Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Teknik Subnormothermic Published: August 13, 2014 doi: 10.3791/51419
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2, 1,2, 1,3, 1,2
1Multi Organ Transplant Program, Toronto General Hospital, 2Department of Surgery, Toronto General Hospital, 3Department of Medicine, Toronto General Hospital
* These authors contributed equally

Summary

Marginale transplantater, såsom foie gras, podning fra ældre donorer, eller lever hentet efter hjertedød (DCD) tolerere konventionelle, kulde statisk opbevaring kun dårligt. Vi udviklet en ny model for subnormothermic ex vivo lever perfusion til konservering, vurdering og reparation af marginale lever transplantater forud for transplantation.

Abstract

Succesen med levertransplantation har resulteret i en dramatisk mangel orgel. I de fleste transplanterede områder 20-30% af patienterne på venteliste til levertransplantation dø uden at modtage en organtransplantation eller afnoteres til sygdomsprogression. En strategi for at øge donorpuljen er udnyttelsen af ​​marginale transplantater, såsom foie gras, podning fra ældre donorer eller donation efter hjertedød (DCD). Den nuværende bevarelse teknik kold statisk opbevaring kun dårligt tolereres af marginale lever resulterer i betydelig skade orgel. Hertil kommer, at kold statisk opbevaring orgel ikke tillade graft vurdering eller reparation før transplantation.

Disse mangler kold statisk bevarelse har udløst en interesse i varmt perfuseret organbevarelse at reducere kold iskæmisk skade, vurdere leveren transplantater under konservering, og undersøge muligheden for at reparere marginale lever før transplantation. De optimale pressikker og strømningsforhold, perfusion temperatur, sammensætning perfusionsopløsningen og behovet for en oxygen bærer har været kontroversiel i fortiden.

På trods af lovende resultater i flere dyreforsøg har kompleksiteten og omkostningerne forhindret en bredere klinisk anvendelse hidtil. For nylig, med forbedret teknologi og en bedre forståelse af leverfysiologi under ex vivo perfusion resultatet af varm leveren perfusion er forbedret, og der kan opnås konsekvent gode resultater.

Dette dokument vil give oplysninger om leveren hentning, lagring teknikker og isoleret lever perfusion hos svin. Vi vil illustrere a) de krav for at sikre tilstrækkelig iltforsyning til orglet, b) tekniske overvejelser om perfusion maskine og perfusionsopløsningen, og c) biokemiske aspekter af isolerede organer.

Introduction

Levertransplantation er den eneste behandlingsmulighed for patienter med slutstadiet leversygdom eller fremskreden hepatocellulært carcinom. I de sidste 25 år er antallet af ventelisten kandidater øges gradvist og oversteg antallet af ledige podninger. Antallet af hjerteslag donorer er faldet i det seneste årti. På samme tid har antallet af marginale transplantater, såsom donation efter hjertedød (DCD), såvel som gamle og fede lever steg 1,2.

Marginale podninger ofte faldt for levertransplantation på grund af den større chance for primær graft manglende eller forsinket funktion. I DCD transplantater, udvikling af iskæmisk typen galde strikturer (ITBS) er af særlig bekymring. Med den konventionelle statiske kold konservering teknik ITBS forekommer i omkring 10-40% af DCD transplantater. I de fleste patienter, ITBS fører til re-transplantation eller patientens død. Især længerevarende varme og kolde iskæmiske tider er risikofaktorer for ITBS 3-7. Donor alder, genetiske dispositioner (såsom CCR5 delta 32), og valget af konservering løsning er også blevet diskuteret som yderligere risikofaktorer 7-10. Delvis mikrotromber af peribiliary fartøjer er blevet foreslået som potentielle mekanisme til ITBS efter levertransplantation med DCD podekviste 11.

Forud for kliniske indførelse af levertransplantation, har ex vivo lever perfusioner blevet brugt til at studere hepatisk metabolisme og fysiologi 12,13. Efter levertransplantation fundet vej ind i den kliniske omgivelser i 1960'erne har utallige gjort forsøg på at anvende ex vivo lever perfusion som en konserveringsmetode ved at efterligne fysiologiske ernæring og iltforhold. Dens anvendelighed til konservering af marginale transplantater er blevet undersøgt i det sidste årti, men det nåede ikke standard kliniske pleje. Vi har for nylig beskrevet en reduktion i galdegang skade i DCD levertransplantation ved ex vivo perfusion konservering 14. Forskellige tilgange vedrørende perfusionsopløsningen blev foretaget. Udvælgelsen spænder fra cellulære løsninger som helblod fra donordyret eller pakkede røde celler i kombination med humant plasma, til acellulære fremgangsmåder som maskinen University of Wisconsin opløsning IGL opløsning eller Steen opløsning 14-19.

Temperaturen svinger 4-37 ° C 20. Den nomenklatur i hypotermisk, subnormothermic og normothermic er meget varierende og inkonsekvent. Alle de forskellige teknikker, løsninger og temperaturindstillinger sigte på 1) stabile perfusion, 2) tilstrækkelig iltning, og 3) genetablering af organfunktion. En forbedret bevaring kapacitet samt evne orgel vurdering og behandling under normothermic og subnormothermic perfusion ansigter højere teknisk kompleksitet og omkostninger i forhold til hypotermisk perfusion 20,21.

Vi har udviklet en subnormothermic ex vivo lever perfusionssystem løbet af de sidste 4 år. Systemet kan anvendes til 1) "genoplade" nedsat indhold af energi, 2) at vurdere transplantatet kvalitet, og 3) at reparere marginale lever før transplantation. Følgende protokol indeholder alle oplysninger for et stabilt nedsat perfusion.

Protocol

En skematisk oversigt over protokol er vist i figur 1.

Figur 1
Figur 1. Undersøgelse protokol. Porcin studie design leverskade er baseret på en donation efter hjertedød (DCD) model. Efter dissektion af alle lever fartøjer er hjertedød induceret efterfulgt af 45 min varm transplantat iskæmi. For at simulere en graft transport mellem donor og modtager hospitaler i et klinisk miljø, er transplantatet opbevares på is i 4 timer efter en kold, dual flush. Efter fryselager, orglet er subnormothermic perfuseres i 6 timer for at vurdere perfusion stabilitet. I en transplantation model kunne perfusion tid være kortere for at genoplade energilagring og vurdere organets levedygtighed. Klik hanre for at se en større version af dette tal.

1. Dyr

BEMÆRK: Mand Yorkshire grise, 30-35 kg, blev anvendt til denne undersøgelse. Alle dyr modtog human måde i overensstemmelse med de '' Principles of Laboratory Animal Care '' formuleret af den nationale Selskab for Medicinsk Forskning og 'Guide til pasning af forsøgsdyr' udgivet af National Institutes of Health. Animal Care Komité Toronto General Research Institute har godkendt alle studier.

2. Organ Retrieval

  1. Hus mandlige Yorkshire svin i forskningsfaciliteter til 1 uge før perfusion / transplantation for at reducere niveauet af stress og til at vænne dyrene til boligforhold. Mindre end 2 dage af boliger inde i anlægget vil føre til en stress-induceret fysisk reaktion, som kan ændre perfusionen udfald 22,23.
  2. Bedøver svinved intramuskulær (im) injektion af en blanding af ketamin (25 mg / kg), atropin (0,04 mg / kg) og midazolam (0,15 mg / kg).
  3. Forud for intubation, sikre grisen ånder spontant 2 l O 2 doseret med 5% isofluran. Spray stemmebåndene med 2% lidocain 2 min før intubation at undgå vokal snor spasmer. For eksempel, for en 35 kg gris bruge en 6,5 fr. trachealtube. Bloker trachealtube med 3-5 ml luft.
  4. Efter intubation, brug capnometry at bekræfte korrekt intubation. Sænk isofluran gas til 2%. Indstil ventilatoren til 14-16 vejrtrækninger / min og et respirationsvolumen på 10 ml / kg kropsvægt.
  5. Anbring en 20 G intravenøs (iv) kateter i en af ​​de ørevener at tillade infusion af Ringers laktat (200 ml pr time). Skrub derefter gris og dække det med sterile forhæng.
  6. Foretag en midtlinieincision efterfulgt af en venstre sideværts forlængelse. Brug et håndklæde til at dække store og små tarme og flytte dem til venstre side.
  7. Separat infeør vena cava (IVC) og den distale aorta fra hinanden; afsnøre aorta grene til back; isolere og frie renale arterier fra vedhængende væv.
  8. Opdel falciforme ledbånd og den trekantede ledbånd ved hjælp cautery.
  9. Slip portalvenen ved et snit i bughinden mellem bugspytkirtlen og portal vene. Bind off vener dræne fra bugspytkirtlen til portalen vene.
  10. Dissekere cøliaki stammen under portåren og følge den bagud til aorta. Surround mesenterialarterie med en 2-0 uafgjort; omgiver milt og venstre gastriske arterier, som gren posteriort til cøliaki stammen. Dissekere cøliaki stammen fra portalen vene.
  11. Ligere lymfekar i hepatoduodenal ligament at forhindre lymfatisk lækage. Divider den rigtige gastrisk arterie mellem bånd. Ligere mindre vener. Adskil galdegangen fra ledbånd og dividere det distalt efter ligering.
  12. Skær aorta bag membranen mellem hjerte og cøliaki stUNK; placere en 2-0 slips omkring aorta.
  13. Slip leveren fra den nedre cava på højre side ved hjælp af elektro kautering; bruge en saks til den øvre del mellem cava og leveren.
  14. Fjern galdeblæren og ætse bleeders fra galdeblæren seng.
  15. Administrer iv 1.000 IE / kg donor vægt heparin. For en DCD model fremkalde hjertestop ved intracardial injektion af 40 mval KCI 3 minutter efter heparin administration. Sæt hjertestop som udgangspunkt af varm iskæmi.
  16. For perfusionen, indsamle 1,6 l svineblod i CPDA poser (citrat, fosfat, dextrose, adenosin) umiddelbart efter hjertedød. Udfør en soft spin (2.000 xg uden bremse). Fjern plasma og fibrinlaget under steril tilstand (biosikkerhed kabinet klasse II) og gemme erytrocytterne i CPDA poser til transfusion.
  17. Kanyle portåren og aorta med orgel flush linjer. Bind fra de tidligere fastsatte bånd omkring femoralis, nyre, milt, mesenteriale og venstre gastrisk kunstcer samt øvre aorta. For et hjerteslag donor (HBD) model, udføre kannulation af aorta og portal vene under hjertebanken forhold.
  18. Efter 45 minutter varm iskæmi, skylle leveren med University of Wisconsin (UW) løsning med dobbelt perfusion via aorta (tryk pose) og portal vene (tyngdekraft drevet).
  19. Skær leveren ud af grisen, der forlader alle resterende fartøjer lang.
  20. Under fremstillingen tilbage-bord, klemme den øvre IVC hjælp af en Satinsky klemme og skyl leveren en anden gang med 0,5 liter UW opløsning retrogradt via lavere IVC indtil portvenen udstrømning er klar.
  21. Bind off alle arterielle grene fra aorta og cøliaki stammen. Udfør en arteriel back-bord pres perfusion med omkring 0,5 L af UW løsning.
  22. Skyl galdegangen hjælp UW løsning.
  23. Kanyle de øvre og nedre dele af IVC anvender 1/2 "x 3/8" reduktionsgear med Luer Lock; kanyle portåren og leveren arterie hjælp 3/8 "; x 1/4 "og 1/4" x 3/8 "reduktionsgear med Luer Lock. Brug øvre og nedre vena cava som venøs dræning.
  24. Placer leveren i et organ taske, lukke orgel pose og opbevare leveren på is indtil perfusionen er startet.

3. Ex vivo Lever Perfusion

  1. Forbered perfusionsopløsningen indeholdende 2.000 ml Steen opløsning, 400 ml vaskede erytrocytter, 550 mg natriumpyruvat, 100 ml aminosyre opløsning (10% Travasol), 10 mg calciumgluconat, 1.000 IE hurtigtvirkende insulin, 1 g cefazolin, 500 mg metronidazol, og 10.000 IE heparin. Tilføj andre molekyler til vasodilatation, immunosuppression, skylningssystem af reaktive ilt arter, eller lever celle behandling er baseret på den særlige undersøgelse protokollen.
  2. Til dialyse komponent bruge standard dialysat indeholdende 3,5 mM kalium, 25 mM bicarbonat, 27 mM glucose, samt 275 mg / L pyruvat.
  3. Opsæt perfusionskredsløbet (skema se figur 2).
    Figur 2
    Figur 2. Circuit oprettet. Kommer fra de vigtigste reservoir som udgangspunkt og slutpunkt er perfusionsopløsningen drevet af en centrifugalpumpe gennem en oxygenator. Lige efter iltning af opløsningen kredsløbet deler sig i en mindre linje til en dialysator enhed for elektrolyt-homeostase og en større linje til en leukocyt-filter til reduktion af rest hvide blodlegemer (WBC). Den løsning, der løber gennem dialysatoren tilbage til hovedbeholderen. Efter leukocyt filter kredsløbet deler sig igen i 2 lige linjer. En linje kører ved højt tryk (ca. 60 mm Hg) direkte ind i aorta til perfundere den hepatiske arterie. Den anden linje løber ud i et andet reservoir. Fra denne beholder portvenen perfunderes. Trykket af portalen perfusion afhænger højde energi af reservoiret løsning niveau (ca. 2-6 mm Hg). Alle væsker er drained via infrastruktur og supra-hepatisk cava tilbage i de vigtigste reservoir. Til tyngdekraft reduktion og homogen perfusion, er leveren placeret i et bassin fyldt med temperaturen reguleret vand. Det er adskilt fra vandet ved en uigennemtrængelig membran og den svømmer i et perfusion suspension. Klik her for at se en større version af dette tal.
    1. Saml alle væsker fra kredsløbet i en 3 L reservoir (vigtigste reservoir) og klemme udstrømningen.
    2. Slut udstrømningen til en centrifugalpumpe efterfulgt af en kommerciel oxygenator.
    3. Bag oxygeneringsapparatet, opsplitte slangen i 2 linier. Slut den ene linje til en dialysator og dræne det tilbage til den vigtigste reservoir. Tilslut den anden linje til en leukocyt reduktion filter.
    4. Opsplitte den linje efter filteret leukocyt reduktion til en arteriel linje, der leverer perfusionsopløsning til den hepatiske arterie, og en portal venous linje leverer perfusionsopløsning til et andet reservoir, der løber ud i portalen vene ved hjælp af tyngdekraften udstrømning. Clamp portalen tilstrømning.
    5. Slut arterielle linje til et vena cava linje afdrypning i den vigtigste reservoir for flydende erindring.
    6. Til samling af ascites eller lækage af perfusionsopløsning fra leveren, udarbejde en sugeledning forbundet til de vigtigste reservoir.
  4. Slip udstrømningen klemme fra de vigtigste reservoir og fylde kredsløbet med perfusionsopløsningen. Start centrifugalpumpe på 1.500 runder / min. Perfusionsopløsningen vil køre gennem den arterielle linje i vena cava linje tilbage til den vigtigste reservoir. Sørg for, at al luft er drevet ud af kredsløbet.
  5. Tænd for gasforsyningen til oxygeneringsapparatet.
  6. Tag leveren fra isen. Skyl UW løsning med saltvand.
  7. Placer leveren, med sin konvekse side ned for at lette adgangen for de fartøjer, helst i en tyngdekraft-frit miljø for at undgåorgel kompression på kontaktfladen. Brug en varme og kølbare vandbad. Indstil starttemperatur af kredsløbet og vandbad til 20 ° C. Dæk vandbadet med en uigennemtrængelig membran og placere leveren på denne membran. Reducer tyngdekraften drevet kompression ved at nedsænke leveren med perfusionsopløsningen.
  8. Reducer hastigheden af ​​centrifugalpumpen til 1.000 omgange / min og placere to klemmer på tilslutning af arterielle og vena cava linjer. Derefter skar slangen i mellem klemmerne. Ved hjælp af en 3-vejs-stik, tilslutte både cava udstrømning og forbinde dem til hulvenen linje.
  9. Slip klemmen fra den arterielle linje, hæld perfusionsopløsning i den arterielle kanyle til at slippe af bobler, og tilslut den linje til kanylen. Øg centrifugalpumpe til 1.500 runder / min. Slip anden klemme fra vena cava linje.
  10. Slip klemmen fra portalen venøse reservoir for at fylde det op. Lad perfusionsopløsning hældes i portalen cannuLA og tilslut det. Vær særlig forsigtig af stabile væskestande i portalen reservoiret.
  11. Tilslut trykledning til Luer Låse af arterielt, Portal, og vena cava kanyler.
  12. At efterligne fysiologiske betingelser gælder behandlinger i den rigtige beholder. Injicer glukose i portalen vene og ikke ind i den arterielle linje med henblik på at etablere en gradient efterligner en øget portåre glukose gradient og inducere glykogen syntese 24,25.
  13. Efter tilslutning leveren til kredsløbet, hæve temperaturen til 33 ° C inden for 60 min.
  14. Sigt efter en arteriel starter flow på omkring 250 ml / min ved 40 mm Hg. Dette kan nå 700 ml / min under perfusion, når trykket forøges op til 70 mm Hg.
  15. Ved starttemperatur, mål for en portal vene flow på 500-600 ml / min ved 3-5 mm Hg. Efter at hæve temperaturen, overvåge portalen venøse flow, hvilket vil øge op til 1.100 ml / min ved 4-6 mm Hg. Undgå at overskride portal tryk over Physiological værdier (omkring 8 mm Hg) for at beskytte sinusformede fenestrationer 26. Undgå at overskride totale flow over 2.000 ml / min for at undgå at beskadige orgel. Sæt udstrømningen til -2 mmHg ved at sænke den vigtigste reservoir for at forhindre leveren overbelastning ved funktionel obstruktion.
  16. Tilsæt dialyse komponent til kredsløbet for at ækvilibrere perfusionsopløsningen til forudbestemte værdier 27. Indstil dialysatstrøm til 500 ml / time. Vær særlig opmærksom på at justere dialyse udstrømning så perfusionsopløsningen hverken fortyndet eller koncentreret. Inden for den første time af perfusion det vigtigste reservoir skal følges nøje!
  17. Sikre homogen iltning af vævet at genvinde og opretholde organfunktion ved hjælp af en primær gasblanding komponent O 2 (95-98%) og CO 2 (2-5%). Brug variabel gas under perfusion da leveren ændrer dets metabolisme, og dens pH efterspørgsel i perfusion.
  18. Oprethold en lav pH i starten afperfusion at beskytte orgel ved hjælp af paradoks pH-konceptet 28 og undgå alvorlige vævsskader, der kan opstå som følge af hurtige forbindelser til fysiologisk pH under reoxygenering, da efter oplagring i UW løsning, orglet har en acidotisk pH under 7. Juster partialtrykket af CO 2 kontinuerligt ned til 25-30 mmHg, således at pH vil nå et fysiologisk niveau inden for 1 time.
  19. Tilføj natrium eller kaliumhydrogencarbonat til kredsløbet for at opnå en fysiologisk koncentration af standard bicarbonat perfusionsopløsningen. Injicere det omhyggeligt under gentagne blod gas og elektrolyt kontrol.
  20. Overvåg perfusionen ved periodisk venøs og arteriel blodgas og AST analyser. Den venøse PO 2 forbliver over 175 mmHg i løbet af perfusion. Overvåg vaskulær flow og tryk og notere en stabil perfusion med en konstant vaskulær modstand.
  21. Hold perfusion systemet stabilt i op til 8 timer. Ved udgangen af ex vivo perfusion periode, køligtned perfusionssystemet til 20 ° C, og efter banens slangen frakobles fra leveren, skylle perfusionsopløsningen ud leveren duelt med iskold UV løsning. Opbevar leveren igen anbragt på is i en steril orgel taske.

Representative Results

Her præsenterer vi resultaterne af 5 perfusion eksperimenter med DCD-implantater efter 45 min opvarmningsperiode og 4 timer kold iskæmi forud for starten af subnormothermic ex vivo perfusion.

Det vigtigste mål for en ex vivo lever perfusion er at sikre en tilstrækkelig iltforsyning til orglet. Iskæmi forårsager vasokonstriktion, hvilket øger perfusion modstand. Opnåelse konstante vaskulære strømme med stabile pres er en god indikator for tilstrækkelig iltning. Under en induktion periode på 1-2 timer perfusionsopløsningen og organet er varmet op til 33 ° C, hvilket deceases den vaskulære modstand af leveren. Når den ønskede temperatur på 33 ° C er opnået, flow-værdier ved en konstant, næsten fysiologiske område for resten af den 6 timers perfusion tid (figur 3A-3D).

Samtidig, det organ bliver metabolisk aktive. 4A viser den venøse pO <sub> 2, en markør for iltforbrug. Inden den første 2 timer venøse pO 2 falder til et konstant plateau. På dette metabolisk aktiv tilstand, begynder leveren producerer galde (figur 4B). Dialysatoren giver en afbalanceret elektrolyt homeostase (figur 4C-4D). En indledende hyperkaliæmi hurtigt udjævnet. Online AST måling tjener som overvågning af hepatocellulær skade. Figur 5 viser kun en overfladisk lineær AST stigning over hele perfusion periode. H & E-farvning efter 6 timers perfusion afslører hepatocyt nekrose <5% med en intakt luftrør og sinusformet struktur (figur 6). PAS-farvning på samme tidspunkt viser genopfyldes cellulær glykogen lagring sammenlignet med opbrugt opbevaring i kolde konserveret DCD-implantater (Figur 7).

Figur 3
Figur 3. Perfusion strømme og tryk (n = 5, fejlsøjler viser standardafvigelse). (A, B) nedsat arterie (HA) flow og tryk: Under opvarmning fase i første 1-2 timer, strømmen øges ved stabile pres og er konstant bagefter. Ser man på den faldende portalen venetryk (C), kan stigningen i HA-strømmen mod slutningen af perfusionen være en autoregulatorisk reaktion af leveren. (C, D) Portalen venøse (PV) flow stigninger svarende til HA-strømmen under de første 2 timer af opvarmning. Trykkene forblive relativt stabil.

Figur 4
Figur 4. Overvågning parametre (n = 5, fejlsøjler viser standardafvigelse). (A) venøse pO 2 som en markør for iltforbrug og metabolisk aktivitet falder i den indledende fase af opvarmning på grund af aktiveret cellular stofskifte; det forbliver stabil derefter (B), galde produktion som en markør af den metaboliske aktivitet begynder ved temperaturer omkring 30 ° C, og således mellem den første og anden time perfusion (C, D) dialysatoren sikrer elektrolyt homeostase..; en indledende hyperkaliæmi er hurtigt afbalanceret.

Figur 5
Figur 5. AST (n = 5, fejlsøjler viser standardafvigelse) AST er en følsom markør af hepatocellulært skade.; den lavvandede stigning antyder nogen væsentlig skade i ex vivo perfusion.

Figur 6
Figur 6. H & E-farvning (20X forstørrelse). (A) Sham leverprøve før varm iskæmi, en repræsentant lever lobule med intakt architecture. (B) Lever prøve efter 45 min for varm iskæmi, 4 timer af kold iskæmi og 6 timer af subnormothermic perfusion den luftrør arkitektur er intakt uden nekrose og kun minimal celle hævelse er de sinusformede rum mildt forstørrede i sammenligning med den sham prøve.

Discussion

I en gris model, der efterligner DCD levertransplantation, vi viste, at subnormothermic lever perfusion med en cellulær perfusionsopløsning resulterer i stabile perfusion parametre minimal hepatocyt skade, og aktivt hepatisk metabolisme. Vores subnormothermic perfusion oprettet har vist sig at inddrive en hepatocellulært homeostase og stofskifte. Glykogen lagring er restaureret og metabolitter kasseres.

Ex vivo lever perfusion som konservering teknik giver for første gang mulighed for at vurdere markører for graft funktion og skade i organopbevaring og før transplantation. Ved siden af den makroskopiske vurdering af implantatet perfusion homogenitet, flowværdierne giver en god indikator for transplantatet levedygtighed og omfanget af den iskæmiske skade, den havde lidt tidligere 29. Iltforbrug og galde produktion er markører for metabolisk funktion. Niveauer af leverenzymer som AST kan bruges til såsess graden og dynamik af hepatocellulært skade 30. Denne grundige transplantat vurdering kan tillade en pålidelig forskelsbehandling mellem transplanterbare og ikke-transplanterbare marginale organer.

Vi valgte en subnormothermic temperatur på 33 ° C i vores perfusion system, fordi temperaturen er tilstrækkelig til at tillade metabolisme samt ATP og glycogensyntese. Samtidig giver det en reduceret oxygenforbrug i forhold til normothermic perfusion indstillinger, som giver ekstra sikkerhed mod iskæmisk skade. Generelt har perfusioner temperaturer over 30 ° C vist sig at minimere kulde iskæmisk skade og give tilstrækkelig metabolisk aktivitet 31.

I modsætning til andre grupper, vi ikke bruge fuldblod som perfusat, men en Normo-osmotisk albumin (Steen) med vaskede og filtrerede røde blodceller. Ved at udelukke plasmakomponenterne samt trombocytter og leukocytter, perfusionsopløsningen er deunderskrevet for at minimere pro-inflammatorisk signalering under ex vivo perfusion.

Ud over transplantatet vurdering stabile perfusion over flere timer tillader transplantat behandling. Adskillige molekyler har vist sig at dæmpe reperfusionsskade under forsøgsbetingelser 32. Imidlertid har næsten ingen behandling regime gjort sin vej til klinisk praksis, endnu. En årsag synes at være den manglende mulighed for at anvende disse behandlinger under kold opbevaring. En metabolisk aktiv lever på en ex vivo perfusionssystem er optimal til at anvende nogen form for behandling. I denne forbindelse, ikke kun behandlinger forbedring reperfusion betingelser som dæmpning af Kupffer-celle aktivitet eller opfangning af reaktive oxygenspecies er tænkelige, men også behandlinger som genterapi for at konditionere implantatet, fx mod hepatitis C tilbagefald. Andre potentielle strategier kunne omfatte reduktion på steatosis under ex vivo perfusionperiode 33.

Sammenfattende ex vivo lever perfusion er en roman strategi for at minimere kulde iskæmisk skade og vurdere marginale lever podninger før levertransplantation. Den ex vivo perfusion indstilling giver enestående mulighed for at reparere og tilstand transplantater forud for transplantation.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at afsløre.

Acknowledgments

Undersøgelsen blev støttet af forskningsbevillinger fra Roche Organtransplantations Research Foundation (ROTRF) og Astellas. Markus Selzner blev understøttet af en ASTS Karriereudvikling Award. Matthias Knaak blev støttet af Astellas Research Scholarship. Vi takker Uwe Mummenhoff og Birmingham familie for deres generøse støtte.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
circuit Maquet (Hirrlingen, GER) custom made main reservoir (3 L, 3/8" outflow)
portal reservoir (1.5 L, 1/4", outflow)
centrifugal pump
oxygenator
lycocyte filter
Tubing (1/4" x 1/16") Raumedic (Helmbrechts, GER) MED7506
Tubing (3/8" x 3/32") Raumedic (Helmbrechts, GER) MED7536
Tubing connectors Raumedic (Helmbrechts, GER) various sizes
Dialysis filter, Optiflux F160NR Fresenius Medical Care (Waltham, MA) F160NR
STEEN solution XVIVO (Göteborg, SWE) 19004 2 L
Dialysis acid concentrate A Baxter (Mississauga, ON) D12188M 45 ml
Amino acid, Travasol 10% Baxter (Mississauga, ON) JB6760 100 ml
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) P2256 1.1 g
Heparin Sandoz Canada Inc (Toronto, ON) 10750 40,000 iU
Calcium gluconate Pharmaceutical Partners of Canada (Richmond Hill, ON) C31110 10 mg
Fast acting insulin various vendors 1,000 iU
Cefazoline various vendors 1 g
Metronidazole Baxter (Mississauga, ON) JB3401 500 mg

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. , Department of Health and Human Service, Organ Procurement and Transplantation Service. Available from: http://optn.transplant.hrsa.gov (2013).
  2. Qiu, J., Ozawa, M., Terasaki, P. I. Liver transplantation in the United States. Clinical Transplants. , 17-28 (2005).
  3. Maheshwari, A., Maley, W., Li, Z., Thuluvath, P. J. Biliary complications and outcomes of liver transplantation from donors after cardiac death. Liver Transpl. 13 (12), 1645-1653 (2007).
  4. Reich, D. J., Hong, J. C. Current status of donation after cardiac death liver transplantation. Curr Opin Organ Transplant. 15 (3), 316-321 (2010).
  5. Grewal, H. P., et al. Liver transplantation using controlled donation after cardiac death donors: an analysis of a large single-center experience. Liver Transpl. 15 (9), 1028-1035 (2009).
  6. Nguyen, J. H., et al. Long-term outcomes of donation after cardiac death liver allografts from a single center. Clin Transplant. 23 (2), 168-173 (2009).
  7. Heidenhain, C., et al. Incidence of and risk factors for ischemic-type biliary lesions following orthotopic liver transplantation. Transpl Int. 23 (1), 14-22 (2010).
  8. Moench, C., Uhrig, A., Lohse, A. W., Otto, G. CC chemokine receptor 5delta32 polymorphism-a risk factor for ischemic-type biliary lesions following orthotopic liver transplantation. Liver Transpl. 10 (3), 434-439 (2004).
  9. Iacob, S., et al. Genetic, immunological and clinical risk factors for biliary strictures following liver transplantation. Liver Int. 32 (8), 1253-1261 (2012).
  10. Heidenhain, C., Puhl, G., Moench, C., Lautem, A., Neuhaus, P. Chemokine Receptor-5Delta32 Mutation is No Risk Factor for Ischemic-Type Biliary Lesion in Liver Transplantation. J Transplant. , (2009).
  11. Hashimoto, K., et al. Use of tissue plasminogen activator in liver transplantation from donation after cardiac death donors. Am J Transplant. 10 (12), 2665-2672 (2010).
  12. Staib, W., Scholz, R. Stoffwechsel der perfundierten Leber. , Springer. (1968).
  13. Brauer, R. W. Liver. Annu Rev Physiol. 18, 253-278 (1956).
  14. Boehnert, M. U., et al. Normothermic acellular ex vivo liver perfusion reduces liver and bile duct injury of pig livers retrieved after cardiac death. Am J Transplant. 13 (6), 1441-1449 (2013).
  15. Guarrera, J. V., et al. Hypothermic machine preservation in human liver transplantation: the first clinical series. Am J Transplant. 10 (2), 372-381 (2010).
  16. Fondevila, C., et al. Hypothermic oxygenated machine perfusion in porcine donation after circulatory determination of death liver transplant. Transplantation. 94 (1), 22-29 (2012).
  17. Rougemont, O., et al. One hour hypothermic oxygenated perfusion (HOPE) protects nonviable liver allografts donated after cardiac death. Ann Surg. 250 (5), 674-683 (2009).
  18. Chung, W. Y., et al. Addition of a kidney to the normothermic ex vivo perfused porcine liver model does not increase cytokine response. J Artif Organs. 15 (3), 290-294 (2012).
  19. Brockmann, J., et al. Normothermic perfusion: a new paradigm for organ preservation. Ann Surg. 250 (1), 1-6 (2009).
  20. Hessheimer, A. J., Fondevila, C., García-Valdecasas, J. C. Extracorporeal machine liver perfusion: are we warming up. Curr Opin Organ Transplant. 17 (2), 143-147 (2012).
  21. Vogel, T., Brockmann, J. G., Friend, P. J. Ex-vivo normothermic liver perfusion: an update. Curr Opin Organ Transplant. 15 (2), 167-172 (2010).
  22. Swindle, M. M., Smith, A. C. Best practices for performing experimental surgery in swine. J Invest Surg. 26 (2), 63-71 (2013).
  23. Smith, A. C., Swindle, M. M. Preparation of swine for the laboratory. ILAR J. 47 (4), 358-363 (2006).
  24. Cywes, R., et al. Effect of intraportal glucose infusion on hepatic glycogen content and degradation, and outcome of liver transplantation. Ann Surg. 216 (3), 235-246 (1992).
  25. Ishida, T., et al. Differential effects of oral, peripheral intravenous, and intraportal glucose on hepatic glucose uptake and insulin and glucagon extraction in conscious dogs. J Clin Invest. 72 (2), 590-601 (1983).
  26. Morsiani, E., Aleotti, A., Ricci, D. Haemodynamic and ultrastructural observations on the rat liver after two-thirds partial hepatectomy. J Anat. 4 (Pt 4), 507-515 (1998).
  27. Schön, M. R., et al. Liver transplantation after organ preservation with normothermic extracorporeal perfusion. Ann Surg. 233 (1), 114-123 (2001).
  28. Currin, R. T., Gores, G. J., Thurman, R. G., Lemasters, J. J. Protection by acidotic pH against anoxic cell killing in perfused rat liver: evidence for a pH paradox. FASEB J. 5 (2), 207-210 (1991).
  29. Derveaux, K., et al. Does ex vivo vascular resistance reflect viability of non-heart-beating donor livers? Transplant Proc. 37 (1), 338-339 (2005).
  30. Guarrera, J. V., et al. Hypothermic Machine Preservation of Human Liver Allografts: Markers of Reperfusion Injury [abstract# 1282]. Am J Transpl. 7, Suppl 2. 476 (2007).
  31. Tolboom, H., et al. Subnormothermic machine perfusion at both 20°C and 30°C recovers ischemic rat livers for successful transplantation. J Surg Res. 175 (1), 149-156 (2012).
  32. Vollmar, B., Menger, M. D. The hepatic microcirculation: mechanistic contributions and therapeutic targets in liver injury and repair. Physiol Rev. 89 (4), 1269-1339 (2009).
  33. Jamieson, R. W., et al. Hepatic steatosis and normothermic perfusion-preliminary experiments in a porcine model. Transplantation. 92 (3), 289-295 (2011).

Tags

Medicin , DCD
Teknik Subnormothermic<em&gt; Ex vivo</em&gt; Lever Perfusionen til opbevaring, vurdering og reparation af marginale Liver transplantater
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Knaak, J. M., Spetzler, V. N.,… More

Knaak, J. M., Spetzler, V. N., Goldaracena, N., Louis, K. S., Selzner, N., Selzner, M. Technique of Subnormothermic Ex Vivo Liver Perfusion for the Storage, Assessment, and Repair of Marginal Liver Grafts. J. Vis. Exp. (90), e51419, doi:10.3791/51419 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter