peptiden. Kennzeichnung 15 N 1 und 2 SILAC vorstellen Isotopenmarkierungen metabolisch in vivo, während iCAT 3, iTRAQ 4, 5 und Reduktion Dimethylierung nach der Proteinextraktion und Verdauung hinzufügen stabilen Isotopen-Tags. Unter diesen Verfahren wird die reduktive Dimethylierung (Redi-Markierung) an Popularität gewinnt als eine preiswerte, reproduzierbare Methode zur Proteinkonzentration Unterschiede in fast jeder Art von Probe zu quantifizieren.
REDi Markierung beinhaltet die Umsetzung von Peptiden mit Formaldehyd zu einer Schiffschen Base, die dann reduziert wird, zu bilden,von Cyanoborhydrid. Diese Reaktion dimethylates freien Aminogruppen auf N-Termini und Lysin-Seitenketten und monomethylates N-terminale Prolin. Das hier beschriebene Protokoll methyliert Peptide in Probe 1 mit einem "light"-Label unter Verwendung von Reagenzien mit Wasserstoffatomen in ihrer natürlichen Isotopenverteilung und Probe 2 mit einer "schweren" Etikett mit deuteriertem Formaldehyd und Cyanoborhydrid (Abbildung 1). Jeder dimethylierten Aminogruppe auf einem Peptid zu einer Massendifferenz von 6,0377 Da zwischen leichten und schweren Formen, die verwendet wird, um zwischen den beiden Formen mit einem Massenspektrometer zu unterscheiden. Insbesondere werden relativen Häufigkeiten Peptid als das Verhältnis der MS1 extrahiert Ionenchromatogramm Bereiche (Peakflächenverhältnis MS1) von leichten und schweren Version für jedes Peptid Ionenpaar quantifiziert. Die relative Menge eines Proteins wird als Median MS1 Peakflächenverhältnis aller Peptide in dem Protein errechnet. In diesem Bericht beschreiben wir ein robustes Protokoll für das Verhaltening Redi Markierungsexperimente mit LC-MS/MS, die Umkehrphasen-Peptid-Festphasenextraktion, On-Column-Kennzeichnung redi-, Peptid-Fraktionierung durch basischen pH-Reversed-Phase (BPRP) Chromatographie und Reinigung der Peptidgemische mit StageTips (Abbildung 2) umfasst . Wir diskutieren Vor-und Nachteile der Verwendung von Redi Kennzeichnung für die quantitative Proteomik.
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Protocol
HINWEIS: Diese Methode wurde bereits beschrieben 12.
1. Proteinisolierung
Herstellung von 1 mg Zellprotein durch Lysieren von Zellen, vorzugsweise durch physikalische Methoden wie Französisch Presse Wulst Schlagen oder Ultraschallbehandlung. Vermeiden Lysozym-vermittelte Zell-Lyse, weil das Enzym Massenspektrometrie Messungen zu verwechseln.
2. TCA-Fällung von Proteinen
1 Volumen Trichloressigsäure (TCA) bis 4 Volumen Protein-und Chill auf Eis für 10 min, um Proteine zu fällen. Zentrifuge bei 12.000 × g für 5 min bei 4 ° C und Entfernen des Überstandes. Resuspendieren des Pellets in 1 ml eiskaltem Aceton und Zentrifuge bei 12.000 × g für 5 min bei 4 ° C. Entfernen Sie den Überstand und das Röhrchen auf der Bank, um das Pellet für 15 Minuten trocknen. Speicher Proteinpellets bei -80 ° C.
3. Proteine denaturieren und die Reduzierung von Disulfidbrücken
ReProteine aussetzen, um ~ 2 mg / ml in 500 ul Denaturierung und Reduktion Puffer (entweder 4 M Harnstoff, 3% SDS in 50 mM HEPES pH 8,5, 5 mM DTT). Optional umfassen einen Proteaseinhibitor in Puffer. Proteine, Inkubation 30 min bei 56 ° C, gefolgt von 10 min bei Raumtemperatur.
4. Aklylate freien Sulfhydrylgruppen irreversibel stören Disulfidbindungsbildung
Bereiten Sie frischen 0,3 M iodoacetamide in Wasser. ACHTUNG! Iodacetamid ist hochgiftig. Hinzufügen von 25 &mgr; l 0,3 M Iodacetamid (15 mM Endkonzentration) zu 500 ul Protein und Inkubation für 20 min im Dunkeln bei Raumtemperatur. Quench iodoacetamide durch Zugabe von 10 ul 300 mM DTT (5 mM DTT endgültige Konzentration). Speichern alkylierten Proteinen bei -80 ° C.
5. Protein Verdauung
TCA-Ausfällung Proteine (wie in Schritt 2 beschrieben) und Resuspendieren in 1 ml 50 mM HEPES (pH 8,2), 1 M Harnstoff. Bereiten Sie eine Stammlösung von Lysyl endoproteinase (Lys-C) in Wasser bei einer Konzentration von 2 ug / ul und mit 5 &mgr; l der Proteinlösung. Inkubieren der Mischung für 16 Stunden bei Raumtemperatur. Sicherzustellen, dass die endgültige Lys-C-Konzentration 10 ng / &mgr; l, und das Protein-zu-LysC-Verhältnis (w / w) 1/50 bis 1/200 ist. Resuspendieren 20 ug Trypsin sequencing grade in 40 ul 50 mM Essigsäure werden 5 ul (10 ug Trypsin) an die Lys-C-Verdau und Inkubation für 6 h bei 37 ° C. Verwenden die gleiche Proteasekonzentration und Protease-zu-Protein-Verhältnisse für die Lys-C wie Trypsin verwendet.
6. Umkehrphasen-Peptid-Extraktion
- Anzusäuern Peptide durch Zugabe von Trifluoressigsäure (TFA) bis zu einer Endkonzentration von 0,5% (pH ≈ 2). Bringen Sie eine C18-Säule einer Extraktion vielfältig. Verwenden Sie die höchste Durchflussrate für alle Schritte außer Be-und Elution der Peptide.
- Nass Säule mit 6 ml Acetonitril (ACN). Waschen Säule mit 6 ml 80% ACN, 0,1% TFA, dann ins Gleichgewicht mit 6 ml 0,1% TFA. Lassen Sie dasSpalte trocken Schritte laufen.
- Stoppen Vakuumdruck und Last 500 ug von Peptiden auf die Säule bei einer Fließgeschwindigkeit von etwa 1 ml / min. Nachdem Peptide auf die Säule gebunden Neustart Vakuum und wäscht mit 6 ml 0,1% TFA, dann mit 3 ml Zitronensäurepuffer (0,09 M Zitronensäure, 0,23 M Na 2 HPO 4, pH 5,5).
Hinweis: Höhere Peptid-Mengen können markiert werden, aber die Bindungskapazität C18-Säule sollte mindestens zwei-fach höher als die Menge an Peptidprobenverlust zu vermeiden.
7. On-Spalte der Peptidmarkierung durch reduktive Dimethylierung (Redi Labeling)
Führen Sie diesen Schritt unter einer chemischen Abzugshaube als Cyanwasserstoff in geringer Konzentration während des Markierungsprozesses freigesetzt.
- Bereiten Sie 12 ml "Licht" und "schwer" Redi Puffer Peptid freien Amine methylieren. Licht Redi Puffer besteht aus 0,8% Formaldehyd und 0,12 M Natriumcyanoborhydrid Durchführung Wasserstoffatome in their natürliche Isotopenverteilungen in Zitronensäure-Puffer. Schwere Redi Puffer besteht aus 0,8% deuteriertes Formaldehyd und 0,12 M deuteriertem Natriumcyanoborhydrid in Zitronensäure-Puffer.
- Inkubieren Spalte Peptide durch Zugabe von 10 ml entweder leicht oder schwer Redi Puffer zu den Peptid-enthaltende Spalten am Flussrate von 1 ml / min, und wiederholen Sie die vollständige Kennzeichnung zu gewährleisten. Waschkolonne mit 6 ml 0,1% TFA und dann mit 1 ml 0,5% Essigsäure.
- Stoppen Vakuum und markierte Peptide eluieren zuerst mit 1 ml 40% ACN, 0,5% Essigsäure, dann mit 1 ml 80% ACN, 0,5% Essigsäure mit einer Fließgeschwindigkeit von etwa 0,5 ml / min. Wenn gewünscht, messen Sie die Markierungseffizienz der einzelnen Proben mittels Massenspektrometrie vor dem Mischen der schweren und leichten Proben (siehe "Repräsentative Ergebnisse"). Mix 1.01 schweren und leichten markiertes Peptid Proben massenspektrometrisch quantifiziert werden.
8. Separate Peptidmischung von Basic pH Reversed Phase (BPRP) Chromatographie </ P>
Basischen pH-Reversed-Phase (BPRP) gereinigt, um die Peptid-Gemisch in mehrere Fraktionen, die unabhängig von LC-MS/MS analysiert werden Proteom-Abdeckung zu erhöhen trennen.
- Fraktionierung der Peptidmischung auf einer C18-HPLC-Säule durch Anlegen eines Gradienten mit zunehmender ACN-Konzentration in 10 mM Ammoniumbicarbonat (pH 8). Beginnen mit 5% (v / v) ACN für 5 min, zu erhöhen, um 35% ACN in 60 min, und dann auf 90% ACN in 1 min. Bewahren Sie die 90% ACN für 4 min vor Verringerung der ACN zu 5% wieder ins Gleichgewicht die Spalte für 9 min. Sammeln 96 Fraktionen von gleichem Volumen in einer 96-Well-Platte (A1 bis H12). Überwachung der Fraktionierung unter Verwendung eines UV-Detektors bei 220 nm, während Peptide Elution von der Säule (10-70 min für den hier beschriebenen Bedingungen).
- Kombinieren Fraktionen aus Vertiefungen A1, C1, E1 und G1 (Fraktion A1) aus den Vertiefungen B1, D1, F1 und H1 (Fraktion B1) aus den Vertiefungen A2, C2, E2 und G2 (Fraktion A2) und demgemäß für die restlichen Fraktionen. Entfernen Sie die Zahlungsfähigkeitt mit einer Vakuumzentrifuge. Resuspendieren Peptide von Fraktionen A1, B2, A3, B4, A5, B6, A7, B8, A9, B10, A11 und B12 in 130 ul 1 M urea/0.5% TFA und Reinigung mit StageTips wie in Schritt 9 beschrieben. Shop Fraktionen B1, A2, B3, A4, B5, A6, B7, A8, B9, A10, B11, A12 und bei -20 º C.
9. Purify Peptiden durch Stop and Go Extraction (StageTips)
Bereiten C18-StageTip 7 Mikrosäulen durch die Verpackung 200 ul Pipettenspitzen mit zwei C18-Festplatten mit einem Innendurchmesser (ID) von 1,07 mm. Setzen Bühnen Tipps in Eppendorf-Röhrchen. Verwenden Sie einen Mikro um Tipps mit 130 ul Methanol, dann 130 ul 80% ACN, 0,5% Essigsäure waschen. Ins Gleichgewicht StageTips mit 130 ul 0,1% TFA. Peptidgemisch zu übertragen StageTips und wäscht mit 130 ul 0,1% TFA, dann wurden 40 ul 0,1% TFA, dann 40 &mgr; l 0,5% Essigsäure. Peptide eluieren zuerst mit 20 ul 40% ACN, 0,5% Essigsäure, dann 20 ul 80% ACN, 0,5% Essigsäure. Kombinieren Sie ein Eluatend trockenen durch Vakuumfiltration.
10. Mikrokapillar LC-MS/MS
- Lösen Peptide in 1-5 ul 5% Ameisensäure, 5% ACN in einer Konzentration von etwa 1 ug / ul. Beheben ~ 1 &mgr; g Peptide auf eine 100 &mgr; m × 20 cm C18-Umkehrphasen-HPLC-Säule mit einem Gradienten von 6-22% ACN in 0,125% Ameisensäure über 75 oder 100 min aufgebracht mit einer Flussrate von ca. 300 Nl / min.
- Identifizieren Peptide mit Hilfe eines LTQ Orbitrap Velos 12 oder ähnliche Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie-Plattform mit einem Massenspektrometer bietet hohe Auflösung und hohe Massengenauigkeit. Betreiben Sie das Massenspektrometer in den datenabhängigen Modus mit einem vollen MS-Scan (Auflösung von 60.000) in der Orbitrap Analysator erworben. Generieren linearen Ionenfalle MS / MS-Spektren für die 20 in der Voll MS-Spektrum erkannt häufigsten Ionen. Einstellen der automatischen Verstärkungsregelung (AGC) Ziele zu 1 × 10 6 für die volle MS und 2.000 für MS / MS. Stellen Sie maximale Ionenakkumulationszeiten bis 1000 msfür MS und 150 ms für MS / MS. Ausschließen fragmentierten Peptid-Vorläufer-Ionen von der weiteren Auswahl von MS / MS für 20-60 sek.
11. MS / MS-Datenerfassung
Peptide zu identifizieren durch Vergleichen MS / MS-Spektren Rohdaten zu einem theoretischen Datenbank mit einem Algorithmus, wie SEQUEST 8 unter Verwendung dieser Parameter (Tabelle 1).
Tabelle 1. Peptid Datenbanksuchparameter.
| Allgemeine Parameter | vollständig tryptischen Verdau mit bis zu 2 verpasst Spaltungen |
| 25 ppm Vorläuferionen Toleranz | |
| 1.0 Da Fragmentionentoleranz | |
| Statische Änderungen | 57,02146 Da auf Cystein, Carboxyamidomethylierung |
| 28,03130 Da auf Lysin und dem Peptid N-Terminus, Licht Dimethylierung Label | |
| Dynamische Änderungen | 15,99491 Da an Methionin, Oxidation |
| Da auf 6,03766 Lysin und dem Peptid N-Terminus, schwere Dimethylierung Label |
- Filter Peptide zu einer falschen Erkennungsrate von 1% mit einem Verfahren wie dem Ziel-Decoy-9-Strategie unter Verwendung einer Datenbank von offenen Leserahmen in den tatsächlichen und Orientierungen umgekehrt.
12. Peptid-Quantifizierung
Berechnen Sie die Bereiche der schweren und leichten Paare von MS1 extrahiert Ionenchromatogramme (MS1 Peakflächen) und Peptid-Signal-zu-Rauschen (S / N)-Verhältnisse 10. Fügen Peptidpaare nur, wenn ihre durchschnittlichen Signal-noise Verhältnis über fünf. Quantifizierung der relativen Menge eines Peptids in den zwei Proben als das Verhältnis der Peakflächen MS1 von schweren und leichten Varianten des gleichen Peptids (MS1 Peakflächenverhältnis). Berechnen relativer Häufigkeiten Protein als Median MS1 Peakflächenverhältnis für alle Peptide in dem Protein.
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Representative Results
Wir untersuchten die Genauigkeit, Präzision und Reproduzierbarkeit der redi Kennzeichnung mit Saccharomyces cerevisiae und Clostridium phytofermentans Ganzzelllysaten. Wir haben zuerst quantifiziert die redi Markierungseffizienz aus einer Mischung von C phytofermentans Proteinlysate aus Cellulose (schwere beschriftet, H) und Glucose (Licht-Label, L) Kulturen. Wenn ein Peptid False Discovery Rate 1% gefiltert, enthielt diese Probe 11.194 einzigartige Peptidsequenzen mit einer Redi Markierungseffizienz 98%. Unfraktioniertes S. cerevisiae-Protein-Lysat wurde auf ähnliche Weise mit H-oder L-Reagenzien markiert, in verschiedenen Verhältnissen gemischt und analysiert. Proteinexpressionsunterschiede (log 2 (Median MS1 Peakflächen)) reproduzierbar spiegeln die Verhältnisse, bei denen die H-und L-Proben wurden in einem breiten Spektrum von Mischungsverhältnissen (Abbildung 3) gemischt. Insbesondere wurden die fold change von 99% der Proteine, die kleiner als 1,6 fach für das 1:1 gemischten Proben gemessen. Indie Proben 1:10 und 10:1, 99% Proteine wurden in 3,8 fache der erwarteten Verhältnis, welches eine Erhöhung der Standardabweichung in größerer Entfernung von einer 1:1-Mischung. Wenn Redi Kennzeichnung wurde an das Clostridium phytofermentans Proteom angewendet, quantifiziert wir mehr als 2.000 Proteine in 2-fach Ebenen für replizieren Kulturen wachsen auf Glukose (4A), gemessen 94% Proteinen. Protein falten Änderungen für doppelte Paare von Kulturen (Glukose gegenüber Cellulose) wurden ebenfalls stark korreliert (r 2 = 0,82), (4B). S. Vergleiche cerevisiae (Abbildung 3) sind von einer einzigen Kultur und damit zeigen, technische Reproduzierbarkeit der redi basierten quantitativen Proteomik. C phytofermentans Messungen (4A, B) vergleichen Kulturen replizieren, so Expressionsunterschiede stellen sowohl Messfehler und biologischen Unterschiede zwischen den Kulturen. Zusammen bilden diese Erfahrungengen unterstützt, dass Redi Proteomik ist eine genaue und reproduzierbare Methode zur Protein-Expression Unterschiede zwischen komplexen Proben zu quantifizieren.
Abbildung 1. Reduktive Dimethylierung von Peptiden mit schweren und leichten Reagenzien an freien Aminen dimethylate. Gleiches Peptid mit schweren Abhängigkeit der Licht Reagenzien markiert hat eine 6,0377 Da Massenverschiebung pro freie Amin. Das hier gezeigte Peptid sowohl am N-Terminus und an einem Lysin-Seitenkette bezeichnet. Bild aus Referenz 11 angepasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Überblick Protokoll für die quantitative Proteomik durch reduktive Dimethylierung. Rote Zahlen über Pfeile entsprechen im Protokoll beschriebenen Schritte. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Auswertung der redi Kennzeichnung mit Saccharomyces cerevisiae Ganzzelllysaten. 10L, 1H: 5L, 1H: 2L, 1H: 1L, 2H: 1L, 5H: Proben aus einer Kultur wurden entweder mit schweren (H) und leichten (L) Reagenzien, in verschiedenen Verhältnissen gemischt (1H markiert 1L, und 10H: 1 l) und Protein Unterschiede zwischen H-und L-Proben wurden wie log 2 Median MS1 Peakflächenverhältnisse (log 2 H / L-Verhältnis) quantifiziert. Die R 2-Wert von einer linearen Trendlinie durch alle DatenPunkte betrug 0,96 (schwarze Linie); die Pearson-Korrelation betrug 0,98. Vertrauen Grenzen (rote Linien) zeigen die absolute senkrechte Abstand von der Trendlinie, in dem 95% der Datenpunkte wurden für jede Probe gefunden. Bild aus Referenz 12 angepasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Quantifizierung der redi-markierten Proteinen aus Clostridium phytofermentans wachsenden Kulturen der verschiedenen Kohlenstoffquellen. A) Protein-Expression in einer Glucose-Kultur im Verhältnis zu einem Replikat Glukose Kultur, einer Kultur Hemicellulose und Cellulose Kultur. Der Anteil der Proteine in doppelten Mengen exprimiert: Glucose-Glucose (94%), Glucose-Hemicellulose (80%) und glucosE-Cellulose (49%). B) Falten Veränderungen in der Proteinexpression für Glucose gegenüber Cellulose Kulturen stark korreliert (r 2 = 0,82) für doppelte Paare von Kulturen. Bilder aus Referenz 12 angepasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Einige Punkte machen stabilen Isotopenmarkierung von Peptiden mittels reduktiven Dimethylierung (Redi Kennzeichnung) eine attraktive Methode für die quantitative Proteomik: kostengünstige Markierungsreagenzien (Reagenzien kostet weniger als $ 1 pro Probe), schnelle Reaktionsgeschwindigkeit (~ 10 min), das Fehlen von Nebenprodukten, hohe Reproduzierbarkeit (Fig. 3, 4), stabiler Reaktionsprodukte, die Fähigkeit, eine beliebige Protease verwendet, und hohe Ionisierungseffizienz von markierten Peptiden. Chemische Markierung von REDi ist auch vorteilhaft in Bezug auf die metabolische Markierung, da es nicht Stämme oder Zellinien, die mit spezifischen Aminosäure Auxotrophien oder Wachstum auf einem synthetischen Medium erfordert. Als solches kann REDi fast jede Art von Proteinprobe einschließlich neuartiger Mikroorganismen 12, für die einige Mutantenstämme sind 13 und menschlichen Stammzellen 14, 15 unter anderem angewendet werden.
Eine Einschränkung der redi Kennzeichnung ist eine niedrigere Fähigkeit, Proben relativ zu multiplexen otihr Verfahren wie isobaren Markierungen (zB iTRAQ oder TMT), für welche derzeit bis zu 8 Proben können gleichzeitig 16 quantifiziert. Die Methode, die wir hier beschreiben, ermöglicht die quantitative Vergleich von zwei unterschiedlich markierten Proben. Weitere Isotopen Kombinationen von Formaldehyd und Cyanoborhydrid kann verwendet werden, um Etiketten 3, die um mindestens 4 unterscheiden Da 17 und REDi Kennzeichnung kürzlich bis 5 gemultiplexten Proben 18 verlängert produzieren. Eine weitere Herausforderung ist, dass die Kennzeichnung Redi deuterierten Peptide eluieren etwas vor Licht diejenigen bei der Verwendung von Reversed-Phase Chromatographie. Um sich für dieses "Deuterium-Effekt" zu kontrollieren, sollte Peptidquantifizierung immer auf der gesamten extrahiert Ionenchromatogramm (MS1 Peakfläche) anstelle von Intensitäten von einer Abtastung basieren.
Die hier beschriebene Redi Proteomik-Protokoll enthält zahlreiche Verbesserungen 11,15,17 seit der ersten Beschreibung der Reduktion Dimethyl der Kennzeichnungvon Peptiden für die Massenspektrometrie 5. Wir beschrieben ein "on-column"-Markierungsverfahren, damit höhere Peptidmengen und die Markierungseffizienz kann vor der Probenmischung überprüft werden, sondern "in Lösung" und "online" Markierungsmethoden gibt es ebenfalls 19. Zusätzlich zur Quantifizierung Proteom ist REDi Kennzeichnung, die für die Bestimmung Isoform 20 aufgebracht und kann mit anderen Verfahren kombiniert werden, um post-translationale Modifikationen wie Phosphorylierung 11,18 Acetylierung 21 und 22 Glykosylierung zu analysieren. Aufgrund seiner Vielseitigkeit und preiswert, quantitative Chemie, Redi Kennzeichnung zunehmend quantitative Proteomik in neue und aufregende Weise angewendet werden.
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Disclosures
Die Autoren erklären, keine konkurrierenden finanziellen Interessen oder andere Interessenkonflikte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | T9159 | protein precipitation |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 650501 | protein precipitation |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | 71736 | denature, reduce protein |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | denature, reduce protein |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43816 | denature, reduce, alkylate protein |
| Protease Inhibitor Complete Mini Cocktail | Roche | 4693124001 | denature, reduce protein |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I6125 | alkylate protein |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7523 | resuspend, extract, label protein |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | resuspend protein |
| Lysyl Endoprotease | Wako Chemicals | 129-02541 | protein digestion |
| Sequencing grade trypsin | Promega | V5111 | protein digestion |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | protein digestion |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 299537 | Reversed-phase peptide extraction |
| tC18 Sep-Pak C18 cartridges | Waters | WAT054960 | Reversed-phase peptide extraction |
| Extraction manifold | Waters | WAT200609 | Reversed-phase peptide extraction |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 14261 | various |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | “light” peptide labeling |
| Cyanoborohydride | Sigma-Aldrich | 71435 | “light” peptide labeling |
| Deuterated formaldehyde | Sigma-Aldrich | 492620 | “heavy” peptide labeling |
| Sodium cyanoborodeuteride | CDN isotopes | D-1797 | “heavy” peptide labeling |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | peptide labeling |
| C18-HPLC column (4.6 x 250 mm, 5 µm particle size) | Agilent | 770450-902 | basic pH reversed-phase chromatography |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | 399388 | various |
| C18 Empore Disks | 3M | 14-386-3 | STAGE tips |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 494437 | STAGE tips |
References
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