Summary
שתלי שוליים, כגון כבד שומני, שתלי מתורמים מבוגרים, או כבדים הוחזרו לאחר מוות לבבי (DCD) לסבול אחסון קונבנציונלי, קר סטטי רק בצורה גרועה. פיתחנו מודל חדשני של vivo לשעבר זלוף כבד subnormothermic לשימור, הערכה, ותיקון של שתלי כבד שוליים לפני ההשתלה.
Abstract
ההצלחה של השתלה כבד שהובילה למחסור באיברים דרמטי. ברוב אזורי השתלת 20-30% מהחולים ברשימת ההמתנה להשתלת כבד למות מבלי לקבל השתלת איברים או נמחקו להתקדמות מחלה. אסטרטגיה אחת כדי להגדיל את המאגר התורם היא הניצול של שתלים שוליים, כגון כבד שומני, שתלי מתורמים מבוגרים, או תרומה לאחר מוות לבבי (DCD). טכניקת השימור הנוכחית של אחסון סטטי הקר נסבלת רק בצורה גרועה על ידי כבדים שוליים וכתוצאה מכך לפגיעה באיברים משמעותית. בנוסף, אחסון איבר סטטי קר אינו מאפשר הערכת שתל או תיקון לפני ההשתלה.
חסרונות אלה של שימור סטטי הקר עוררו עניין בשימור איברי perfused חם כדי להפחית את פגיעת איסכמית קרה, להעריך שתלי כבד במהלך שימור, ולחקור את ההזדמנות כדי לתקן את הכבדים שוליים לפני ההשתלה. פרה האופטימליתנאים בטוחים וזרימה, טמפרטורת זלוף, הרכב של פתרון זלוף ואת הצורך במוביל חמצן היו שנויים במחלוקת בעבר.
למרות תוצאות מבטיחות בכמה מחקרים בבעלי חיים, את המורכבות ואת העלויות מנעו יישום קליני רחב יותר עד כה. לאחרונה, עם טכנולוגיה משופרת והבנה טובה יותר של פיזיולוגיה של כבד במהלך זלוף ex vivo התוצאה של זלוף כבד החם השתפרה וניתן להשיג תוצאות טובות באופן עקבי.
מאמר זה יספק מידע על שליפת כבד, טכניקות אחסון, וזלוף כבד המבודד בחזירים. אנו להמחיש) הדרישות כדי להבטיח אספקת חמצן מספיקה לאיבר, ב) שיקולים טכניים על המכונה זלוף ופתרון זלוף, וג) היבטים ביוכימיים של איברים מבודדים.
Introduction
השתלה כבד היא אפשרות הטיפול רק לחולים הסובלים ממחלת כבד סופנית או קרצינומה hepatocellular המתקדמת. ל25 השנים האחרונות, מספרם של מועמדי רשימת המתנה גדל בהדרגה ועלה על מספר השתלים הזמינים. מספר תורמי לב פועם ירד בעשור האחרון. במקביל, מספרם של שתלים שוליים, כגון תרומה לאחר המוות לבבי (DCD), כמו גם כבדים ישנים ושומן גדל 1,2.
שתלי שוליים לעתים קרובות ירדו להשתלת כבד בשל הסיכוי גבוה יותר של פונקציה שאינה או מתעכבת שתל העיקרי. בשתלי DCD, פיתוח חומרות סוג איסכמי מרה (ITBS) הוא דאגה מיוחדת. עם טכניקת השימור הקונבנציונלית סטטי הקרה, ITBS להתרחש בכ 10-40% משתלי DCD. ברוב המכריע של חולים, ITBS מוביל מחדש השתלה או מות חולה. במיוחד פעמים איסכמי חמות וקרות ממושכות הן סיכוןגורמים לITBS 3-7. גיל תורם, נטיות גנטיות (כגון דלתא CCR5 32), והבחירה של פתרון שימור יש גם דן כסיכון נוסף גורמי 7-10. microthrombosis החלקי של כלי peribiliary הוצע כמנגנון פוטנציאלי לITBS לאחר השתלה כבד עם DCD תל 11.
לקראת כניסתה הקלינית של השתלה כבד, vivo לשעבר הזלפות כבד היו בשימוש ללמוד את חילוף החומרים ופיזיולוגיה 12,13 כבד. לאחר השתלה כבד מצאה את דרכה לתוך ההגדרה הקלינית ב1960s, ניסיונות אין ספור נעשו כדי להשתמש ex vivo זלוף כבד כשיטת שימור על ידי חיקוי תנאי תזונה וחמצון פיסיולוגיים. השירות שלה לשמירה על שתלי שוליים נחקר בעשור האחרון, אבל זה לא הגיע לטיפול קליני סטנדרטי. לאחרונה תיארו הפחתה בפגיעה בצינור מרה בDהשתלה כבד CD ידי vivo לשעבר perfused שימור 14. גישות שונות בנוגע לפתרון זלוף נעשו. הבחירה נעה בין פתרונות סלולריים כמו כל דם מבעלי חי התורם או תאים אדומים ארוזים בשילוב עם פלזמה אנושית, לגישות acellular כמו אוניברסיטת מכונה של פתרון ויסקונסין, פתרון IGL, או פתרון Steen 14-19.
הטמפרטורה נעה בין C ° 4-37 20. המינוח בהיפותרמיה,, וnormothermic subnormothermic הוא מאוד משתנה ולא עקבי. כל טכניקות, פתרונות, והגדרות הטמפרטורה השונות שואפים ליום 1 בתנאים) יציבים זלוף, 2) חמצון מספיק, ו3) הקמתה מחדש של תפקוד איבר. יכולת שימור משופרת, כמו גם את היכולת של הערכת איברים וטיפול במהלך זלוף normothermic וsubnormothermic פרצופים מורכבות טכנית גבוהה יותר ועלויות בהשוואה לזלוף היפותרמיה 20,21.
פיתחנו vivo לשעבר מערכת זלוף כבד subnormothermic מעל 4 השנים האחרונות. המערכת יכולה לשמש ל1) "להטעין" תכולת אנרגיה בכבד, 2) כדי להעריך את האיכות של השתל, ועד 3) לתקן את הכבדים שוליים לפני ההשתלה. הפרוטוקול הבא מכיל את כל המידע לזלוף כבד יציב.
Protocol
סקירה סכמטי של הפרוטוקול מוצגת באיור 1.
פרוטוקול מחקר איור 1. עיצוב המחקר חזירי של פגיעה בכבד מבוסס על תרומה לאחר מוות לבבי מודל (DCD). לאחר הנתיחה של כל כלי הכבד, מוות לבבי מושרה ואחריו 45 דקות של איסכמיה שתל החמה. כדי לדמות תחבורת שתל בין בתי החולים התורם למקבל בסביבה קלינית, השתל מאוחסן על קרח למשך 4 שעות לאחר הדחה קרה, כפולה. לאחר הקירור, האיבר הוא perfused subnormothermic ל6 שעות על מנת להעריך את יציבות זלוף. במודל השתלה, זמן זלוף יכול להיות קצר יותר כדי להטעין אחסון אנרגיה ועל מנת להעריך את כדאיות האיבר. אנא לחץ הואמחדש כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
.1 בעלי חיים
הערה: חזירי זכר יורקשייר, 30-35 קילוגרם, שמשו למחקר זה. כל בעלי החיים קיבלו טיפול הומני בעמידה ב'העקרונות של מעבדה טיפול בבעלי חיים '' שנוסחו על ידי האגודה הלאומית למחקר רפואי ו'המדריך לטיפול בחי המעבדה '' שפורסם על ידי המכון הלאומי לבריאות. ועדת הטיפול בבעלי חיים של טורונטו הכללית מכון המחקר אישרה את כל המחקרים.
2 איברים אחזור
- חזירי יורקשייר זכר הבית במתקני מחקר לשבוע לפני זלוף / השתלה 1 ללהפחית את רמת המתח ולהרגיל את בעלי החיים לתנאי הדיור. פחות מ -2 ימים של דיור בתוך המתקן יביאו לתגובה פיזית שנגרם עקב מתח, אשר יכול לשנות את התוצאה של זלוף 22,23.
- הרדימי חזיריםעל ידי זריקה תוך שרירית (IM) של תערובת של קטמין (25 מ"ג / קילוגרם), אטרופין (0.04 מ"ג / קילוגרם), וmidazolam (0.15 מ"ג / קילוגרם).
- לפני אינטובציה, להבטיח את החזיר נושם באופן ספונטני 2 L של O 2 במינון עם isoflurane 5%. תרסיס מיתרי קול עם 2% לידוקאין 2 דקות לפני אינטובציה כדי למנוע התכווצויות מייתרי קול. לדוגמא, 35 קילוגרם חזיר לשימוש fr 6.5. צינור לקנה הנשימה. לחסום את הצינור לקנה הנשימה עם 3-5 מ"ל של אוויר חדר.
- לאחר אינטובציה, להשתמש capnometry כדי לאשר אינטובציה הנכונה. מנמיכים את גז isoflurane עד 2%. הגדר את מכונת ההנשמה ל14-16 נשימות / דקה ונפח של גאות ושפל של 10 מ"ל / קילוגרם משקל גוף.
- הנח 20 תוך ורידי G (iv) קטטר באחד מורידי האוזן כדי לאפשר עירוי של תמיסת חומצת החלב של רינגר (200 מ"ל לשעה). לאחר מכן לשפשף את החזיר ולכסות אותו בסדינים מעוקרים.
- לעשות חתך קו האמצע ואחריו סיומת לרוחב עזבה. השתמש במגבת כדי לכסות את בטן גדולה וקטנה ולהעביר אותם לצד השמאל.
- infe הנפרדוריד נבוב rior (IVC) ואב עורקי דיסטלי זה מזה; ענפי אב העורקים ולקשור לחלק האחורי; לבודד ועורקי כליות חופשיים מרקמות חסיד.
- מחלקים את רצועת falciforme ורצועה המשולשת באמצעות כויה.
- שחרר את וריד השער על ידי חתך של הצפק בין הלבלב ווריד שער. לקשור את עורקי ניקוז מהלבלב לוריד השער.
- לנתח את תא מטען צליאק מתחת לוריד השער ובצע אותה אחורה לאב העורקים. הקף את עורק mesenteric עם עניבה 2-0; מקיף את עורקי הקיבה הטחול ושמאל, שסניף בדיעבד לתא מטען צליאק. לנתח את תא מטען צליאק את וריד השער.
- לקשור את כלי הלימפה בתוך רצועת hepatoduodenal כדי למנוע דליפת הלימפה. מחלקים את עורק הקיבה הנכון בין קשרים. ולקשור ורידים קטנים יותר. הפרד את צינור המרה מהרצועה ולחלק אותו distally לאחר קשירה.
- לנתח את אב העורקים מאחורי הסרעפת בין הלב וTR צליאקתונק; מקום 2-0 עניבה סביב אב העורקים.
- שחרר את הכבד מהווריד התחתון בצד ימין בכוויית אלקטרו; להשתמש במספריים לחלק העליון בין קאווה וכבד.
- הסר את כיס המרה ולצרוב bleeders מהמיטה כיס מרה.
- לנהל iv 1,000 משקל תורם IU / קילוגרם של הפרין. למודל DCD, לגרום לדום לב על ידי הזרקת intracardial של 40 KCl 3 דקות mval לאחר מתן הפרין. דום לב מוגדר כנקודה של איסכמיה החמה ההתחלה.
- לזלוף, לאסוף 1.6 L של דם חזיר בשקיות CPDA (ציטראט, פוספט, דקסטרוז, אדנוזין) מייד לאחר מוות לבבי. בצע רך ספין (2,000 XG ללא בלמים). הסר את הפלזמה ומעייל באפי בתנאים סטריליים (בכיתה קבינט בטיחות הביולוגית II) ולאחסן את כדוריות הדם האדומים בשקיות CPDA לעירוי.
- וריד cannulate פורטל ואב עורקים עם קווי סומק איבר. לקשור את הקשרים שנקבעו בעבר סביב הירך, כליות, הטחול, mesenteric, ואמנות קיבה שמאלeries כמו גם אב העורקים העליונים. למודל לב פועם תורם (HBD), לבצע את cannulation של אב העורקים ווריד שער בתנאי פעימות לב.
- לאחר איסכמיה החמה 45 דקות, לשטוף את הכבד עם אוניברסיטת ויסקונסין פתרון (UW) באמצעות זלוף הכפול באמצעות אב העורקים (שקית לחץ) ווריד שער (כוח משיכה מונעת).
- חותך את הכבד מהחזיר, והשאיר את כל כלי הנותרים ארוכה.
- במהלך הכנת גב שולחן, מהדק את IVC העליון באמצעות Satinsky לצבוט ולשטוף את הכבד בפעם שנייה עם כ 0.5 L של פתרון UW retrogradely באמצעות IVC הנמוך עד יצוא וריד השער הוא ברור.
- לקשור את כל סניפי העורקים מתא מטען אב העורקים וצליאק. בצע זלוף לחץ דם גב שולחן עם כ 0.5 L של פתרון UW.
- רוקן את צינור המרה באמצעות פתרון UW.
- Cannulate חלקים העליונים ותחתונים של IVC באמצעות 1/2 "x" 3/8 הילוכים עם Luer נעילה; cannulate וריד השער ועורק כבד באמצעות 3/8 "; x 1/4 "ו1/4" x "3/8 הילוכים עם Luer נעילה. השתמש בוריד הנבוב העליון ותחתון כניקוז ורידים.
- מניחים את הכבד בשקית איבר, לסגור את שקית האיבר, ולאחסן את הכבד על קרח עד זלוף החל.
.3 Ex vivo כבד זלוף
- הכן את פתרון זלוף המכיל פתרון 2,000 מ"ל Steen, 400 מ"ל שטף אריתרוציטים, 550 פירובט מ"ג נתרן, 100 מ"ל אמין פתרון חומצה (10% טרבסול), 10 גלוקונאט מ"ג סידן, אינסולין בעל פעילות מהיר 1,000 IE, Cefazolin 1 גרם, metronidazol מ"ג 500, ו -10,000 IU הפרין. הוספת מולקולות אחרות לvasodilatation, דיכוי חיסוני, הדחה של מיני חמצן תגובתי, או טיפול בתאי כבד המבוסס על פרוטוקול מחקר המסוים.
- עבור רכיב הדיאליזה, להשתמש dialysate סטנדרטי המכיל 3.5 אשלגן מ"מ, 25 יקרבונט מ"מ, 27 גלוקוז מ"מ, כמו גם פירובט 275 מ"ג / ליטר.
- הגדר את מעגל זלוף (סכימה ראה איור 2).
איור 2 המעגל להגדיר. מגיע מהמאגר העיקרי כנקודת ההתחלה והסוף, פתרון זלוף הוא מונע על ידי משאבה צנטריפוגלית דרך oxygenator. מייד אחרי החמצון של הפתרון, במעגל מתפצל לקו קטן יותר פועל ליחידת dialyzer להומאוסטזיס אלקטרוליט וקו גדול יותר פועל לסינון ליקוציט להפחתה של תאי דם לבנים שריד (WBC). הפתרון שעובר dialyzer חוזר למאגר המרכזי. לאחר הסינון ליקוציט, המעגל מתפצל שוב ל2 קווים שווים. שורה אחת פועלת בלחץ גבוה (כ -60 מ"מ כספית) ישירות לתוך אב העורקים לינקבו עורק הכבד. הקו השני מנקז לתוך מאגר שני. ממאגר זה וריד הפורטל perfused. הלחץ של זלוף הפורטל תלוי באנרגית הגובה של רמת הפתרון של המאגר (בסביבות 2-6 מ"מ כספית). כל הנוזלים הם drained באמצעות infra- וקאווה על בכבד בחזרה למאגר המרכזי. להפחתת כוח הכבידה וזלוף הומוגנית, הכבד ממוקם בבריכה מלאה במים מוסדרים טמפרטורה. זה מופרד מהמים על ידי קרום חדיר ושהוא שוחה בהשעית זלוף. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.- לאסוף את כל הנוזלים מהמעגל ב3 מאגר L (מאגר עיקרי) ומהדק את יצוא.
- חבר את היציאה למשאבה צנטריפוגלית ואחריו oxygenator מסחרי.
- מאחורי oxygenator, לפצל את צינורות לתוך 2 שורות. חבר קו אחד לdialyzer ולנקז אותו בחזרה לתוך המאגר המרכזי. חבר את הקו השני למסנן הפחתת יקוציט.
- לפצל את הקו אחרי מסנן הפחתת יקוציט לשורה העורק, המספקת פתרון זלוף לעורק הכבד, ונ 'פורטלשורה בוגדנית ומספקת פתרון זלוף למאגר שני, שמנקז לתוך וריד השער ביצוא כוח משיכה. הצמד את זרימת הפורטל.
- חבר את קו העורקים לקו וריד נבוב מתנקז לתוך המאגר העיקרי לזכרון נוזל.
- לאוסף של מיימת או דליפה של פתרון זלוף מהכבד, להכין קו יניקה מחובר למאגר המרכזי.
- שחרר את מהדק יצוא מהמאגר הראשי ולמלא את המעגל עם פתרון זלוף. התחל משאבה צנטריפוגלית ב1,500 סיבובים / דקה. פתרון זלוף יניע דרך קו העורקים לתוך קו הווריד הנבוב בחזרה לתוך המאגר המרכזי. ודא שכל האוויר הוא מונע את המעגל.
- הפעל את אספקת הגז לoxygenator.
- קח את הכבד מהקרח. לשטוף את פתרון UW באמצעות מי מלח.
- מניחים את הכבד, עם הצד למטה הקמור שלה כדי להקל על הגישה לכלי השיט, באופן אידיאלי בסביבה נטולת כוח משיכה כדי להימנעדחיסת איבר במשטח המגע. השתמש באמבט מים תרמי וcoolable. הגדר את הטמפרטורה החל מהאמבטיה המעגל ומים ל20 מעלות צלזיוס. כסה אמבט מים עם קרום בלתי חדיר ומניח את הכבד על קרום ש. להפחית דחיסה מונעת כוח משיכה על ידי הצללה כבד עם פתרון זלוף.
- להפחית את המהירות של המשאבה צנטריפוגלית ל1,000 סיבובים / דקה ומניח את שני חבקים בחיבור של קווי קאווה עורקים ונבובים. לאחר מכן, חותך את צינורות בין מלחציים. שימוש במחבר 3 כיוונים, להצטרף שני היוצאות קאווה ולחבר אותם אל קו הווריד הנבוב.
- שחרר את המהדק מקו העורקים, לשפוך פתרון זלוף לצינורית העורקים להיפטר מבועות, וחבר את הקו לצינורית. להגדיל את המשאבה צנטריפוגלית ל -1,500 סיבובים / דקה. שחרר את המהדק השני מקו הווריד הנבוב.
- שחרר את המהדק ממאגר ורידי הפורטל כדי למלא אותו. בואו פתרון זלוף לשפוך לתוך cannu הפורטללה ולחבר אותו. קח טיפול מיוחד של מפלסי נוזלים יציבים במאגר הפורטל.
- חבר קווי לחץ למנעולים Luer של קנולה לעורקים, פורטל, והווריד נבוב.
- כדי לחקות את התנאים פיסיולוגיים, חלים טיפולים לכלי הנכון. הזרק את הגלוקוז לוריד השער ולא לתוך הקו העורק כדי להקים שיפוע מחקת שיפוע גלוקוז ורידים מוגבר פורטל וגרימת סינתזת גליקוגן 24,25.
- לאחר חיבור הכבד למעגל, להעלות את הטמפרטורה ל33 ° C בתוך 60 דקות.
- כוון זרימה מתחילה עורקים בכ -250 מ"ל / דקה ב40 מ"מ כספית. זה עשוי להגיע 700 מ"ל / דקה במהלך זלוף פעם הלחץ מוגבר עד 70 מ"מ כספית.
- בהתחלת טמפרטורה, לשאוף לזרימת וריד שער של 500-600 מ"ל / דקה ב3-5 מ"מ כספית. לאחר העלאת הטמפרטורה, לפקח על הזרימה ורידית הפורטל, אשר תגדיל עד 1,100 מ"ל / דקה ב4-6 מ"מ כספית. הימנע מלחץ פורטל עולה מעל physiologicaערכי l (בסביבות 8 מ"מ כספית) כדי להגן על fenestrations סינוסי 26. לא לחרוג זרימה כוללת מעל 2,000 מ"ל / דקה על מנת למנוע נזק לאיברים. הגדר את יצוא ל-2 מ"מ כספית על ידי הפחתת המאגר העיקרי למניעת גודש בכבד על ידי חסימת יצוא פונקציונלית.
- הוסף את רכיב הדיאליזה למעגל כדי לאזן את פתרון זלוף לערכים שנקבעו מראש 27. הגדר את זרימת dialysate 500 מ"ל / שעה. קח לתשומת לב מיוחדת כדי להתאים את תזרים הדיאליזה, כך שפתרון זלוף הוא לא מדולל ולא מרוכז. בתוך השעה הראשונה של זלוף המאגר המרכזי יש לצפות בזהירות!
- ודא חמצון הומוגנית של הרקמות להתאושש ולשמור על תפקוד איברים על ידי שימוש ברכיב תערובת הגז עיקרי של O 2 (95-98%) וCO 2 (2-5%). השתמש בגז משתנה במהלך זלוף מאז הכבד משנה את חילוף החומרים שלו וביקוש pH שלה במהלך זלוף.
- לשמור על pH נמוך בתחילהזלוף על מנת להגן על האיברים באמצעות מושג pH הפרדוקס 28 ולמנוע נזק לרקמות קשות שיכולים להיגרם כתוצאה מחיבורים מהירים לpH הפיזיולוגי תחת reoxygenation, שכן לאחר האחסון בפתרון UW, האיבר יש pH חומציים להלן .7 התאם את הלחץ החלקי של CO 2 ברציפות עד 25-30 מ"מ כספית, כך שpH יגיע לרמה פיזיולוגית בתוך שעה 1.
- הוספת סודה לשתיית sodium- או אשלגן למעגל כדי להשיג ריכוז פיסיולוגי של יקרבונט הסטנדרטי בפתרון זלוף. הזרק אותה בזהירות מתחת לגז דם החוזר ונשנה ושליטה אלקטרוליט.
- צג זלוף על ידי גז תקופתי ורידים ועורקי דם וAST ניתוחים. PO ורידי 2 נשאר מעל 175 מ"מ כספית במהלך זלוף. לעקוב אחר זרימה ולחץ של כלי דם ולב זלוף יציב על ידי התנגדות של כלי דם קבוע.
- לשמור על מערכת זלוף יציב לתקופה של עד 8 שעות. בסופו של vivo לשעבר תקופה זלוף, מגניבאת מערכת זלוף ל20 מעלות צלזיוס ו, לאחר ניתוק צינורות של המעגל מהכבד, לשטוף את פתרון זלוף את הכבד dually עם פתרון UW הקר כקרח. אחסן את הכבד הניח שוב על קרח בשקית איבר סטרילי.
Representative Results
להלן, אנו מציגים את התוצאות של 5 ניסויים זלוף עם DCD-שתלים לאחר 45 חמים תלויים דקות ואיסכמיה 4 שעות קרות לפני תחילת subnormothermic לשעבר vivo זלוף.
המטרה העיקרית לזלוף כבד vivo לשעבר היא להבטיח אספקת חמצן מספיקה לאיבר. איסכמיה גורמת התכווצות כלי דם, ובכך להגדיל את התנגדות זלוף. השגת תזרים כלי דם מתמיד עם לחצים יציבים היא אינדיקטור טוב של חמצון נאות. במהלך תקופת גיוס של 1-2 hr פתרון זלוף והאיבר הם חיממו עד 33 ° C, אשר deceases התנגדות כלי הדם של הכבד. ברגע שטמפרטורת היעד של 33 ° C מושגת, זרימת ערכי רמה בטווח קבוע, כמעט פיסיולוגי לשאר זמן 6 שעות זלוף (ציורים A3-3D).
באותו הזמן, האיבר הופך מטבולית פעיל. איור 4 א מציג את PO הוורידים <תת> 2, סמן של צריכת חמצן. בתוך שעה 2 הראשונית PO 2 ירידות ורידים לרמה קבועה. במדינת מטבולית פעילה זה, הכבד מתחיל לייצר מיצי מרה (איור 4). Dialyzer מספק הומאוסטזיס מאוזן אלקטרוליט (איורים 4C-4D). היפרקלמיה ראשונית התיישר במהירות. מדידת AST מקוונת משמשת כניטור של נזק hepatocellular. איור 5 מציג עליית AST יניארי רדודה רק לאורך כל תקופת זלוף. H & E הכתמה לאחר 6 שעות של זלוף מגלה נמק הפטוציט <5% עם אונתית שלמה ומבנה סינוסי (איור 6). צביעת PAS באותה נקודת זמן תערוכות מתחדשת אחסון גליקוגן סלולארי בהשוואה לאחסון מותש בDCD-תלים קרים השתמרו (איור 7).
איור 3 תזרים זלוף ולחץ (n = 5, ברים שגיאה להראות סטיית תקן). (A, B) עורק כבד (HA) לזרום ולחץ: בשלב ההתחממות ב1-2 שעות הראשונות, זרימת העליות בלחצים יציבים וקבועות לאחר מכן. כאשר מסתכל על לחץ ורידי הפורטל יורד (C), הגידול של זרימת HA לקראת סוף זלוף עשוי להיות תגובת autoregulatory של הכבד. (C, D) ורידי הפורטל מגביר את הזרימה (PV) התואם את זרימת HA במהלך 2 שעות הראשונות של ההתחממות. הלחצים להישאר יציבים יחסית.
.4 פרמטרים ניטור איור (n = 5, ברים שגיאה להראות סטיית תקן). () PO ורידי 2 כסמן של צריכת חמצן ופעילות מטבולית יורד במסגרת השלב הראשוני של ההתחממות בשל cellula מופעלחילוף חומרים r; הוא נשאר יציב לאחר מכן ייצור מרה (ב ') כסמן של פעילות המטבולית מתחיל בטמפרטורות סביב 30 מעלות צלזיוס, ולכן, בין השעה הראשונה והשנייה של זלוף (C, D) dialyzer מבטיח הומאוסטזיס אלקטרוליט..; היפרקלמיה ראשונית היא מאוזנת במהירות.
AST .5 איור (n = 5, ברים שגיאה להראות סטיית תקן) AST הוא סמן רגיש של פגיעת hepatocellular.; הגידול הרדוד מרמז אין פגיעה משמעותית במהלך זלוף ex vivo.
איור 6 H & E מכתימה (הגדלה 20X). (א) מדגם כבד שאם לפני איסכמיה החמה, lobule כבד נציג אחד עם אדריכלי ללא פגעדואר. מדגם (B) כבד לאחר 45 דקות של איסכמיה החמה, 4 שעות של איסכמיה הקרה, ו6 שעות של זלוף subnormothermic, ארכיטקטורת אונתית היא שלמה ללא נמק ורק נפיחות תא מינימאלית, חללי סינוסי מורחבים במתינות בהשוואה ל מדגם דמה.
Discussion
במודל חזיר המחקה השתלה כבד DCD, הראינו כי זלוף כבד subnormothermic עם תוצאות פתרון זלוף סלולריות בפרמטרים יציבים זלוף, פציעת הפטוציט מינימאלית, וחילוף חומרים בכבד פעיל. זלוף subnormothermic שלנו להגדיר הוכיח להתאושש הומאוסטזיס וחילוף חומרי hepatocellular. אחסון גליקוגן משוחזר ומטבוליטים מבוטלים.
Ex vivo זלוף הכבד כטכניקת שימור מציע בפעם הראשונה את ההזדמנות כדי להעריך סמנים של תפקוד שתל ופגיעה במהלך שימור איברים ולפני ההשתלה. לצד ההערכה מקרוסקופית של הומוגניות זלוף השתל, זרימת ערכים לספק אינדיקציה טובה של הכדאיות של השתל ואת מידת פגיעת איסכמית שספג קודם לכן 29. צריכת חמצן וייצור מיצי מרה הם סמנים של תפקוד מטבולים. רמות של אנזימי כבד כמו AST יכולות לשמש כלsess התואר ודינמיקה של פגיעת hepatocellular 30. הערכת שתל יסודית זה עשויה לאפשר אפליה אמינה בין איברים להשתלה שוליים ולא להשתלה.
בחרנו טמפרטורת subnormothermic של 33 מעלות צלזיוס במערכת זלוף כי הטמפרטורה היא מספיק כדי לאפשר את חילוף החומרים, כמו גם ATP וסינתזה של גליקוגן. במקביל, היא מספקת ירידה בביקוש חמצן בהשוואה להגדרות זלוף normothermic המספק בטיחות נוספת מפני פגיעת איסכמית. באופן כללי, טמפרטורות זלוף מעל 30 מעלות צלזיוס הראו לשם צמצום פגיעת איסכמית קרה ולספק את פעילות חילוף חומרים מספיקה ביום 31 ב.
בניגוד לקבוצות אחרות, אנחנו לא משתמשים בכל הדם כperfusate, אבל פתרון normo-האוסמוטי אלבומין (Steen) עם תאי דם אדום שטופים ומסוננים. על ידי נטרול רכיבי הפלזמה, כמו גם טרומבוציטים ולויקוציטים, פתרון זלוף הוא דהחתם כדי למזער איתות הפרו דלקתית במהלך זלוף ex vivo.
בנוסף להערכת השתל, תנאי זלוף יציבים לאורך כמה שעות יאפשר טיפול שתל. מולקולות רבות הראו להפחתת עוצמת פגיעת reperfusion תחת תנאי ניסויים 32. עם זאת, כמעט ולא משטר טיפול עשה את דרכה לתוך פרקטיקה קלינית, עדיין. נראית סיבה אחת להיות חוסר ההזדמנות ליישם טיפולים אלה במהלך אחסון קר. כבד מטבולית פעיל בvivo לשעבר מערכת זלוף הוא אופטימלי ליישום בכל סוג של טיפול. בהקשר זה, לא רק טיפולים לשיפור תנאי reperfusion כמו הנחתה של פעילות תאי Kupffer או הדחה של מיני חמצן תגובתי הם על הדעת, אלא גם טיפולים כמו ריפוי גנטי להתנות את השתל, למשל, נגד הישנות הפטיטיס C. אסטרטגיות פוטנציאליות אחרות יכולות לכלול הפחתה בsteatosis במהלך זלוף vivo לשעברתקופת 33.
לסיכום, לשעבר vivo זלוף הכבד הוא אסטרטגיה חדשנית לצמצום פגיעת איסכמית קרה ולהעריך שתלי כבד שוליים לפני ההשתלה כבד. הגדרת זלוף vivo לשעבר מספקת הזדמנות ייחודית לתקן ושתלי מצב לפני ההשתלה.
Disclosures
יש לי המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחקר נתמך על ידי מענקי מחקר של השתלות האיברים רוש קרן מחקר (ROTRF) וAstellas. מרקוס Selzner נתמכה פיתוח פרס ASTS קריירה על ידי. מתיאס Knaak נתמכה על ידי מלגות מחקר Astellas. אנו מודים Uwe Mummenhoff והמשפחה ברמינגהאם על תמיכתם הנדיבה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| circuit | Maquet (Hirrlingen, GER) | custom made | main reservoir (3 L, 3/8" outflow) portal reservoir (1.5 L, 1/4", outflow) centrifugal pump oxygenator lycocyte filter |
| Tubing (1/4" x 1/16") | Raumedic (Helmbrechts, GER) | MED7506 | |
| Tubing (3/8" x 3/32") | Raumedic (Helmbrechts, GER) | MED7536 | |
| Tubing connectors | Raumedic (Helmbrechts, GER) | various sizes | |
| Dialysis filter, Optiflux F160NR | Fresenius Medical Care (Waltham, MA) | F160NR | |
| STEEN solution | XVIVO (Göteborg, SWE) | 19004 | 2 L |
| Dialysis acid concentrate A | Baxter (Mississauga, ON) | D12188M | 45 ml |
| Amino acid, Travasol 10% | Baxter (Mississauga, ON) | JB6760 | 100 ml |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | P2256 | 1.1 g |
| Heparin | Sandoz Canada Inc (Toronto, ON) | 10750 | 40,000 iU |
| Calcium gluconate | Pharmaceutical Partners of Canada (Richmond Hill, ON) | C31110 | 10 mg |
| Fast acting insulin | various vendors | 1,000 iU | |
| Cefazoline | various vendors | 1 g | |
| Metronidazole | Baxter (Mississauga, ON) | JB3401 | 500 mg |
References
- , Department of Health and Human Service, Organ Procurement and Transplantation Service. Available from: http://optn.transplant.hrsa.gov (2013).
- Qiu, J., Ozawa, M., Terasaki, P. I. Liver transplantation in the United States. Clinical Transplants. , 17-28 (2005).
- Maheshwari, A., Maley, W., Li, Z., Thuluvath, P. J. Biliary complications and outcomes of liver transplantation from donors after cardiac death. Liver Transpl. 13 (12), 1645-1653 (2007).
- Reich, D. J., Hong, J. C. Current status of donation after cardiac death liver transplantation. Curr Opin Organ Transplant. 15 (3), 316-321 (2010).
- Grewal, H. P., et al. Liver transplantation using controlled donation after cardiac death donors: an analysis of a large single-center experience. Liver Transpl. 15 (9), 1028-1035 (2009).
- Nguyen, J. H., et al. Long-term outcomes of donation after cardiac death liver allografts from a single center. Clin Transplant. 23 (2), 168-173 (2009).
- Heidenhain, C., et al. Incidence of and risk factors for ischemic-type biliary lesions following orthotopic liver transplantation. Transpl Int. 23 (1), 14-22 (2010).
- Moench, C., Uhrig, A., Lohse, A. W., Otto, G. CC chemokine receptor 5delta32 polymorphism-a risk factor for ischemic-type biliary lesions following orthotopic liver transplantation. Liver Transpl. 10 (3), 434-439 (2004).
- Iacob, S., et al. Genetic, immunological and clinical risk factors for biliary strictures following liver transplantation. Liver Int. 32 (8), 1253-1261 (2012).
- Heidenhain, C., Puhl, G., Moench, C., Lautem, A., Neuhaus, P. Chemokine Receptor-5Delta32 Mutation is No Risk Factor for Ischemic-Type Biliary Lesion in Liver Transplantation. J Transplant. , (2009).
- Hashimoto, K., et al. Use of tissue plasminogen activator in liver transplantation from donation after cardiac death donors. Am J Transplant. 10 (12), 2665-2672 (2010).
- Staib, W., Scholz, R. Stoffwechsel der perfundierten Leber. , Springer. (1968).
- Brauer, R. W. Liver. Annu Rev Physiol. 18, 253-278 (1956).
- Boehnert, M. U., et al. Normothermic acellular ex vivo liver perfusion reduces liver and bile duct injury of pig livers retrieved after cardiac death. Am J Transplant. 13 (6), 1441-1449 (2013).
- Guarrera, J. V., et al. Hypothermic machine preservation in human liver transplantation: the first clinical series. Am J Transplant. 10 (2), 372-381 (2010).
- Fondevila, C., et al. Hypothermic oxygenated machine perfusion in porcine donation after circulatory determination of death liver transplant. Transplantation. 94 (1), 22-29 (2012).
- Rougemont, O., et al. One hour hypothermic oxygenated perfusion (HOPE) protects nonviable liver allografts donated after cardiac death. Ann Surg. 250 (5), 674-683 (2009).
- Chung, W. Y., et al. Addition of a kidney to the normothermic ex vivo perfused porcine liver model does not increase cytokine response. J Artif Organs. 15 (3), 290-294 (2012).
- Brockmann, J., et al. Normothermic perfusion: a new paradigm for organ preservation. Ann Surg. 250 (1), 1-6 (2009).
- Hessheimer, A. J., Fondevila, C., García-Valdecasas, J. C. Extracorporeal machine liver perfusion: are we warming up. Curr Opin Organ Transplant. 17 (2), 143-147 (2012).
- Vogel, T., Brockmann, J. G., Friend, P. J. Ex-vivo normothermic liver perfusion: an update. Curr Opin Organ Transplant. 15 (2), 167-172 (2010).
- Swindle, M. M., Smith, A. C. Best practices for performing experimental surgery in swine. J Invest Surg. 26 (2), 63-71 (2013).
- Smith, A. C., Swindle, M. M. Preparation of swine for the laboratory. ILAR J. 47 (4), 358-363 (2006).
- Cywes, R., et al. Effect of intraportal glucose infusion on hepatic glycogen content and degradation, and outcome of liver transplantation. Ann Surg. 216 (3), 235-246 (1992).
- Ishida, T., et al. Differential effects of oral, peripheral intravenous, and intraportal glucose on hepatic glucose uptake and insulin and glucagon extraction in conscious dogs. J Clin Invest. 72 (2), 590-601 (1983).
- Morsiani, E., Aleotti, A., Ricci, D. Haemodynamic and ultrastructural observations on the rat liver after two-thirds partial hepatectomy. J Anat. 4 (Pt 4), 507-515 (1998).
- Schön, M. R., et al. Liver transplantation after organ preservation with normothermic extracorporeal perfusion. Ann Surg. 233 (1), 114-123 (2001).
- Currin, R. T., Gores, G. J., Thurman, R. G., Lemasters, J. J. Protection by acidotic pH against anoxic cell killing in perfused rat liver: evidence for a pH paradox. FASEB J. 5 (2), 207-210 (1991).
- Derveaux, K., et al. Does ex vivo vascular resistance reflect viability of non-heart-beating donor livers? Transplant Proc. 37 (1), 338-339 (2005).
- Guarrera, J. V., et al. Hypothermic Machine Preservation of Human Liver Allografts: Markers of Reperfusion Injury [abstract# 1282]. Am J Transpl. 7, Suppl 2. 476 (2007).
- Tolboom, H., et al. Subnormothermic machine perfusion at both 20°C and 30°C recovers ischemic rat livers for successful transplantation. J Surg Res. 175 (1), 149-156 (2012).
- Vollmar, B., Menger, M. D. The hepatic microcirculation: mechanistic contributions and therapeutic targets in liver injury and repair. Physiol Rev. 89 (4), 1269-1339 (2009).
- Jamieson, R. W., et al. Hepatic steatosis and normothermic perfusion-preliminary experiments in a porcine model. Transplantation. 92 (3), 289-295 (2011).
