Summary
ショウジョウバエの組織は、しばしば、細胞型の不均一な混合物を含有する。特定の組織の特定の細胞型における遺伝子発現を調べるために、核が遺伝的にタグ付けし、続いて親和性に基づくアプローチを用いて単離することができる。単離された核は、遺伝子発現解析およびクロマチン免疫沈降などの下流用途に使用することができる。
Abstract
キイロショウジョウバエ胚および幼虫の組織はしばしば、これらの組織における遺伝子発現の分析を複雑にすることができる細胞型の高度に不均一な混合物を含有する。従って、 ショウジョウバエ組織からの細胞特異的遺伝子発現プロファイルを分析するために、高純度のような転写プロファイリングおよびクロマチン免疫沈降などの下流のアプリケーションに十分な収率で特定の細胞型を単離することが必要であり得る。しかしながら、これらの組織における特定の細胞型の稀な集団と結合し、中枢神経系のような組織内の不規則な細胞形態は、例えば、レーザーマイクロダイセクションおよび蛍光活性化細胞選別（FACS）などの細胞単離の伝統的な方法のための課題を提起することができ。ここで、タグ付けされた核の親和性に基づく分離ではなく、全細胞を用いた細胞特異的遺伝子発現プロファイルを特徴付けるための別のアプローチは、記載されている。特定のC言語での核興味のあるエル·タイプは、遺伝的にGal4/UASバイナリー発現系を用いて核膜に局在するEGFPタグで標識する。これらのEGFPタグ付き核磁気ビーズに結合されるGFPに対する抗体を用いて単離することができる。このプロトコルで説明されたアプローチは、これらの細胞型には、全細胞集団の2％未満を含む場合であっても、高純度でかつ発現分析のために十分なレベルで、ショウジョウバエの幼虫中枢神経系の特定の細胞型からの核の一貫した分離を可能にする組織。このアプローチは、 ショウジョウバエ胚および特定のGal4のドライバを使用して、幼虫の多種多様な細胞型から核を単離するために使用することができ、FACSまたはレーザーマイクロダイセクションには適していない細胞型から核を単離するために有用であり得る。
Introduction
中枢神経系のようなショウジョウバエ組織は細胞型の複雑な混合物を含有する。従って、 ショウジョウバエ組織からの細胞特異的遺伝子発現プロファイルを分析するために、それは下流の適用を可能にするのに十分な量の特異的細胞の均質な集団を単離することがまず必要である。無傷の組織から細胞を単離するための方法は、全細胞のレーザーマイクロダイセクション、および蛍光活性化細胞選別（FACS）が挙げられる。 FACS 1-3遺伝子発現プロファイリングおよびクロマチンのためのショウジョウバエ胚から線虫（Caenorhabditis elegans）由来の細胞および核を単離するために使用されてきたが、FACS、レーザーマイクロダイセクションは、高度に相互に混合細胞型を含むかを有する細胞を含有する組織において正常に行うことが困難であることができるニューロンなどの不規則な形態、。この困難を克服するために、核ではなく、細胞が特定の細胞型から単離し、その後の世代のために使用することができる電子発現プロファイリング。重要なことに、核RNA試料を用いたマイクロアレイベースmRNA発現分析は、総RNA 4,5を用いて行わとほぼ同等の結果を示している。また、核のRNAを用いた遺伝子発現解析は、正常C.含む複数の生物における遺伝子発現を研究するために使用されている線虫 、 シロイヌナズナ 、 ショウジョウバエ、およびヒト4、5 2、3。
いくつかのアプローチが最近、遺伝子発現解析及び/又はクロマチン免疫沈降するのに適しているショウジョウバエの組織からの標識された核の特定の集団を単離するために記載されている。免疫沈降（BITS-チップ）方式のための組織特異的なクロマチンのバッチ分離が核に局在するGFP 2の細胞型特異的発現に基づいて固定された核を分離するために、FACSを利用しています。このアプローチは、SUでしたccessfully ショウジョウバエの胚の中胚葉2から単離された核のクロマチン免疫沈降を用いて、ヒストン修飾と転写因子の分布を解析するために使用される。しかし、FACSベースのアプローチは、ダウンストリームアプリケーションのための適切な数値を得るために必要な増加したソート時間に混合された集団のわずかな割合を構成標識核を単離するにはあまり適切であり得る。これらの制限を克服するために、いくつかのグループが、特定の細胞型に特異的なエピトープで標識された核を精製するために親和性に基づく分離技術を利用している。 シロイヌナズナ6,7における使用のために開発された特定の細胞型（INTACT）メソッドのタグ付け核の単離は、最近、 ショウジョウバエ 8での使用に適合されている。この方法では、in vivoでのビオチン化のための基質である核エンベロープ融合タンパク質であるcoexpres特定の細胞型において大腸菌ビオチンリガーゼBirAを用いてセッド。ビオチン標識された核は、続いてストレプトアビジン - ベースの親和性単離を用いて混合集団から精製することができる。このアプローチを用いて、核は正常核エンベロープ融合タンパク質は中胚葉特異的エンハンサー8の制御下で発現させたショウジョウバエ胚の中胚葉に標識し、単離した。著者らはまた、Gal4の調節配列、UAS 9の制御下で任意の細胞型で発現させることができる核エンベロープ融合タンパク質を生成した。このアプローチは、急速に混合集団から標識核のサブセットを単離することができるが、3つの別々のトランスジェニック構築物を必要とし、したがって特定の遺伝子の用途には不向きであってもよい。最近、このアプローチは、核膜の内膜に局在SUN（S AD1及びUN-C 84）ドメイン含有タンパク質を用いてタグ付けされた記載されている蛍光タンパク質とGal4/UASシステム10の制御下で発現。核は、核膜の外膜を除去するために非イオン性界面活性剤の存在下で単離され、抗GFP抗体に結合した磁気ビーズを用いてアフィニティー精製した。このアプローチは、正常ショウジョウバエ 10の成体脳内の特定のニューロンのサブタイプからの標識された核の小集団を単離するために使用した。
ここで、 ショウジョウバエ幼虫の組織からの細胞の混合集団から標識核を単離するためのプロトコルが記載されている。この方法は、独立して開発されたが、ヘンリーらによって記載されたアプローチに似ていた。10まず、核が混合集団からのタグ付けされた核のその後の単離を容易にするためにのみキイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）における特定の細胞型で発現される蛍光タグで標識した親和性ベースのアプローチを使用して。核を標識するために、KASH（Kの larsicht / NC-1 / Sの -インの時間 omology）ドメインを利用した。 KASHドメインは、核周囲の空間11内に日ドメイン含有タンパク質との相互作用を介して部分的には、核膜の外膜に局在する膜貫通ドメインである。そのN末端 ドメインは、細胞質12-14におけるアクチンまたは微小管などの細胞骨格タンパク質と相互作用しながら、ショウジョウバエ MSP-300およびKlarsichtなどのタンパク質のC-末端KASHドメインは、外核膜にこれらのタンパク質を固定する。構築物は、ここで、ショウジョウバエ MSP-300のKASHドメインはのpUASTベクターのattB-15、16でGal4の調節配列、UASの制御下で、EGFPのC末端に融合された生成された。ラーゼPhiC31の部位特異的組込みを使用して、トランスジェニックハエをUAS-EGFP :: MSP-300 KASH導入遺伝子が染色体上attP2遺伝子座に挿入された生成された3L 17。 UAS-EGFP :: MSP-300 KASHハエは、目的の細胞型における外顆粒膜上の標的EGFP発現をもたらす、特定の細胞型においてGal4ドライバーを発現するハエと交配させることができる。標識された核は、磁気ビーズに結合されたGFPに対する抗体を用いて、混合細胞集団から精製することができる。 EGFPタグは、外核膜の細胞質側に局在し、したがって、抗体にアクセス可能であるため、このアプローチでは、非イオン性界面活性剤の使用が必要とされない。
プロトコルは、以下に説明/単離するショウジョウバエ幼虫の組織における特定の細胞型からのEGFP-標識核を富化、単離された核の純度および収率を定量化するため、および定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（qRTに適した核内RNAを抽出するために使用することができる-PCR）遺伝子発現解析。 TISSU除く分離と核のアフィニティー精製（電子郭清）1時間未満で行うことができる。結果は、グリア細胞核は正常幼虫の光学ローブと眼成虫盤から単離し、その後の遺伝子発現分析のために使用することができることを示して提示される。なお、この方法は、標的細胞は、総人口の5％未満を構成する胚および幼虫の組織からの標識された核の分離/富化のために有用であろうことが予想される。この研究で生成されたすべてのショウジョウバエの株式やプラスミドは要望に応じて作成者から入手できます。
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Protocol
1。 EGFP :: KASH ショウジョウバエの発生と特性評価
- クロスGal4ドライバーは、MSP-300 KASHが飛ぶ:: UAS-EGFPを運行する。代わりに、Gal4ドライバーとUAS-EGFP :: MSP-300 KASH導入遺伝子の両方を運ぶ組換えハエは、標準的な遺伝子技術を用いて作製することができる。多数の子孫が必要な場合には、この第二のアプローチは、有利である。
- 標準顕微鏡技術を用いて、EGFP :: KASHマーカーの発現を特徴づける。注：EGFP発現は、全体又は幼虫において、解剖固定ショウジョウバエ組織において標準的な顕微鏡技術によって観察することができ、抗体の使用を必要としない。
- EGFPの発現パターンを決定::蛍光解剖顕微鏡下で、生物全体におけるKASHマーカーは（材料のPDFを参照してください）。注： 図1に示すレポGAL4ドライバー 、展示Nを含む多くのGal4ドライバーを、このような唾液腺などの他の幼虫組織における発現のonspecificパターン（結果を参照）。
- 共焦点顕微鏡を用いて関心を解剖組織におけるEGFP :: KASH発現パターンを分析します。
- EGFPの局在:: DNAにKASHタグに関連を可視化するために0.1μg/ mlの最終濃度DAPIを使用して、最終的な4パーセントの濃度、および耐汚染DNAでホルムアルデヒドを使用して目的の組織を固定します。
- 40倍/ 1.30油浸対物レンズまたは目的の組織の大きさに応じて20倍/ 0.75油浸対物レンズ、のいずれかを使用して画像を取得する。次の励起/発光条件は、画像取得のために使用することができます：408 nm/425-475ナノメートル（DAPI）; 488ナノメートル/ 525から550ナノメートル（GFP）。
2。 ショウジョウバエ幼虫の組織から核を分離する
- 幼虫組織切開とその後の核の分離のための機器を準備します。あることに注意してください全体絨毛膜を除去した胚はまた、所望であれば、出発材料として使用することができる。それは、目的の細胞型は、成虫盤のような特定の組織中に存在している場合ではなく、全体の幼虫よりも部分的に切開し、幼虫の組織を使用することをお勧めします。これは非特異的結合が減少し、また、非標的細胞におけるいくつかのGal4ドライバーの発現によって引き起こされる可能性の問題を排除します。
- 鋭い鉗子二対（材料PDFを参照）、1つシリコーン処理9ウェルガラス板を作製し（材料PDF参照）、PBT（1×PBS、pH7.4中、0.1％のTween-20）。
- 磁気ビーズにGFP抗体を丈夫に製本する。このステップは、解剖を開始する前に起動する必要があります。 1.5ミリリットルチューブ内で、（2.5のMgCl 2 1X PBS、pH7.4）で洗浄緩衝液400μlに（ロシュは、資料のPDFを参照してください）（材料PDFファイルを参照して、Invitrogen）を磁気ビーズを10μlを加え、GFP抗体2μgの。必要に応じて使用したビーズと抗体の量は、サンプリング中の標的の量に基づいて最適化することができるPLEおよびビーズへの抗体の結合親和性。
- 室温で少なくとも30分間、回転させながら、ビーズおよび抗体をインキュベートする。
- 磁気ラック内のビーズと抗体を含む1.5 mlチューブを配置（材料のPDFを参照）、ビーズは約1〜2分間磁気的に結合することができます。非結合抗体を含む上清を除去し、1ミリリットルピペットを使用してバッファを洗う。ビーズは、磁石に隣接する側の1.5ミリリットルチューブの壁に結合されたままになります。
- セクション2.1.4で説明したように毎回洗浄緩衝液の1ミリリットルで二回ビーズを洗浄します。磁気ラックから1.5ミリリットルチューブを外し、ビーズをミックスし、各洗浄工程の間にバッファーを洗浄するために簡単に反転させる。
- ステップ2.7に進んで準備ができるまで、洗浄緩衝液中の抗体結合ビーズを格納します。ビーズは、プロトコルのどの段階で完全に乾燥させてはならない。
- PBTおよび転送中の幼虫組織を分析する組織を切開し9ウェルディッシュの1ウェル。一般的に、100 3齢幼虫からオプティックローブと目成虫原基の解剖は、核単離後、下流の遺伝子発現解析のために十分な材料を提供しています。
- 1.5mlチューブに核抽出緩衝液中で単離された組織を洗い流す（10mMのKClを10mMのHEPES-KOH、pH7.5の;、2.5のMgCl 2）。新鮮な核抽出緩衝液1ミリリットルが含まれている1ミリリットルダウンスホモジナイザー（資料PDFを参照）、氷上に孤立幼虫組織を転送します。氷上で5分間インキュベートする。これは、RNAが核単離後、抽出される場合、プロテアーゼ阻害剤を添加する必要はない。
- 緩い乳棒で20ストロークで組織を破壊し、その後、細胞が膨潤することを可能にするために10分間氷上でサンプルをインキュベートする。タイト乳棒で15ストロークを用いて細胞から核を抽出します。ルーズとタイト杵とストロークの数は、異なる組織および細胞型のために最適化される必要がある;過剰均質化をもたらすことができる不十分な均質化が組織から全ての核を抽出しませんが、核をせん断し。
- 核の均質化緩衝液であらかじめ浸漬されている40ミクロンの細孔サイズのストレーナー（材料のPDFを参照）を介して、核および細胞破片が含まれているホモジネートをフィルタリング。新しいチューブでフィルタリングホモジネートを収集します。
- 核収率、核の完全性を決定するために、その後の分析のための事前の分離サンプルを採取し、単離を核に先立って標的遺伝子の転写レベルを決定する。
- ピペットを使用して新しい1.5 mlチューブに移すフィルタリングホモジネート50μlの。これは、 予備分離試料である。 Trizol試薬を500μlを追加し、その後のRNA分離（ステップ3.1）、-20℃で、混合する反転、店舗（材料をPDF、注意を参照のこと）。
- 新しい1.5 mlチューブに移すフィルタリングホモジネート20μlの。
- 0.1μg/ mlのの最終濃度にDAPIを追加し、株式会社10分間氷上でubateサンプル。
- ポリリジンコートされたカバーガラスに、DAPI染色された核を転送し、顕微鏡スライド上に配置します。明確なマニキュアを使用してカバースリップをシール。
- 核の完全性を確認し、蛍光顕微鏡を用いて目的のGFPタグ核の存在。注：核を修正するために、またはこれらのスライドは、（24時間以内）に調製後、合理的に迅速に分析している場合は、GFPを染色する必要はありません。
- 新しい1.5 mlチューブに移すフィルタリングホモジネート10μlの洗浄緩衝液90μlの（1×PBS、pH7.4の、2.5のMgCl 2）を追加します。 0.1μgの/ mlの最終濃度にDAPIを追加し、氷上で10分間インキュベートする。 10倍の空気目標の下で落射蛍光を使用して、DAPI陽性核をカウントする血球計数器を用いて事前に分離サンプル中の核収量を決定します。
- 磁気ラックに（セクション2.1.6で調製した）抗体結合ビーズを含む1.5ミリリットルチューブを配置し、およびセクション2.1.4に記載したように磁気ビーズは、少なくとも2分間磁石に結合させる。 1ミリリットルピペットを用いて抗体結合ビーズから洗浄バッファーを削除し、1ミリリットルピペットを用いて、1.5mlのチューブにステップ2.5から濾過ホモジネートを追加します。
- 穏やかに混合するためにチューブを数回転倒し、転倒攪拌しながら30分間、4℃でインキュベートする。可能な場合、これらは核の凝集を引き起こすことができるため、チューブ内の気泡を避けてください。
- 磁気ラックに抗体結合ビーズとホモジネートを含む1.5 mlチューブを配置し、セクション2.1.4で説明したように磁気ビーズは、少なくとも2分間磁石に結合することを可能にする。 1ミリリットルピペットを用いて、結合していない核画分を含むホモジネートを削除します。
- 毎回洗浄緩衝液1mlでサンプル3回洗浄します。説明したようにビーズ、結合された核を含む1.5 mlチューブを外し、ラックからバッファを洗って、数回転倒混和し、その後、磁気ラックにチューブを配置ステップ2.9で、1mlのピペットを用いて上清を除去します。
- ターゲット核にバインドする際、ビーズに洗浄緩衝液150μLを加える。これが後のアイソレーションサンプルです。顕微鏡分析とその後のRNA抽出のためのサンプルを準備します。
- 新しい1.5 mlチューブおよびDAPIで染色への転送後、分離サンプルを20μlとセクション2.6.2で説明したように分析する。 GFP + / DAPI +及び単離後試料中の濃縮されたGFP +核の純度を決定するために、磁性ビーズにより捕捉GFP-/DAPI +核を数える。
- その後のRNA単離（ステップ3.1）のために、 後の分離サンプルの残りにTrizol試薬の1ミリリットルを加える混合する反転し、-20℃で保存。注：必要に応じて、トリゾールのサンプルは-20℃で数週間保存することができますなお、Trizol試薬を用いてRNA抽出前に磁気ビーズから核を溶出するために必要ではないのbecausEビーズは、その後のRNA分離に干渉しない。
3。幼虫の組織から単離された核における転写レベルを決定する
- 以下のように変更して（材料のPDFを参照）トリゾールベースのRNA抽出に記載されている標準的なプロトコルを使用してのセクション2.6.1および2.11.2で作成前の分離および単離後のサンプルからRNAを単離する。
- RNAペレットの沈殿後、ペレットにRNaseフリー水19.2μLとRNASecure試薬0.8μL（材料のPDFを参照）を追加し、RNA分解酵素を不活性化する20分間60℃でインキュベートする。
- 製造業者のプロトコルに従ってQubitR 2.0蛍光光度計を使用して、このような量子ビットのRNAアッセイキットなどの蛍光-RNA結合色素（原材料のPDFを参照）RNA濃度を決定します。
- 例えばEpiScrとして増幅し、逆転写酵素を用いてcDNAを合成IPT製造者の指示に従って転写酵素キットとオリゴdTプライマーを逆にします。注意：一般的に、RNAの50から100 ngのは、複数の遺伝子発現解析を実行するのに十分なのcDNAを生成します。 予め単離およびRNA 単離後の当量は、cDNAを作製するために使用されるべきである。
- 前のリアルタイム定量PCR（定量PCR）分析は、この10倍に希釈するために20μlのcDNAサンプルにヌクレアーゼフリー水180μlのを追加します。未希釈のcDNAサンプルが定量PCRを阻害することができるので、この希釈は、重要なステップである。
- ポリメラーゼおよびdNTP、4ピコモル前進のそれぞれと定量PCRマスターミックスを調製し、リバースプライマー、20μlの最終反応容量を滅菌水で作りました。
- 目的の細胞型で発現されると予想される遺伝子を標的とし、組織が収集された発達段階にするために定量PCRプライマーを設計する。イントロンにまたがるための設計プライマー可能ならば、その結果、ゲノムおよびcDNAのPCR産物を区別することができる。注：標的細胞型の遺伝子発現プロファイルは知られていない場合、タグ付き核集団において特異的に発現されるべきでのeGFPに対するプライマーは、特定の細胞型および組織（ 表1）のためのプロトコルを最適化するために使用することができる。
- 全組織から調製したcDNAの希釈系列と比較することによって、事前分離と単離後の試料中の目的の各遺伝子の相対的な転写レベルを決定します。標的遺伝子の転写物レベルは、例えば、RPL32（または好ましくはいくつかの参照遺伝子）等の参照遺伝子に対して正規化されるべきである。
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Representative Results
レポGAL4ドライバー （ブルーミントンストック番号7415）は、具体的な開発18の複数の段階でショウジョウバエ神経系のグリア細胞で発現されている。ハエを安定的に標準的な遺伝子技術を使用してレポGAL4ドライバの制御下に、UAS-EGFP :: MSP-300 KASHを発現することを生成した。これらのハエにおけるEGFP :: KASH導入遺伝子の発現パターンを特徴づけるために、3齢幼虫から解剖視葉および眼成虫盤におけるGFP発現のパターンは、共焦点顕微鏡を用いて調べた。解剖した組織は、光受容体の軸索（mAb24B10を標識したDNAとα-カオプチン19をマークし、DAPIで対比染色した ）材料のPDFを参照してください。 図1（a）は、 レポGAL4駆動EGFPを:: KASH導入遺伝子が予想発現パターンの光学部品のローブと目成虫原基にグリアに発現していることを示している。高倍率の下で、EGFP発現は、EGFP :: KASHタグ（ 図1B）の核エンベロープ局在と一致DAPI陽性DNAを囲む円形パターンで観察される。 EGFP発現は、GFPに対する抗体を用いてシグナル増幅を必要とせずに、固定および非固定両方の組織で検出することができ、GFPに対する抗体は、 図1及び図2に示す画像においてEGFP :: KASH発現を可視化するために使用されなかった。 EGFP :: KASH導入遺伝子は、ショウジョウバエの幼虫のどの他の組織に非特異的に発現しているかどうかを判断するには、GFPの発現は、解剖顕微鏡、蛍光を用いて全3齢幼虫で調べた。注目すべきことに、EGFPの非特異的な表現は:: KASH導入遺伝子は3齢幼虫の唾液腺において高レベルで観察された。これは、 レポ-GAL4ドライバーは、開発の幼虫期におけるグリア細胞以外の細胞型において活性を有することを示す。このため、特にGLIを分離するら核、3齢幼虫から視葉と目成虫原基前均質化と親和性分離に解剖を用いて単離した。
光学ローブと眼から得たホモジネートからこのプロトコルは、ショウジョウバエの組織からの核の抽出に適していることを確認し、所定の組織に存在するタグ付けされた核の割合を推定するために、 事前に分離サンプル（セクション2.6.2） レポGAL4の成虫盤、UAS-EGFP :: MSP-300 KASH 3齢幼虫を調べた。 図2（a）は、共焦点顕微鏡を用いて得られた予備分離サンプルの代表画像が表示されます。この画像では、核の存在は、DAPI-陽性事象によって示される。まばらに散在するGFP陽性、DAPI-陽性グリア細胞の核の数が少ないにも観察される。我々は、GFP陽性核は、この内の全核の人口の2％未満を占めていることを推定サンプル（ 図2A）。セクション2.6.3（ 表2）に記載のように100幼虫から解剖し視葉および眼成虫由来の全核の収率は、 予備分離試料について決定した。約2％は、GFP陽性であったそのうちの0.8と1.2×10 7核の間に含まれる100解剖し視葉と目成虫からの典型的な前の分離サンプル。 図2Bは、定義された領域でのDAPI陽性核の代表画像を示している血球計数器の。核が無傷であることに注意して（ 図2Aおよび2B）プロトコルで使用される抽出条件の下で、一貫した円形の形状を維持する。
このプロトコルは、隔離、および/または高度に混合された細胞集団が含まれている組織からの標識核の特定の集団を濃縮することができるかどうかを判断するには、α-GFP抗体被覆磁気ビーズを使用でしたタグ付けされた視神経ローブと100 レポGAL4のアイ成虫原基から得たホモジネートからの核、UAS-EGFP :: MSP-300 KASH 3齢幼虫を分離するD。 図2Cおよび2Dにおいて、EGFP :: KASHはα-GFPコーティングした磁気ビーズに結合グリア細胞の核をタグ付けし、磁気分離後 、次の単離サンプル （セクション2.11.1）において観察されていることがわかる。磁気ビーズは、GFPチャネルでいくつかの自己蛍光を示すが、これらは容易にそれらの小さいサイズ（核について約5μm対磁性ビーズ2.8ミクロン）およびDAPI染色の欠如によってビーズに結合した核から区別することができる。 GFP + / DAPI +核を単離後のサンプル中のDAPI陽性事象の95％以上を占めています。このように、ターゲットが核の人口をタグ付けされた、高度に事前に分離する単離後のサンプル中の濃縮されているサンプル。 単離後のサンプル·ショー強い核エンベロープローカライズされたGFP蛍光、及び中の核の大部分は、通常はビーズに囲まれています。しかしながら、タグなしの核の数が少ないにも、このサンプル中に存在する可能性がある。従って、 図2Cおよび図3の遺伝子発現解析をもたらす（下記参照）が、ターゲットが、グリア細胞の核集団は高度に濃縮されたタグがあることを示すが、他のいくつかの非特異的な細胞タイプからのいくつかの核はまた、試料中に存在する可能性除外することはできません。これは、ユーザーがターゲット核の人口の濃縮を最大化するために、その特定の細胞型と目的の組織のために、このプロトコルを最適化し、非特異的結合核を排除することをお勧めします。特に、抗体およびビーズに材料に対して出発の比率は、標的核の最適な濃縮のために重要である可能性が高い。このため、合計の範囲我々の典型的な予備分離試料中に存在する核の数を表2に示す。 事前の分離試料中に存在する全核数字、視葉と目成虫原基の混合集団におけるグリア細胞の推定割合に基づいて、 後の分離サンプル中の最大の核収量は1.6の間であることが期待されていた×10 5と2.4×10 5の核。しかし、ステップ2.6.3で説明したように、核の収量を決定するために血球計数器を用いて、 単離後のサンプルで得られた実際の核収率は1.3×10 4〜2.7×10 4核の間であった。 単離後試料中に存在するビーズは、血球計数器の正確なローディングに影響を与えると思われるので、これらの核の収率は非常に粗い推定を表す。いくつかのGFP陽性核はSのそれではないすべてのGFP陽性核を示して、結合していないホモジネートで観察される効率的に、このプロトコルで使用される条件の下でビーズに十分に結合する。逐次分離段階を結合または実行時間を増加させることは潜在的に、この収率を高めることができるが、これは、RNAの純度および完全性の両方を犠牲になるかもしれない。このプロトコルに記載されている条件を用いて、RNAの十分な量は、定量RT-PCR（ 表2）による下流の遺伝子発現分析のために単離後の試料を得ることができる。したがって、このプロトコルは、迅速かつ厳格細胞の混合集団を含有する組織から標的核を単離することができる。また、具体的には所与の集団中の細胞のわずかな割合は、5％未満を構成するターゲット核を単離することができる。
さらに、 単離後のサンプルは、高度に目標グリア原子核集団について濃縮されていることを事前に分離して、4つの異なる遺伝子についての転写物のレベルを確認するために、 単離後のサンプルは、RT-qPCRにより比較した。 ELAV、nrv2及びeGFPの転写レベルは、2つのサンプルで決定され、グリア細胞および周囲の中枢神経系（ 図3）に等価なレベルで発現される参照遺伝子、RPL32に対して標準化した。 単離後試料における倍差が1に設定され、事前の分離サンプルに対して示されている。 図3では、 単離後の試料は、 予め分離サンプルに、ニューロン特異的遺伝子ELAVに対して有意に低い転写物レベルを示す。これは神経細胞から核を単離後の試料において過小表現されていることを示します。これとは対照的に、グリアに富むnrv2遺伝子 10とのeGFPの両方の高い転写レベルは、 ポストイソラに存在している事前分離サンプルと比較したTiONサンプル。この結果は、 後のアイソレーションサンプルは、高度にターゲットグリア原子核集団について濃縮されていることを示しています。これは、このプロトコルにおいて測定転写レベルは、核転写物を表していることに留意することが重要であるので、活性な転写のレベルではなく、定常状態のmRNAを示す可能性がある。 レポの再現可能な発現は、内因性レポ遺伝子の活発な転写が終わった後のレポGAL4ドライバによって表現さGal4タンパク質が持続可能性を示唆し、私たちの前の分離または単離後のサンプルのいずれにおいても検出されなかった。これはTWIプロモーターを用いて標識核がおそらくタンパク質の安定性8に対する転写の発生のタイミングの違いにより、TWI転写産物の濃縮レベルを表示しないで、他の研究の結果と一致している。ターク一緒に備わり、これらの結果は、記載されたプロトコルが正常に使用できることを実証している高度に細胞の混合集団を含有する組織から標的核を豊かにし、単離された核は、遺伝子発現分析に適していること。
図1。 レポGAL4の発現パターンは、UAS-EGFP :: MSP-300 KASHラインを飛ばす。（A）3齢幼虫では、 レポGAL4視神経でグリア細胞におけるUAS-EGFP :: MSP-300 KASH導入遺伝子の発現を駆動する葉、眼柄（OS）およびアイ成虫原基（ED）。グリア細胞の核エンベロープは、EGFP :: KASH（緑）で標識されている。 R1 - R8光受容体細胞の軸索は、比較のために、α-カオプチン（mAB24B10、赤）で標識し、DNAが安定であるアールDAPI（紫）とINED。 GFP標識グリア核（矢印でマークされた）視葉内ラミナ（LA）に沿って表示されます。スケールバーは50μm。 （B）は 、EGFP :: KASHが含まれている光ファイバ葉のラミナ神経節の高倍率画像は、グリア細胞核をラベル。スケールバーは50μm。共焦点画像は、Aのいずれかを用いて得た 40X / 1.30油またはA 20×/ 0.75油浸対物レンズ、および408 nmのnm/425-475（DAPI）の励起/発光波長を用いて、488 nmのnm/525-550（GFP）、561 nmのnm/595-620（アレクサ5,6,8 ）。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図2。核の特性評価「事前の分離」と「ポスト·アイソレーション」のサンプル。（A）の代表画像中からのレポGAL4、UAS-EGFP :: MSP-300 KASH 事前分離サンプルは20 / 0.75油浸対物レンズと標準のXを使用して分析共焦点顕微鏡。 DNAはDAPI（青）で染色し、EGFP :: KASHは、グリア核（矢印でマークされた）緑で表示されているタグ付けされている。スケールバーは50μm。 （B）×10エア客観的かつ標準的なエピ蛍光顕微鏡を用いて、血球計数器の事前の分離サンプルから、DAPI染色された核の代表画像。血球計数器グリッドは薄いグレーで表示されます。 GFP蛍光を落射蛍光顕微鏡で、この目標の下で見えなかったとしてだけDAPI陽性核は、このイメージに示す。 （C） レポGAL4、UAS-EGFP :: MSP-300 KASH 後の分離サンプルから代表画像パネルAに記載のように分析した。孤立EGFP :: KASHは、DAPI陽性に染色（矢印でマークされた）グリア核をタグ付けされ、そしてビーズに囲まれて、GFPチャネルで低レベルでどの自家蛍光。スケールバーは50μm。 （D）は 、典型的な孤立EGFPの高倍率画像:: KASHは、ビーズに囲まれた（矢印でマークされている）のグリア核をタグ付けされた。スケールバー、5μmのは。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図3。 「事前の分離」と「ポスト·アイソレーション」のサンプルからの代表的な定量RT-PCRのデータ 。標的遺伝子の転写レベルは、 プレISOLの定量RT-PCRによって決定したレポGAL4、UAS-EGFP :: MSP-300 KASH視神経葉と目成虫から得ATIONとポストの分離サンプル。すべての転写産物レベルは、RPL32の転写物レベルに対して正規化され、各遺伝子標的の事前分離試料は1にセットされる。 1の生物学的実験からの代表的な結果を以下の遺伝子について示されている：ELAV、nrv2及びeGFP。
| 遺伝子 | プライマー配列（5'-3 '） | PCR産物のサイズ（bp）の |
| eGFPを | GAGGGATACGTGCAGGAGAG | 102 |
| GATCCTGTTGACGAGGGTGT | ||
| nrv2 | GGCTGGTTGTAGTCGCAGTT | 125 |
| GGCACCCAACACGAGAACTA | ||
| ELAV | GCACCATTCGGAGCAATAAT | 153 |
| TGTGCAGCTGGATGGTGTAG | ||
| RPL32 | GCTAAGCTGTCGCACAAATG | 160 |
| CGTTGTGCACCAGGAACTT |
表1のqRT-PCR分析のために使用したプライマー。
| 事前の分離サンプル中の核の総数 | 単離後サンプル中の核の推定総数 | 単離後のサンプルからのRNA収量（NG） |
| 0.8から1.2×10 7 | 1.3から2.7×10 4 | 160から220 NG |
表2。得られた代表的な核とRNA収量。グリア細胞で標識されたレポ- GAL4、UAS-EGFP :: MSP-300 KASH遺伝子型から100解剖し視葉と目成虫から事前分離と単離後の試料から得られた核とRNA収量の典型的な範囲EGFP :: KASH。 2.6.3に記載のように核を定量し、3.1.2に記載のようにRNAを定量した。
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Discussion
このプロトコルは、 ショウジョウバエの胚または幼虫組織における混合細胞集団から、特にタグ付けされた核を隔離するか、非常に豊かにするために使用できます。このプロトコルを使用して、核は約1時間で解剖した組織から単離することができる。単離された核の純度および収率は、実験的に各細胞型について決定されなければならない。それがために、試料中に存在するビーズの血球計数器を用いて、プロトコルの後のアイソレーションの段階で、ビーズに結合した核を定量化することが困難な場合があります。核の正確な数は、下流側のアプリケーションに必要とされる場合、従って、そのようなDNA含量などの代替法に基づく核の収率を推定する必要がある。 RNA単離に成功し、定量することができれば、核収率の正確な計算は、遺伝子発現解析のために必要ではない。我々が発見したように、それは、RNA収量を定量化するための蛍光ベースの方法を使用することが推奨され、そのRNA濃度の吸光光度定量これらの低濃度試料において高度に可変である。
磁気ビーズと抗体の選択：その成功に影響を与えるプロトコルの二つの重要な側面があります。 GFPまたはプロテインGに結合された磁気ビーズは、いくつかの異なる供給源から市販されている。しかし、それは強く2主な理由のために、このプロトコルで説明する手順のためにInvitrogen社から入手可能なプロテインG磁気ビーズを使用することをお勧めします。まず、2.8ミクロンにおけるインビトロジェンビーズの大きさは約5μm（ 図2D）である我々が検討した細胞型における核の平均サイズよりも僅かに小さい。小さ い磁気ビーズ（ 例えば 、50ナノメートル、μMACSα-GFP、ミルテニーバイオテク）は、バッチ洗浄スタイルの磁石に迅速に結合しないと、これらのビーズのために提供列は幼虫組織抽出物を詰まらせることができます。より大きな磁気ビーズ（ 例えば 10ミクロン、PureProteomeプロテインG磁気BEADS、ミリポア）は我々の予備テストでは核にうまく結合しなかったが、これらはまた、それが困難な、標準的な顕微鏡技術によってビーズに結合したサンプル中の核を識別すること、DAPIおよびGFPの両方と同じチャンネルに強い自家蛍光を示す。磁気ビーズの選択に加えて、免疫沈降に適していますが、それは、高い非特異的バックグラウンドを持っていないGFP抗体を使用することが重要です。このプロトコルの再現性を助けるために、我々は、GFPに対するモノクローナルマウス抗体を使用している。 GFPに対するポリクローナルウサギ抗体にも成功我々の予備研究でトライアルが行われたが、これらは、より高い非特異的なバックグラウンドを持っている傾向があった。他のモノクローナル抗体はまた、成功の様々なレベルで（ 例えば 、発達研究ハイブリドーマバンク）を試験した。従って、抗体選択は、標識された核の単離に成功における重要な因子である。
このプロトコルでは、我々はDETするための方法を説明しているが単離された核におけるアーミン遺伝子転写レベルは、それがステップ2.1から2.11に記載の手法は、後続のクロマチン免疫沈降分析のために使用され得る核を単離するのに適しているであろうことが予想される。組織を均質化前（ステップ2.3）、1％ホルムアルデヒドで固定されている場合、組織を切開し、数日間およびクロマチン免疫沈降分析を行うために十分な単離された材料の上に収集することができる。上述のように大雑把な推定値を提供する血球計数器を用いて得られたカウントに基づいて、我々は一般的に、目成虫原基と100幼虫（ 表2）の視葉から1.3×10 4〜2.7×10 4グリア核を得た。したがって、我々のアプローチを使用し、それは、標的細胞型の存在、および目的のエピトープに応じて、クロマチン免疫沈降分析を行うために十分な材料を得ることが可能であるべきである。
このテクニの一つの有用な遺伝的アプリケーションqueのは、それが積極的に劣性致死突然変異対立遺伝子についてホモ接合である胚または幼虫における特定の細胞型中の核を標識するために使用することができることである。これを実現するためには、2つの別々のフライの株式は、対象となる変異型対立遺伝子が特定のGal4ドライバーと再結合されている、または第3染色体上のUA-EGFP :: MSP-300 KASH導入遺伝子を生成する必要があります。変異対立遺伝子とGal4ドライバーを運ぶハエは突然変異対立遺伝子とUAS-EGFP :: MSP-300 KASH導入遺伝子を有するハエと交配している場合、変異型対立遺伝子の両方のコピーを持っている唯一の子孫は組織内のGFPで標識されるGal4ドライバーが表現されている。従って、劣性致死対立遺伝子の細胞特異的効果は、従来の致死性の段階に、胚または幼虫の段階で検査することができる。この遺伝技術はこれまで積極的に佐賀サブユニットでsgf11 1突然変異についてホモ接合である胚性筋で細胞を標識するために使用されてきた</ SUP>。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
私たちは、UAS-EGFP :: MSP-300 KASHプラスミドを提供するためのジャニス·フィッシャーに感謝します。 mAB24B10抗体はNICHDの後援の下に開発された発生研究ハイブリドーマバンクから得られ、アイオワ大学、生物学科によって維持された。 レポGAL4株 （BL7415）は、インディアナ大学ブルーミントンストックセンターから入手した。がん研究のためのパデュー大学センター米国癌協会の制度研究助成（IRG番号58-006-53）からの支援を感謝して承諾されます。 Jingqun MAはパデュー大学からの食糧農業におけるパデュー助手の農業研究によってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-chaoptin antibody (mouse, monoclonal) | Developmental Studies Hybridoma Bank | mAB24B10 | |
| Anti-GFP antibody (mouse, monoclonal) | Roche | 11814460001 | This specific antibody is recommended for this protocol. However, alternative antibodies could also be used. |
| 2x Bullseye EvaGreen qPCR Mastermix with ROX | MidSci | BEQPCR-R | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride salt) | Biotium | 40011 | |
| Dounce Homogenizer (1 ml) | VWR | 62400-595 | |
| Dumont #5 Tweezers, 11 cm | World Precision Instruments | 14095 | |
| Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation | Invitrogen | 10003D | This specific brand of magnetic beads is recommended for this protocol. |
| EpiScript Reverse Transcriptase | Epicentre | ERT12910K | http://www.epibio.com/docs/default-source/protocols/episcript-reverse-transcriptase.pdf |
| Falcon cell strainers, 40 μm pore size | VWR | 21008-949 | Alternative pore sizes could be used, depending on the size of the target cell nuclei. |
| Magnetic stand (8 x 1.5 ml tubes) | Millipore | LSKMAGS08 | |
| Mini tube rotator | Genemate | H-6700 | |
| Qubit starter kit | Life Technologies | Q32871 | Similar fluorescence-based methods for quantifying RNA yield could be used. http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/mp32852.pdfZ |
| RNAsecure (Ambion) | Life Technologies | AM7010 | The use of this reagent to inactivate RNAses is optional. |
| RT-PCR machine Thermal Cycler | BioRad | CFX Connect Thermal Cycler | |
| Siliconized 9-well glass plate | Hampton Research | HR3-134 | |
| Stereomicroscope Fluorescence Adapter (Royal Blue (440-460 nm) excitation + yellow barrier | Nightsea | This adaptor enables GFP fluorescence to be examined using a typical dissecting microscope (eg Nikon) | |
| StereoZoom Microscope 83604 Set with 10X Wide Field Eyepieces and Universal Boom Stand | Nikon | SMZ 745 | |
| Thermal Cycler | BioRad | T100 | |
| Trizol reagent | Life Technologies | 15596018 | CAUTION; Alternative RNA extraction methods can be used. http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/trizol_reagent.pdf |
| Tween 20 | Amresco | 0777-1L |
References
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