Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Techniek van Subnormothermic Published: August 13, 2014 doi: 10.3791/51419
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2, 1,2, 1,3, 1,2
1Multi Organ Transplant Program, Toronto General Hospital, 2Department of Surgery, Toronto General Hospital, 3Department of Medicine, Toronto General Hospital
* These authors contributed equally

Summary

Marginale enten, zoals vette levers, enten van oudere donoren, of levers teruggehaald na hartdood (DCD) tolereren conventionele, koude statische opslag alleen slecht. We ontwikkelden een nieuw model van subnormothermic ex vivo lever perfusie voor het behoud, de beoordeling, en de reparatie van marginale lever transplantaties voorafgaand aan de transplantatie.

Abstract

Het succes van levertransplantatie resulteerde in een dramatische tekort aan organen. In de meeste regio's transplantatie 20-30% van de patiënten op de wachtlijst voor levertransplantatie sterven zonder het ontvangen van een orgaantransplantatie of worden geschrapt voor progressie van de ziekte. Een strategie om de donor zwembad te verhogen is het gebruik van marginale enten, zoals vette levers, enten van oudere donoren, of donatie na hartdood (DCD). De huidige bewaartechniek koude statische opslag alleen slecht verdragen door marginale levers resulteert in aanzienlijke orgaanschade. Bovendien heeft koude statische opslag van organen niet graft assessment of reparatie vóór transplantatie toestaan.

Deze tekortkomingen van koude statische bewaring hebben een belang in warme perfusie preservatie getriggerd om koude ischemische letsel te verminderen, lever transplantaties te beoordelen tijdens bewaring, en de mogelijkheid om marginale levers herstellen voorafgaand aan de transplantatie te verkennen. De optimale preszeker en stromingsomstandigheden, perfusie temperatuur, samenstelling van de perfusie-oplossing en de noodzaak van een zuurstofdrager is controversieel in het verleden.

Ondanks de veelbelovende resultaten in verschillende dierstudies, hebben de complexiteit en de kosten van een bredere klinische toepassing verhinderde tot nu toe. Onlangs, met verbeterde technologie en een beter begrip van de lever fysiologie tijdens ex vivo perfusie de uitkomst van warme leverperfusie verbeterd en consistent goede resultaten kunnen worden bereikt.

Dit document bevat informatie over de lever retrieval, opslagtechnieken, en geïsoleerde lever perfusie bij varkens te voorzien. We zullen illustreren a) de eisen om voldoende zuurstof zorgen aan het orgel, b) technische overwegingen over de perfusie machine en de perfusie-oplossing, en c) biochemische aspecten van geïsoleerde organen.

Introduction

Levertransplantatie is de enige optie voor de behandeling bij patiënten met eindstadium leverziekte of gevorderde leverkanker. Voor de laatste 25 jaar is het aantal wachtlijst kandidaten geleidelijk verhoogd en overtrof het aantal beschikbare transplantaten. Het aantal heart-beating donoren is afgenomen in het afgelopen decennium. Tegelijkertijd zijn aantallen marginale transplantaten, zoals schenking na hartdood (DCD), evenals oude en vette lever verhoogde 1,2.

Marginal grafts worden vaak afgewezen voor levertransplantatie vanwege de hogere kans primaire transplantaat niet of vertraagde werking. In DCD enten, ontwikkeling van ischemische soort gal vernauwingen (ITBS) is van bijzonder belang. Met de conventionele statische koude bewaring techniek, ITBS komen voor bij ongeveer 10-40% van de DCD enten. In de meeste patiënten, ITBS leidt opnieuw transplantatie of overlijden van de patiënt. Vooral langdurige warme en koude ischemische tijden zijn risicofactoren voor ITBS 3-7. Donor leeftijd, genetische aanleg (bijvoorbeeld CCR5 delta 32), en de keuze van preservatievloeistof ook besproken als bijkomende risicofactoren 7-10. Gedeeltelijke microtrombose van de peribiliary schepen is gesuggereerd als mogelijke mechanisme voor ITBS na levertransplantatie met DCD ent 11.

Voorafgaand aan de klinische introductie van levertransplantatie, zijn ex vivo lever perfusie gebruikt om metabolisme in de lever en fysiologie 12,13 bestuderen. Na levertransplantatie zijn weg gevonden in de klinische setting in de jaren 1960, zijn talloze pogingen gedaan om ex vivo lever perfusie gebruiken als conserveringsmethode door het nabootsen van fysiologische voeding en zuurstoftoevoer condities. Het nut ervan voor het behoud van marginale enten is onderzocht in de afgelopen tien jaar, maar het heeft de standaard klinische zorg niet bereiken. We beschreven onlangs een vermindering van galwegletsel in DCD levertransplantatie door ex vivo doorbloed bewaring 14. Verschillende benaderingen betreffende de perfusievloeistof gemaakt. De keuze varieert van mobiele oplossingen zoals volbloed uit de donor dier of rode bloedcellen in combinatie met menselijk plasma, om acellulaire benaderingen zoals machine University of Wisconsin-oplossing, IGL oplossing, of Steen oplossing 14-19.

De temperatuur varieert 4-37 ° C 20. De nomenclatuur in onderkoeld, subnormothermic en normotherme is zeer variabel en inconsistent. Alle verschillende technieken, oplossingen, en de temperatuur instellingen zijn gericht op 1) stabiele perfusie voorwaarden, 2) voldoende zuurstof, en 3) herstel van de orgaanfuncties. Een verbeterde behoud capaciteit en het vermogen van orgel beoordeling en behandeling tijdens normothermische en subnormothermic perfusie gezichten hogere technische complexiteit en de kosten in vergelijking met onderkoelde perfusie 20,21.

We hebben een subnormothermic ex vivo lever perfusie systeem ontwikkeld in de afgelopen 4 jaar. Het systeem kan gebruikt worden om 1) de hepatische energie-inhoud "laden", 2) de kwaliteit van de transplantaat te beoordelen, en 3) repareren marginale levers voor transplantatie. Het volgende protocol bevat alle informatie voor een stabiele leverperfusie.

Protocol

Een schematisch overzicht van het protocol is weergegeven in figuur 1.

Figuur 1
Figuur 1 Studie-protocol. De varkens studie ontwerp van leverschade is gebaseerd op een donatie na hartdood (DCD) model. Na dissectie van alle schepen de lever, wordt het hart van de dood veroorzaakt, gevolgd door 45 min van warme ischemie graft. Een graft transport tussen de donor en de ontvanger ziekenhuizen in een klinische omgeving te simuleren, wordt de transplantaat opgeslagen op ijs gedurende 4 uur na koude, dual flush. Na koude opslag, het orgaan subnormothermic geperfundeerde 6 h teneinde de perfusie stabiliteit te beoordelen. In een transplantatie model, kan de perfusie tijd korter om de opslag van energie op te laden en om de levensvatbaarheid van het orgaan te beoordelen. Klik hijopnieuw voor een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

1 Dieren

OPMERKING: Man Yorkshire varkens, 30-35 kg, werden gebruikt voor dit onderzoek. Alle dieren kregen humane zorg in overeenstemming met de 'Principles of Laboratory Animal Care' 'door de National Society for Medical Research en de' Gids voor de verzorging van proefdieren 'gepubliceerd door de National Institutes of Health geformuleerd. De Animal Care Committee van de Toronto General Research Institute keurden alle studies.

2 Organ Retrieval

  1. Huis mannelijke Yorkshire varkens in onderzoek Faciliteiten 1 week vóór perfusie / transplantatie om het niveau van stress en de dieren wennen aan de huisvesting. Minder dan 2 dagen woningen in de inrichting leidt tot een stress geïnduceerde fysische reactie, waarbij de perfusie van 22,23 uitkomst kan veranderen.
  2. Verdoven van varkensdoor een intramusculaire (im) injectie van een mengsel van ketamine (25 mg / kg), atropine (0,04 mg / kg), en midazolam (0,15 mg / kg).
  3. Voorafgaand aan de intubatie, zorgen voor de varkenshouderij ademt spontaan 2 L van O 2 gedoseerd met 5% isofluraan. Spuit de stembanden met 2% lidocaïne 2 min voor intubatie om stembanden krampen te vermijden. Bijvoorbeeld, voor een 35 kg in een varken 6,5 fr. tracheatube. Blokkeer de tracheale tube met 3-5 ml lucht in de ruimte.
  4. Na intubatie, gebruiken capnometrie om correcte intubatie te bevestigen. Verlaag de isofluraan gas naar 2%. Zet het beademingsapparaat 14-16 ademhalingen / min en een tidal volume van 10 ml / kg lichaamsgewicht.
  5. Plaats een 20 G intraveneus (iv) katheter in een van de oor aderen infusie van Ringer's lactaat (200 ml per uur) mogelijk. Dan scrub het varken en dek deze af met steriele doeken.
  6. Maak een middellijn incisie gevolgd door een linker laterale extensie. Gebruik een handdoek om grote en kleine darmen te dekken en verplaats deze naar de linkerkant.
  7. Aparte Inferior vena cava (IVC) en distale aorta van elkaar; Ligeer aorta takken naar achteren; isoleren en vrij nierslagaders van aanhechtend weefsel.
  8. Verdeel de falciforme ligament en de driehoekige ligament met cauterisatie.
  9. Laat de poortader door een incisie van het buikvlies tussen de alvleesklier en de poortader. Afhechten aderen drainage van de alvleesklier naar de poortader.
  10. Ontleden de coeliakie kofferbak onder de poortader en volg deze naar achteren naar de aorta. Omringen de mesenterica met een 2-0 gelijkspel; omringen de milt en de linker maag slagaders, welke tak posterieur aan de coeliakie kofferbak. Ontleden de coeliakie stam uit de poortader.
  11. De lymfevaten in de hepatoduodenale ligament ligeren aan lymfatische lekkage te voorkomen. Verdeel de juiste maag slagader tussen de banden. Afbinden kleinere aderen. Scheid de galwegen van het ligament en verdeel het distaal na ligatie.
  12. Ontleden de aorta achter het membraan tussen hart en coeliakie trunk; Plaats een 2-0 gelijkspel rond de aorta.
  13. Laat de lever uit de onderste cava op de rechterkant met electro cauterisatie; Gebruik schaar voor het bovenste gedeelte tussen cava en lever.
  14. Verwijder de galblaas en cauterize bleeders uit galblaas bed.
  15. Dien iv 1.000 IE / kg donor gewicht heparine. Voor een DCD-model, veroorzaken hartstilstand door intracardiale injectie van 40 mval KCl 3 min na heparinetoediening. Stel een hartstilstand als het beginpunt van warme ischemie.
  16. Voor de perfusie, verzamel 1,6 L varkensbloed in CPDA zakken (citraat, fosfaat, dextrose, adenosine) onmiddellijk na hartdood. Voer een zachte draai (2.000 xg zonder rem). Verwijder het plasma en de buffy coat onder steriele toestand (bioveiligheid kast klasse II) en bewaar de erytrocyten in CPDA zakken voor transfusie.
  17. Canule poortader en aorta met orgel flush lijnen. Bind de eerder ingestelde banden rond dijbeen, de nieren, de milt, het mesenterium, en links maag kunsteries evenals de bovenste aorta. Voor een hart beating donor (HBD) model, voert u de infusen van de aorta en de vena porta onder hartslag voorwaarden.
  18. Na 45 min warme ischemie, spoelt de lever met de University of Wisconsin (UW) oplossing met behulp van dual perfusie via de aorta (druk zak) en de poortader (de zwaartekracht aangedreven).
  19. Snij de lever van het varken, alle resterende vaartuigen lang verlaten.
  20. Tijdens het back-tafel voorbereiding, klem de bovenste IVC met een Satinský klem en spoel de lever een tweede keer met ongeveer 0,5 L van de UW-oplossing retrogradely via lagere IVC totdat de poortader uitstroom is duidelijk.
  21. Bind alle arteriële takken van de aorta en coeliakie stam. Voer een arteriële back-tafel druk perfusie met ongeveer 0,5 L van UW-oplossing.
  22. Spoel de galwegen met UW-oplossing.
  23. Canule de bovenste en onderste delen van het IVC met 1/2 "x 3/8" verloopstukken met Luer Lock; canule de poortader en de leverslagader met 3/8 "; x 1/4 "en 1/4" x 3/8 "verloopstukken met Luer Lock. Met de bovenste en onderste vena cava veneuze drainage.
  24. Leg de lever in een orgaan zak, sluit het orgel zak, en bewaar de lever op ijs tot de perfusie is begonnen.

3 Ex vivo leverperfusie

  1. Bereid de perfusie-oplossing die 2000 ml Steen oplossing, 400 ml gewassen erytrocyten, 550 mg natrium pyruvaat, 100 ml aminozuur-oplossing (10% Travasol), 10 mg calcium gluconaat, 1000 IE snelwerkende insuline, 1 g cefazoline, 500 mg metronidazol, en 10.000 IU heparine. Voeg andere moleculen voor vaatverwijding, immunosuppressie, wegvangen van schadelijke soorten, of levercel behandeling op basis van de specifieke studie-protocol.
  2. Voor de dialyse component, gebruikt standaard dialysaat bevattende 3,5 mM kalium, 25 mM bicarbonaat, 27 mM glucose, en 275 mg / L pyruvaat.
  3. Stel de perfusiecircuit (schema zie figuur 2).
    Figuur 2
    Figuur 2 Circuit opgezet. Vanuit het belangrijkste reservoir als het startpunt en het eindpunt wordt de perfusie-oplossing aangedreven door een centrifugaalpomp via een oxygenator. Vlak na de zuurstofvoorziening van de oplossing, het circuit splitst in een kleinere lijn loopt naar een kunstnier unit voor elektrolyt homeostase en een grotere lijn loopt naar een leukocyt filter voor de vermindering van de overgebleven witte bloedcellen (WBC). De oplossing die door de dialysator loopt terug naar de belangrijkste reservoir. Na de leukocyt filter, het circuit weer splitst in 2 gelijke regels. Een lijn loopt bij hoge druk (ongeveer 60 mmHg) direct in de aorta naar de leverslagader perfuseren. De andere lijn uitmondt in een tweede reservoir. Vanuit dit reservoir de poortader wordt doorbloed. De druk van het portaal perfusie afhankelijk van de hoogte energie van het reservoir oplossing niveau (ongeveer 2-6 mmHg). Alle vloeistoffen zijn drained via de infra en supra-lever cava terug in het belangrijkste reservoir. Voor de zwaartekracht reductie en homogene perfusie, is de lever in een zwembad gevuld met de temperatuur geregeld water. Het wordt gescheiden van het water door een ondoordringbare membraan en het zwemt in een perfusie schorsing. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
    1. Verzamel alle vloeistoffen van het circuit in een 3 L reservoir (belangrijkste reservoir) en klem de uitstroom.
    2. Sluit de uitstroom naar een centrifugaalpomp gevolgd door een commerciële oxygenator.
    3. Achter de oxygenator, splitsen de slang in 2 lijnen. Sluit de ene lijn naar een kunstnier en laat het terug in het belangrijkste reservoir. Sluit de tweede lijn naar een leukocyten reductie filter.
    4. Splitsen van de lijn na de leukocyten reductie filter in een arteriële lijn, die perfusie-oplossing levert aan de leverslagader, en een portaal venous lijn, waarmee perfusie-oplossing naar een tweede reservoir, dat uitmondt in de poortader door de zwaartekracht uitstroom. Klem de portal instroom.
    5. Sluit de arteriële lijn om een ​​vena cava lijn afwateren in het belangrijkste reservoir voor vloeistof herinnering.
    6. Voor het verzamelen van ascites of lekken van perfusievloeistof van de lever, stelt een zuigleiding aangesloten op het reservoir.
  4. Laat de uitstroom klem van het belangrijkste reservoir en vul het circuit met de perfusie-oplossing. Start de centrifugaalpomp bij 1.500 rondes / min. De perfusie oplossing zal rijden door de arteriële lijn in de vena cava lijn terug in het belangrijkste reservoir. Zorg ervoor dat alle lucht wordt verdreven van het circuit.
  5. Zet de gastoevoer naar de oxygenator.
  6. Neem de lever uit het ijs. Spoelen van de UW-oplossing met behulp van een zoutoplossing.
  7. Plaats de lever, met zijn convexe zijde naar de toegang tot de vaartuigen, idealiter in een zwaarteloze omgeving te vermijdenorgel compressie op het contactoppervlak. Gebruik een warmte-en koelbaar waterbad. Stel de starttemperatuur van het circuit en waterbad tot 20 ° C. Bedek het waterbad met ondoordringbaar membraan en leg de lever op dat membraan. Verminder de zwaartekracht gedreven compressie door onderdompeling van de lever met perfusie-oplossing.
  8. Verminder het toerental van de centrifugaal pomp 1000 rounds / min en telkens twee klemmen aan de aansluiting van arteriële en vena cava lijnen. Snij vervolgens de slang tussen de klemmen. Met behulp van een 3-weg connector, sluit zowel cava uitstroom en sluit ze aan op de vena cava lijn.
  9. Maak de klem van de arteriële lijn, giet perfusie-oplossing in de arteriële canule om zich te ontdoen van de bubbels, en sluit de lijn naar de canule. Verhoog de centrifugaalpomp tot 1.500 rondes / min. Maak de tweede klem van de vena cava lijn.
  10. Maak de klem van de portal veneuze reservoir om het te vullen. Laat perfusieoplossing giet het in het portaal cannula en sluit deze. Wees extra voorzichtig van stabiele vloeistof niveaus in het portaal reservoir.
  11. Sluit drukleidingen naar de Luer Sloten van de arteriële, portal, en vena cava canules.
  12. Om fysiologische omstandigheden na te bootsen, toegepast behandelingen in de juiste vat. Injecteer glucose in de poortader en niet in de arteriële lijn teneinde een gradiënt nabootsen een verhoogde portale veneuze glucose gradient en induceren glycogeensynthese 24,25 stellen.
  13. Nadat de lever om het circuit binnen 60 minuten verhogen van de temperatuur tot 33 ° C.
  14. Streven naar een arteriële beginnend stroom op ongeveer 250 ml / min bij 40 mmHg. Dit kan 700 ml / min bereikt tijdens perfusie zodra de druk wordt verhoogd tot 70 mmHg.
  15. Bij het starten van de temperatuur, te streven naar een poortader stroom van 500-600 ml / min bij 3-5 mmHg. Na het verhogen van de temperatuur, toezicht houden op de portal veneuze flow, die zal toenemen tot 1.100 ml / min bij 4-6 mmHg. Voorkom het overschrijden portal druk boven Physiological waarden (ongeveer 8 mmHg) sinusvormige fenestraties 26 beschermen. Te overschrijden totale stroom boven 2000 ml / min teneinde te beschadigen het orgel. Stel de uitstroom naar -2 mmHg door de belangrijkste reservoir laten zakken om de lever congestie door functionele obstructie te voorkomen.
  16. Voeg de dialyse component naar het circuit om de perfusievloeistof naar vooraf bepaalde waarden 27 evenwicht. Stel het dialysaat stroom tot 500 ml / uur. Wees extra aandacht aan de dialyse uitstroom te passen, zodat de perfusie-oplossing is noch verdund of geconcentreerd. Binnen het eerste uur van de perfusie van de belangrijkste reservoir zorgvuldig moet worden bekeken!
  17. Homogene zuurstofvoorziening van de weefsels te herstellen en te handhaven orgel functie met behulp van een grote gasmengsel onderdeel van O 2 (95-98%) en CO 2 (2-5%). Gebruik variabele gas tijdens perfusie sinds de lever verandert het metabolisme en de pH vraag tijdens perfusie.
  18. Houd een lage pH tijdens de start van deperfusie van organen te beschermen met de paradox pH begrip 28 en voorkomen ernstige weefselbeschadiging die kan ontstaan ​​door snel naar fysiologische pH onder reoxygenation, aangezien na opslag in UW-oplossing, het orgel acidose pH lager dan 7 Stel de partiële druk van CO 2 continu naar 25-30 mmHg zodat de pH een fysiologische niveau binnen 1 uur bereikt.
  19. Voeg natrium of kaliumbicarbonaat om het circuit een fysiologische concentratie standaard bicarbonaat in de perfusie-oplossing. Injecteren zorgvuldig onder repetitieve bloed gas en elektrolyt controle.
  20. Bewaken van de perfusie door periodieke veneuze en arteriële bloed gas-en AST-analyses. De veneuze PO 2 blijft boven 175 mmHg tijdens de perfusie. Monitor vasculaire flow en druk en noteer een stabiele perfusie door een constante vaatweerstand.
  21. Houd de perfusie systeem stabiel voor maximaal 8 uur. Aan het einde van het ex vivo perfusie periode koellangs de perfusie systeem 20 ° C en, na het loskoppelen van de slangen circuit van de lever, spoel de perfusievloeistof de lever tweevoudig met ijskoude UW-oplossing. Bewaar de lever opnieuw op ijs geplaatst in een steriele zak orgaan.

Representative Results

Hieronder worden de resultaten van 5 perfusie experimenten met DCD-grafts na 45 min warme- en 4 uur koude ischemie voor aanvang van de subnormothermic ex vivo perfusie.

Het belangrijkste doel van een ex vivo lever perfusie is om een voldoende toevoer van zuurstof naar de organen te waarborgen. Ischemie vasoconstrictie, waardoor de perfusie weerstand. Het bereiken van een constante vasculaire stromen met stabiele druk is een goede indicator van voldoende zuurstof. Tijdens een inductieperiode van 1-2 uur de perfusievloeistof en het orgel opgewarmd tot 33 ° C, waarbij de vasculaire weerstand van de lever overlijdt. Zodra de gewenste temperatuur van 33 ° C is bereikt, debietwaarden niveau op een constante, bijna fysiologische bereik voor de rest van de 6 uur perfusie tijd (figuren 3A-3D).

Tegelijkertijd, het orgaan wordt metabolisch actief. Figuur 4A toont de veneuze pO <sub> 2, een marker van zuurstofverbruik. In de eerste 2 uur veneuze pO 2 afziet constant plateau. Op dit metabolisch actieve toestand, begint de lever produceren gal (Figuur 4B). De dialysator een evenwichtig elektrolyt homeostase (Figuren 4C-4D). Een eerste hyperkaliëmie wordt snel genivelleerd. Online AST meting dient als controle van hepatocellulaire schade. Figuur 5 geeft alleen een ondiepe lineaire AST stijging ten opzichte van de gehele perfusie periode. H & E kleuring na 6 uur perfusie toont necrose <5% met een intacte lobulaire en sinusvormige structuur (figuur 6). PAS kleuring op hetzelfde tijdstip toont bijgevuld cellulair glycogeen opslag tegenover uitgeputte opslag in koud bewaard DCD-grafts (figuur 7).

Figuur 3
Figuur 3 Perfusie stromen en druk (n = 5, foutbalken tonen standaarddeviatie). (A, B) leverslagader (HA) stroom en een druk tijdens de opwarmfase in de eerste 1-2 uur, de stroom toeneemt met stabiele druk en daarna constant. Kijkend naar de dalende portale veneuze druk (C), kan de toename van HA stroom naar het einde van de perfusie een autoregulatoire reactie van de lever. (C, D) de portale veneuze (PV) stroom toename die overeenkomt met de HA stroom tijdens de eerste 2 uur van de aarde. De druk blijft relatief stabiel.

Figuur 4
Figuur 4 Monitoring parameters (n = 5, error bars tonen standaarddeviatie). (A) De veneuze pO 2 als marker van zuurstofverbruik en metabole activiteit verlaagt in de beginfase van opwarming door geactiveerde cellular de stofwisseling; blijft stabiel daarna (B) Bile productie als een marker van metabolische activiteit begint bij temperaturen rond 30 ° C en, derhalve, tussen de eerste en tweede uur van perfusie (C, D) de dialysator verzekert elektrolyt homeostase..; een eerste hyperkaliëmie is snel evenwicht.

Figuur 5
Figuur 5 AST (n = 5, foutbalken tonen standaarddeviatie) AST is een gevoelige merker van hepatocellulaire beschadiging.; de ondiepe toename suggereert geen significant letsel tijdens ex vivo perfusie.

Figuur 6
Figuur 6 H & E kleuring (20x vergroting). (A) Sham lever monster voor warme ischemie, een vertegenwoordiger lever lobule met intacte architecture. (B) lever monster na 45 minuten warme ischemie, 4 uur koude ischemie en 6 hr subnormothermic perfusie, de lobulaire architectuur intact zonder necrose en slechts minimale cellen zwellen, worden de sinusoïdale ruimten licht groter in vergelijking met de schijnvertoning monster.

Discussion

In een varken model dat DCD levertransplantatie nabootst, hebben we aangetoond dat subnormothermic lever perfusie met een mobiele perfusie oplossing resulteert in stabiele perfusie parameters, minimal hepatocyt- letsel, en actieve levermetabolisme. Onze subnormothermic perfusie opgezet heeft zich bewezen als een hepatocellulaire homeostase en de stofwisseling te herstellen. Glycogeenopslag wordt hersteld en metabolieten worden weggegooid.

Ex vivo perfusie als bewaarmethode techniek biedt voor het eerst de mogelijkheid om merkers van transplantaatfunctie en schade te bepalen gedurende orgaanpreservatie en voorafgaand aan de transplantatie. Naast de macroscopische beoordeling van de graft perfusie homogeniteit debietwaarden een goede indicator van de levensvatbaarheid van het transplantaat en de omvang van de ischemische schade 29 het eerder hebben geleden. Zuurstofverbruik en gal productie zijn markers van metabolische functie. Niveaus van leverenzymen zoals AST kan worden gebruikt om alsSess de mate en de dynamiek van hepatocellulair letsel 30. Deze grondige graft assessment kan een betrouwbaar onderscheid tussen transplanteerbare en niet-transplanteerbare marginale organen mogelijk te maken.

We kozen voor een subnormothermic temperatuur van 33 ° C in ons perfusiesysteem omdat de temperatuur voldoende om het metabolisme en ATP en glycogeensynthese mogelijk. Tegelijkertijd verschaft het een afgenomen zuurstofverbruik ten opzichte van normothermische perfusie instellingen die extra veiligheid tegen ischemisch letsel geeft. In het algemeen perfusie temperaturen boven 30 ° C is aangetoond dat koude ischemie minimaliseren en voldoende metabolische activiteit 31.

In tegenstelling tot andere groepen, hebben we geen volbloed gebruiken als perfusaat, maar een normo-osmotische oplossing van albumine (Steen) met gewassen en gefilterd rode bloedcellen. Door het uitsluiten van de plasma-componenten alsook trombocyten en leukocyten, de perfusie-oplossing is deondertekend om pro-inflammatoire signalering tijdens de ex vivo perfusie minimaliseren.

Naast het transplantaat beoordeling stabiele perfusie omstandigheden gedurende enkele uren staan ​​graft behandeling. Talrijke moleculen aangetoond reperfusieschade te verminderen onder experimentele omstandigheden 32. Er is echter bijna geen behandeling regime zijn weg naar de klinische praktijk gemaakt, maar toch. Een reden lijkt het ontnemen van die behandelingen toepassen tijdens het invriezen worden. Een metabolisch actief lever op een ex vivo perfusie systeem is optimaal voor de toepassing van elke vorm van behandeling. In dit verband niet alleen behandelingen reperfusie omstandigheden verbeteren zoals verzwakking van Kupffer celactiviteit of wegvangen van vrije radicalen zijn denkbaar, maar ook behandelingen zoals gentherapie aan het transplantaat, bijvoorbeeld tegen Hepatitis C herhaling conditioneren. Andere mogelijke strategieën kunnen zijn korting op steatose tijdens het ex vivo perfusieperiode 33.

Samengevat, ex vivo perfusie is een nieuwe strategie ter koude ischemie minimaliseren en marginale lever grafts voor levertransplantatie beoordelen. De ex vivo perfusie instelling biedt unieke kans om te herstellen en de conditie enten voorafgaand aan de transplantatie.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

De studie werd ondersteund door subsidies voor onderzoek van de Roche Organ Transplant Research Foundation (ROTRF) en Astellas. Markus Selzner werd ondersteund door een ASTS Career Development Award. Matthias Knaak werd gesteund door de Astellas Research Scholarship. Wij danken Uwe Mummenhoff en de familie in Birmingham voor hun genereuze steun.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
circuit Maquet (Hirrlingen, GER) custom made main reservoir (3 L, 3/8" outflow)
portal reservoir (1.5 L, 1/4", outflow)
centrifugal pump
oxygenator
lycocyte filter
Tubing (1/4" x 1/16") Raumedic (Helmbrechts, GER) MED7506
Tubing (3/8" x 3/32") Raumedic (Helmbrechts, GER) MED7536
Tubing connectors Raumedic (Helmbrechts, GER) various sizes
Dialysis filter, Optiflux F160NR Fresenius Medical Care (Waltham, MA) F160NR
STEEN solution XVIVO (Göteborg, SWE) 19004 2 L
Dialysis acid concentrate A Baxter (Mississauga, ON) D12188M 45 ml
Amino acid, Travasol 10% Baxter (Mississauga, ON) JB6760 100 ml
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) P2256 1.1 g
Heparin Sandoz Canada Inc (Toronto, ON) 10750 40,000 iU
Calcium gluconate Pharmaceutical Partners of Canada (Richmond Hill, ON) C31110 10 mg
Fast acting insulin various vendors 1,000 iU
Cefazoline various vendors 1 g
Metronidazole Baxter (Mississauga, ON) JB3401 500 mg

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. , Department of Health and Human Service, Organ Procurement and Transplantation Service. Available from: http://optn.transplant.hrsa.gov (2013).
  2. Qiu, J., Ozawa, M., Terasaki, P. I. Liver transplantation in the United States. Clinical Transplants. , 17-28 (2005).
  3. Maheshwari, A., Maley, W., Li, Z., Thuluvath, P. J. Biliary complications and outcomes of liver transplantation from donors after cardiac death. Liver Transpl. 13 (12), 1645-1653 (2007).
  4. Reich, D. J., Hong, J. C. Current status of donation after cardiac death liver transplantation. Curr Opin Organ Transplant. 15 (3), 316-321 (2010).
  5. Grewal, H. P., et al. Liver transplantation using controlled donation after cardiac death donors: an analysis of a large single-center experience. Liver Transpl. 15 (9), 1028-1035 (2009).
  6. Nguyen, J. H., et al. Long-term outcomes of donation after cardiac death liver allografts from a single center. Clin Transplant. 23 (2), 168-173 (2009).
  7. Heidenhain, C., et al. Incidence of and risk factors for ischemic-type biliary lesions following orthotopic liver transplantation. Transpl Int. 23 (1), 14-22 (2010).
  8. Moench, C., Uhrig, A., Lohse, A. W., Otto, G. CC chemokine receptor 5delta32 polymorphism-a risk factor for ischemic-type biliary lesions following orthotopic liver transplantation. Liver Transpl. 10 (3), 434-439 (2004).
  9. Iacob, S., et al. Genetic, immunological and clinical risk factors for biliary strictures following liver transplantation. Liver Int. 32 (8), 1253-1261 (2012).
  10. Heidenhain, C., Puhl, G., Moench, C., Lautem, A., Neuhaus, P. Chemokine Receptor-5Delta32 Mutation is No Risk Factor for Ischemic-Type Biliary Lesion in Liver Transplantation. J Transplant. , (2009).
  11. Hashimoto, K., et al. Use of tissue plasminogen activator in liver transplantation from donation after cardiac death donors. Am J Transplant. 10 (12), 2665-2672 (2010).
  12. Staib, W., Scholz, R. Stoffwechsel der perfundierten Leber. , Springer. (1968).
  13. Brauer, R. W. Liver. Annu Rev Physiol. 18, 253-278 (1956).
  14. Boehnert, M. U., et al. Normothermic acellular ex vivo liver perfusion reduces liver and bile duct injury of pig livers retrieved after cardiac death. Am J Transplant. 13 (6), 1441-1449 (2013).
  15. Guarrera, J. V., et al. Hypothermic machine preservation in human liver transplantation: the first clinical series. Am J Transplant. 10 (2), 372-381 (2010).
  16. Fondevila, C., et al. Hypothermic oxygenated machine perfusion in porcine donation after circulatory determination of death liver transplant. Transplantation. 94 (1), 22-29 (2012).
  17. Rougemont, O., et al. One hour hypothermic oxygenated perfusion (HOPE) protects nonviable liver allografts donated after cardiac death. Ann Surg. 250 (5), 674-683 (2009).
  18. Chung, W. Y., et al. Addition of a kidney to the normothermic ex vivo perfused porcine liver model does not increase cytokine response. J Artif Organs. 15 (3), 290-294 (2012).
  19. Brockmann, J., et al. Normothermic perfusion: a new paradigm for organ preservation. Ann Surg. 250 (1), 1-6 (2009).
  20. Hessheimer, A. J., Fondevila, C., García-Valdecasas, J. C. Extracorporeal machine liver perfusion: are we warming up. Curr Opin Organ Transplant. 17 (2), 143-147 (2012).
  21. Vogel, T., Brockmann, J. G., Friend, P. J. Ex-vivo normothermic liver perfusion: an update. Curr Opin Organ Transplant. 15 (2), 167-172 (2010).
  22. Swindle, M. M., Smith, A. C. Best practices for performing experimental surgery in swine. J Invest Surg. 26 (2), 63-71 (2013).
  23. Smith, A. C., Swindle, M. M. Preparation of swine for the laboratory. ILAR J. 47 (4), 358-363 (2006).
  24. Cywes, R., et al. Effect of intraportal glucose infusion on hepatic glycogen content and degradation, and outcome of liver transplantation. Ann Surg. 216 (3), 235-246 (1992).
  25. Ishida, T., et al. Differential effects of oral, peripheral intravenous, and intraportal glucose on hepatic glucose uptake and insulin and glucagon extraction in conscious dogs. J Clin Invest. 72 (2), 590-601 (1983).
  26. Morsiani, E., Aleotti, A., Ricci, D. Haemodynamic and ultrastructural observations on the rat liver after two-thirds partial hepatectomy. J Anat. 4 (Pt 4), 507-515 (1998).
  27. Schön, M. R., et al. Liver transplantation after organ preservation with normothermic extracorporeal perfusion. Ann Surg. 233 (1), 114-123 (2001).
  28. Currin, R. T., Gores, G. J., Thurman, R. G., Lemasters, J. J. Protection by acidotic pH against anoxic cell killing in perfused rat liver: evidence for a pH paradox. FASEB J. 5 (2), 207-210 (1991).
  29. Derveaux, K., et al. Does ex vivo vascular resistance reflect viability of non-heart-beating donor livers? Transplant Proc. 37 (1), 338-339 (2005).
  30. Guarrera, J. V., et al. Hypothermic Machine Preservation of Human Liver Allografts: Markers of Reperfusion Injury [abstract# 1282]. Am J Transpl. 7, Suppl 2. 476 (2007).
  31. Tolboom, H., et al. Subnormothermic machine perfusion at both 20°C and 30°C recovers ischemic rat livers for successful transplantation. J Surg Res. 175 (1), 149-156 (2012).
  32. Vollmar, B., Menger, M. D. The hepatic microcirculation: mechanistic contributions and therapeutic targets in liver injury and repair. Physiol Rev. 89 (4), 1269-1339 (2009).
  33. Jamieson, R. W., et al. Hepatic steatosis and normothermic perfusion-preliminary experiments in a porcine model. Transplantation. 92 (3), 289-295 (2011).

Tags

Geneeskunde , marginale enten DCD
Techniek van Subnormothermic<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Leverperfusie voor de opslag, Assessment, en reparatie van Marginal Lever Enten
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Knaak, J. M., Spetzler, V. N.,… More

Knaak, J. M., Spetzler, V. N., Goldaracena, N., Louis, K. S., Selzner, N., Selzner, M. Technique of Subnormothermic Ex Vivo Liver Perfusion for the Storage, Assessment, and Repair of Marginal Liver Grafts. J. Vis. Exp. (90), e51419, doi:10.3791/51419 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter