Abstract
마우스는 종종 때문에 가능한 형질 전환 마우스 및 시약의 넓은 범위에 이식 면역학의 연구에서 심장 이식 기증자와받는 사람으로 사용됩니다. 어려움으로 인해 동물의 작은 크기와 심장 이식에 포함 된 미세의 상당한 기술적 과제로 제시된다. 특히, 초기 이식 후 기술적 인 실패의 높은 비율은받는 사람의 죽음과 같은 뒷다리 마비 또는 비 심장 박동 같은 수술 후 합병증이 발생할 수 있습니다. 여기에, 이소성 마우스 심장 이식을위한 완전한 기술은받는 사람 마우스로 기증자의 마음과 그 이후의 주입을 수확 포함, 보여줍니다. 기증자의 심장은 바로 상행 대동맥과 폐동맥의 차가운 헤파린 식염수와 절개와 현장 관류에 다음 수확한다. 받는 사람의 동작은 다음에, 복부 대동맥과 하대 정맥 (IVC)의 준비를 포함단일 실행 10-0 microsuture 사람과받는 사람 IVC와 기증자 폐동맥 비슷한 문합을 사용하여받는 사람의 대동맥을 가진 기증자의 대동맥의 엔드 - 투 - 측 문합. 수술 후 동물은 0.6 ㎖의 생리 식염수를 피하 주사하고 37 ° C에서 가열 패드에 복구 할 수 있습니다. 227 마우스의 심장 이식의 결과는 86.8 %의 48 시간에서 성공률 요약되어있다. 15 (6.6 %)이 48 시간 이내에 사망하는 동안 48 시간 내에 13.2 %의 실패, 5 (2.2 %), 허혈성 손상 및 / 또는 혈전증 접목에 의한 비 심장 박동을했다 뒷다리 마비, 10 (4.4 %)을 경험 .
Introduction
장기 이식 동물 모델은 임상 이식 환자의 치료를 개선하기위한 가치있는 정보를 제공 할 수있다. 마우스 모델에 의한 유전자 변형 쥐와 다른 동물 모델 1-3을 사용할 수 없습니다 생쥐의 특정 시약의 넓은 범위에 장기 이식 거부 나 수용의 면역 메커니즘을 연구하는데 특히 유용하다. 이식 마우스 모델 도전은 만족스러운 결과를 달성하기 위해 상당한 전문적인 기술을 필요로하는 기증자와받는 사람의 작은 크기입니다.
기술은 첫 번째 이후 코리 등 (5)에 의해 마우스의 심장 이식을 위해 적응 된 쥐 4 마음의 이소성 이식에 대해 설명했다. 이 기술은 전에 기증자의 작업에 대한받는 사람과 이식 된 심장 또는 t의 생존을 손상 할 가능성이 둘 중 기증자의 심장, 전혀 살포를 준비하고 참여그가받는 사람. 원래 이식 거부와 관용 6-8의 메커니즘을 조사하는 바와 같은 절차는 널리 사용되어왔다. 기타 마우스 9,10 심장 이식 오노와 린지의 원래 쥐의 심장 이식 절차를 적용했다. 최근 기술은 코리 등 11의 방법과 관련된 몇 가지 문제를 극복 마우스 심장 이식 출판되었다. 프로토콜은 여기에 설명 포함 모트 람 등 (12)의 방법에 따라 트립 변형, 통합 : 시츄 관류 차가운 헤파린 식염수로 즉시 개흉술 후 수신자 동작 시간을 최소화하기 위해받는 운전 이전 도너 동작을 수행한다. 또한, 우리는 작은 atraumatic 혈관 클램프 대신 6-0 실크 넥타이를 사용합니다. 혈관 클램프가 더 많은 공간을 복용의 단점이 있지만 그들은 너무 빡빡하거나 느슨하게해서는 안되는, 넥타이보다 제어하기가 쉽습니다및 클램프보다 제거 덜 간단합니다. 초기 학습에 대한 대안이 봉합의 균일 성을 보장하고, 따라서 문 합의 개통하는 근위 및 원위 모서리에 숙박 봉합사를 사용하는 스테이지 있지만, 우리의 방법은, 혈관 문합을위한 실행중인 하나의 봉합사를 사용합니다.
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Protocol
이전 실험의 시작에, 계획 한 실험에 대한 관련 기관의 동물 관리 윤리위원회의 승인을 얻을 수 있습니다. 교육 기관의 요구 사항에 따라 쥐를 유지한다. 다음 프로토콜은 시드니 대학과 로얄 프린스 알프레드 병원위원회에 의해 승인되었습니다.
이전에 수술을 시작으로, 모든 장비는 철저하게 청소해야하고 80 % 에탄올에 담가 살균. 일부 기관은 그러나이 장기간에 걸쳐 미세 미세 수술 장비를 손상시킬 수있는 고압 증기 멸균을 규정. 가능하면 사용 멸균 일회용 장비.
1. 마취
- 밀폐 된 용기에 이소 플루 란으로 마우스를 마취 한 후 신속하게 마취 코 콘을 연결, 운영 칠판에 부정사 배치합니다. 더 반사가 없도록하기 위해 뒷발을 곤란하게하여 마취의 시험 적정성.
- 수술 칼날로 피부를 면도80 % 에탄올로 소독. 또, 70 % 이소 프로필 알코올 2 % 클로르헥시딘 피부 소독을 위해 사용될 수있다. 마취 유도시 이소 플루 란 농도는 3 %이지만, 유지 보수를 위해 1.5 %에이를 줄일 수 있습니다. 일반 호흡과 심장 박동을 유지하기 위해이 농도에 약간의 조정을합니다. 가열 패드에 동물의 온도를 유지한다.
2. 기부자 운영
- 가슴 벽의 플랩을 형성하는 흉부의 검상 부부의 수준에서 가로 컷 다음에 겨드랑이에 리브의 가장자리에서 흉곽의 양쪽을 통해 가슴을 절단하여 심장과 혈관을 노출하는 개흉술을 확인합니다. 머리 옆이 플랩을 올리고 운영 보드에 핀. 심장과 혈관을 노출 심낭을 벗겨.
- 한 손과 IVC를 통해 마음에 다른 주사 1 ㎖ 차가운 헤파린 식염수 근위부와 집게로 하대 정맥을 들어 올린 다음 예방과하는 IVC에 작은 동맥 클램프를 넣어다시 바늘 구멍을 통해 관류 액의 T 흐름.
- 거즈와 면봉을 사용하여, 상행 대동맥과 폐동맥을 노출 아래로 마음을 철회. 대동맥과 폐동맥의 번들 채널 (가로 동) 후부를 통해 microscissors 한 쌍 중 하나 블레이드를 전달하고 문합에 충분한 길이를 확보하기까지 원심 가능한 한 함께 대동맥과 폐동맥을 절단.
- 넥타이와 IVC 오른쪽 우수한 대정 맥 (SVC)에 나누어은 6-0 실크 실을 사용하여 SVC 및 폐 혈관을 떠났다. 별도로 IVC 오른쪽 SVC를 연결 한 후 폐 혈관과 함께 왼쪽 SVC를 둘러싸고을 묶어 심장에 단일 스레드의 후방 배치합니다. 이식 될 때까지 4 ° C에서 저온 멸균 식염수에 보관 한 후, 관계에 말초 혈관을 절단하여 기증자 사이트에서 마음을 수확. 이 일어난 과다 출혈로 기증자의 사망을 초래한다.
3.받는 작업
- 마취(섹션 1) 상기와받는 사람. 조심스럽게 견인기를 형성하기 위해 절곡 흉부의 검상 부부와 종이 클립을 사용하여 철회 치골의 중간 선 절개 개복술을 한 후, 자극을 방지하기 위해 복부를 면도. 따뜻한 멸균 식염수 적신 거즈로 장을 감싸고 복부의 오른쪽 상단에 철회.
- 인프라 신장 대동맥과 IVC를 노출하려면 소작 장치를 사용하여 허리 혈관에서 그들을 나누어 장골 분기에 왼쪽 신장 동맥과 정맥에서 대동맥과 IVC의 번들 세그먼트를 무료. 소작 정확한 온도와 용기의 끝을 분할하고 밀봉 할 수있는 충분한 시간을 사용하는 것을주의하십시오.
- 대동맥 및 원심과 근위 IVC 세그먼트에 작은 atraumatic 혈관 클램프를 적용합니다. 제 30 G 바늘 구멍을 천공하여 대동맥의 전방 벽에 절개를; 다음 기증자의 대동맥의 크기에 맞게 microscissors 수직으로 절개를 잘라. 모든 BL을 제거하기 위해 헤파린 식염수로 대동맥 루멘을 세척짐 우드 혈전.
- 차가운 식염수에 적신 거즈로 덮여받는 사이트에 기증자의 심장을 가지고 복부의 오른쪽에 놓습니다. 기증자의 대동맥이받는 사람의 대동맥과 다음받는 사람 IVC에 위치 기증자의 폐 동맥에 다음 절개 부위에 위치되어 있는지 확인합니다.
- 동물이 180 °를 회전 무대되는 말단 구석을 도달 할 때까지 첫 번째 왼쪽에 인접 코너와 봉합부터 10-0 나일론 봉합사를 실행하여받는 사람의 대동맥에 기증자의 대동맥 엔드 - 투 - 측면을 Anastomose. 부드럽게 대동맥 우측을 노출하고 기단부에 말단에서 대동맥 벽의 우측을 통해 봉합을 계속 복부 좌측 공여체 심장을 이동. 대동맥 문합을 닫기 전에, 온화하게 어떤 응고 및 공기를 제거하기 위해 헤파린 식염수로 루멘을 세척하십시오.
- 받는 사람 IVC와 기증자 폐동맥 (PA) 엔드 - 투 - 측면을 Anastomose. 절개 버전을학적으로 동맥 문합에 따라 사이트의 IVC의 전면 벽에 microscissors와. IVC의 루멘 내에서 좌측 벽의 선단부터 10-0 나일론 봉합사를 실행하여 수신자 IVC에 도너 PA를 Anastomose. 근위 끝에 도달 한 후 문합을 완료 말단부까지 전면 오른쪽 벽을 따라 봉합을 계속합니다. 문합을 닫기 전에, 온화하게 어떤 혈전과 공기를 제거하기 위해 루멘을 세척하십시오.
- 지혈이 될 때까지면 주걱 혈관 클램프, 문합 사이트의 주위에 Gelfoam 대신 조각 및 적용 부드러운 압력을 해제하기 전에. 재관류시에, 근위 클램프이어서 제 원위 클램프를 해제.
- 재관류 후에는 복구를 지원하기 위해 외부에서 이식에 37 ° C에서 따뜻한 식염수를 적용합니다. 이식은 일반적으로 즉시 세동을 시작하고 몇 분 이내에 동 율동에 자발적으로 되돌아갑니다. 따뜻한 0.6 ㎖를 주입받는 사람의 수분을 유지하기 위해 생리 식염수를 피하. 수술 전에 완료에 진통제에 부 프레 노르 핀의 피하 주사
- 두 층을위한 하나의 5-0 흡수 실행 봉합과 복부 상처를 닫습니다. 내부 층을 작성하여 시작하고 피부를 따라 계속합니다.
4. 복구 및 이식 모니터링
- 감염의 예방을 위해 암피실린을 주입 및 복구를 위해 37 ° C에서 가열 패드에받는 사람을 배치합니다. 대부분의 동물은 신속하게 복구하고 일반적으로 마시는 종종 3 시간 이내에 먹고있다. 마우스가 고통의 흔적이있는 경우, 원인을 파악하기 위해 긴밀하게 검사합니다. 명백한 원인이있는 경우, 부 프레 노르 핀과 치료와 밀접하게 모니터링 할 수 있습니다. 증상이 심한 또는 8 시간 이상 지속되면 수의사를 상담하고 안락사를 고려하십시오. 필요한 경우, 증상이 해결 될 때까지 부 프레 노르 핀의 12 시간마다 주사를 계속 제공합니다. 마우스가 고통의 흔적이있는 경우 8 시간 후, 계속 12 줄부 프레 노르 핀의 시간당 주사가 해결 될 때까지. 증상이 더 이상 48 시간 동안 계속하고 필요한 경우 안락사 경우 수의사에게 문의하십시오.
- 직접 복부 촉진으로 이식 심장 박동을 모니터 + + + + 등의 건강한 발달에 의한 거절에 약한 비트에 대한 +에 이식하고 이길의 강도를 기록 - 이식의 거부 반응을 완료 할 예정이 아닌 구타로. 실험 기간 동안 일주일 후 배 처음 10 일 동안 매일 마우스를 모니터링합니다.
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Representative Results
초기 훈련 기간 후에, 우리 그룹의 마우스 이소성 심장 이식 227 케이스를 분석 하였다. 제 24 시간 이내 성공률은 90.3 %이었고, 48 시간에서 그것은 86.8 %였다. 48 시간 내에서 30 (13.2 %), 실패, 5 (2.2 %), 뒷다리 마비를 경험하고 안락사했다, 10 (4.4 %)이 동안 15 인해 이식 허혈 손상 및 / 또는 혈전증에 비 심장 박동을했다 (6.6 %)은 48 시간 이내에 사망. 일부 실험 그래프트 생존율은 스트레인 다양한 조합으로 표 1에 나타낸다. 동일하지 않은 균주 사이의 이식이 거부하는 동안 같은 기증자와받는 사람의 긴장과 심장 이식은 장기를 허용했다.
이식 된 심장의 외관은도 1에 도시된다. 심장 심장의 등장과 함께 멎 때 심장 이식 실패의 원인은 일반적으로 이식 후 시간에 의해 결정된다. 필요한 경우, 원인비트의 중단으로 심장의 조직 학적 분석으로 확인해야합니다. 예를 들어, DBA / 2 기증자의 심장 이식의 C57BL / 6 변형받는 사람에 마음이 unsensitized받는 사람의 거부 반응은 보통 적어도 일주일에 걸리는 대부분의 예외적 인, 2 일에 박동을 정지했다. 그림 1A는이에서 마음을 보여줍니다 혈전증과 심장 조직의 경색의 증거받는 사람. C57BL / 6받는 사람에게 C57BL / 6 기증자의 변형 조합, 심장이 거부되지 않았고> 백일 (그림 1B)에 살아 남았다. 이 경우 심장 인해 비 생명 유지 상태에 보조 근육 위축에 크기가 약간 감소했다. 대조적으로, C57BL / 6받는 사람에게 DBA / 2 기증자의 거부 변형 조합, 이식 된 심장은 하루 7로 이길 중단 및 거부의 증거 (그림 1C)을 보여 주었다했다. 그것은 하루 100 (그림 1D)에 의해 완전히 섬유화 및 수축했다.
혈전의 그림 1. 외관, 이식의 마음을 거절과 비 거부. (A) DBA / 2 심장 이식 후 혈전 및 경색 심장 7 일 보여주는 C57BL / 6받는 사람에게 이식. (B) 잘 관류와 백일 이식 후 심장 박동. (C를 보여주는 C57BL / 6받는 사람에게 이식 C57BL / 6 마음 백일 이식 후 거부의 마음을 보여주는 C57BL / 6받는 사람에게 이식 칠일 이식 후 거부의 마음을 보여주는 C57BL / 6받는 사람에게 이식) DBA / 2 마음. (D) DBA / 2 마음. 화살표는 이식 된 심장을 나타냅니다.
| 조합 | 생존 (일) | N | |
| B10.BR → B10.BR | > 200 X7 | 7 | > (200) |
| C57BL / 6 → C57BL / 6 | (40)> 200 배 | 3 | > (200) |
| F1 → B10.BR | 8 배, 9, 12 | 4 | 8.5 |
| 178.3 → B10.BR | 7 배, 8 배, 9, 10, 12, 13 | 8 | 8.5 |
| C57BL / 6 → B10.BR | 8 X4, 9 배, 10 배, 11, 12, 14 배, 15 | 16 | 10 |
| BALB / C → C57BL / 6 | 7 X9 | 9 | 7 |
| DBA / 2 → C57BL / 6 | 6, 7, 10 배 | 11 | 7 |
다른 기증자 /받는 사람의 조합으로 표 1. 심장 이식 생존.
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Discussion
마우스 심장 이식 마스터에 상당한 수술 기술을 필요로하는 어려운 미세 수술 방법입니다. 가장 어려운 부분은 혈관의 작은 직경이다. 또, 수신자 동작 시간 및 출혈을 제한하는 것이 필요하다. 마우스의 심장 이식에 대한 기술은 첫 번째 코리 등으로 설명했다. 1973 년 이후에 모트 람 등 (12)에 의해. 우리의 수정은 다음 사항을 포함한다. 첫째, 곧 관류 후 대동맥과 폐동맥 번들의 개흉술과 절개 다음 차가운 헤파린 식염수 기증자의 심장을 즉시 살포 수확하는 동안 따뜻한 국소 빈혈을 방지 할 수 있습니다. 둘째, 대신 기증자 전에 수신자를 준비 곧 기증자 수확 완료 후받는 사람의 준비, 시작, 생존 결과의 개선과받는 사람의 복부 노출 시간을 줄일 수 있습니다. 마지막으로, 작은 atraumatic 용기의 사용은 B로 클램프받는 사람 대동맥 / IVC 번들 대신 관계의 혈액의 흐름을, 잠금, 일반적으로 혈관에 덜 손상을 초래하고 뒷다리 마비의 발생을 줄일 수 있습니다.
또한, 다음과 같은 점은 성공을 위해 중요하다. 기증자와받는 사람의 최적 크기는 23-26g 주위에 최적의 나이는 10-12주입니다. 이전 동물은 큰 혈관이없는 그들의 증가 된 지방은 대동맥과 IVC의 노출을 더욱 어렵게 만든다. 수술 중받는 사람의 탈수와 저체온증은 피해야한다. 받는 사람 장 잘 따뜻한 식염수를 적신 거즈를 사용하여 탈수로부터 보호해야하는 사람과받는 사람은 37 ℃에서 가열 매트에 유지 될 수 가제는 작업을 수행하는 동안 신선한, 따뜻한 식염수의 일반 응용 프로그램에 의해 습기가 유지 될 필요가있다. 혈전과 뒷다리 마비로 이어질 수 있습니다 공기 색전을 최소화하기 위해 혈관 문합 사이트를 닫기 전에 잘 씻어야합니다. 대장 신중 completi에서 교체해야합니다장간막의 왜곡을 방지하기 위해 이식에. 곧 수술 후 정맥 유체의 큰 볼륨이 문합의 고혈압과 출혈을 일으킬 수 있습니다 반면에 0.6 ㎖의 따뜻한 생리 식염수를 피하 주사는 동물의 복구를 지원합니다. 받는 사람 대동맥과 IVC 크로스 미만 30 분에 고정되는 시간을 제한하면 성공률을 향상시킬 것입니다.
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Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
이 작품은 Microsearch 호주의 재단, 및 Myee 코드 링턴 의학 연구 재단에 의해, 호주 프로젝트 그랜트 1,029,205의 국립 보건 의학 연구위원회 (NHMRC)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Operating microscope | Leica, Heerbrugg, Switzerland | M651 | 10-25X magnification |
| Anesthetic machine | Vet Quip Pty Ltd, Sydney, Australia | Vett3 | Capable of delivering a mixture of isoflurane and oxygen in air |
| Operating board | Hardware store or office supplier | Dense cork or synthetic capable of taking pins | |
| Heparinized saline (5 U/ml, 4 °C) | Pfizer, USA | FW25 | In 1 ml syringe with 23 G needle on ice |
| Normal saline (37 °C) | AstraZeneca Pty Ltd, Australia | 4538 | In 1 ml syringe with 23 G needle on warm pad |
| Sutures 10- nylon, 5-0 Vicryl | Ethicon, Inc. NJ, USA | 2870G/J421H | |
| Buprenorphine (0.05 mg/kg in 0.1 ml saline) | Reckitt Benckiser, Sydney, Australia | In 1 ml syringe with 23 G needle on ice | |
| Ampcillin (5 mg/kg in 0.1 ml saline) | Aspen, Sydney, Australia | In 1 ml syringe with 23 G needle on ice | |
| Gel Foam | Pharmacia & Upjohn Co. USA | 801289304 | Cut into small pieces |
| High temperature cautery device | Medtronic, USA | 8444000 | |
| Heating Pad/Right Temp | Kent Scientific Corporation, Turrington, CT 06790 | ||
| Microsurgery instruments: | Shanghai Medical Instruments Co. Ltd., | ||
| Microneedleholders | Shanghai, China | WT2020 | |
| Microscissors | " " | WT1020 | |
| Microforceps (straight tip) | " " | WA3010 | |
| Microforceps (curved tip) | " " | WA3020 | |
| Micromosquito clamps (1 pair) | " " | W40350 | |
| Microvessel atraumatic clamps (1 pair) | " " | W40130/W40150 |
References
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