Abstract
Muizen worden vaak gebruikt als harttransplantatie donoren en ontvangers in studies van transplantatie-immunologie vanwege het brede scala van transgene muizen en reagentia beschikbaar. Een moeilijkheid wordt gepresenteerd als gevolg van de geringe omvang van het dier en de aanzienlijke technische uitdagingen van de microchirurgie betrokken bij harttransplantatie. In het bijzonder kan een hoge mate van technisch falen vroeg na transplantatie gevolg van de ontvanger dood en postoperatieve complicaties zoals verlamming of niet kloppend hart. Hier wordt de volledige techniek voor heterotope harttransplantatie muis aangetoond met oogsten van de donor hart en de daaropvolgende implantatie in een ontvanger muis. Het donorhart wordt geoogst onmiddellijk na in situ perfusie met koud gehepariniseerde zoutoplossing en doorsnijding van de omhooggaande aorta en longslagader. De ontvanger operatie omvat bereiding van het abdominale aorta en inferior vena cava (IVC), gevolgd doorend-to-side anastomose van de donor aorta van de ontvanger aorta met een draaiende 10-0 microsuture en soortgelijke anastomose van de donor longslagader de ontvanger IVC. Na de operatie wordt het dier geïnjecteerd met 0,6 ml fysiologische zoutoplossing subcutaan en om te herstellen op een 37 ° C verwarming pad. De resultaten van 227 muis harttransplantaties samengevat, met een slagingspercentage van 48 uur van 86,8%. Van de mislukkingen 13,2% binnen 48 uur, 5 (2.2%) ervaren verlamming, 10 (4,4%) hadden een niet-kloppend hart als gevolg van ischemische schade en / of trombose te enten, terwijl 15 (6.6%) stierven binnen 48 uur .
Introduction
Diermodellen van orgaantransplantatie kan waardevolle informatie verschaffen voor het verbeteren van de behandeling van klinische transplantatie patiënten. Muismodellen zijn vooral nuttig voor het bestuderen van het afweermechanisme van afstoting van getransplanteerde organen of aanvaarding vanwege de brede waaier van genetisch gemodificeerde muizen en reagentia specifiek voor muizen die niet beschikbaar zijn voor andere dierlijke modellen 1-3 zijn. Een uitdaging met muismodellen van de transplantatie is de geringe omvang van de donoren en ontvangers die aanzienlijke technische vaardigheid om bevredigende resultaten te bereiken vereist.
Een techniek werd voor het eerst beschreven voor heterotopische transplantatie van harten in ratten 4 die later werd aangepast voor muis harttransplantatie door Corry et al. 5. Deze techniek betrokken bereiden van de ontvanger voorafgaand aan de donor bedrijf en geen perfusie van het donorhart, die beide waarschijnlijk overleving van het getransplanteerde hart of t compromishij ontvanger. De procedure is op grote schaal gebruikt als oorspronkelijk beschreven de mechanismen van transplantaat afstoting en tolerantie 6-8 onderzoeken. Anderen hebben de oorspronkelijke rat harttransplantatie procedure van Ono en Lindsey voor harttransplantaties in muizen 9,10 aangepast. Meer recent werd een techniek gepubliceerd muis harttransplantatie dat enkele problemen bij de werkwijze Corry et al. 11 overwonnen. Het protocol hier beschreven omvat onze modificaties, gebaseerd op de methode van Mottram et al. 12, die omvat: in situ perfusie met koud gehepariniseerde zoutoplossing onmiddellijk na thoracotomie en uitvoeren van de donor operatie vóór de ontvanger operatie ontvanger operatie te minimaliseren. Daarnaast maken we gebruik van kleine atraumatic vaartuig klemmen in plaats van 6-0 zijden dassen. Hoewel vaartuig klemmen hebben het nadeel van het nemen van meer ruimte ze makkelijker te controleren dan banden, die niet te strak of los moet wordenen zijn minder eenvoudig te verwijderen dan klemmen. Onze werkwijze gebruikt een lopende hechting voor verblijf anastomose, hoewel de initiële stadia leren alternatief is het verblijf hechtingen aan de proximale en distale hoeken om gelijkheid van hechtingen garanderen en zo doorgankelijkheid van de anastomose.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Voor aanvang van de experimenten, te verkrijgen toestemming van Animal Care Ethische Commissie de betrokken instelling voor de geplande experimenten. Handhaven muizen in de overeenstemming met de eisen van uw instelling. Het volgende protocol is goedgekeurd door de Universiteit van Sydney en Royal Prince Alfred Hospital commissies.
Voor aanvang van de operatie, moeten alle instrumenten grondig worden gereinigd en gesteriliseerd door onderdompeling in 80% ethanol. Sommige instellingen bepalen autoclaaf maar dit fijne microchirurgische instrumenten kan schade op de lange termijn. Waar mogelijk gebruik steriel wegwerpmateriaal.
1. Anesthesie
- Verdoven muis met isofluraan in een afgesloten container plaatsen dan in rugligging op een operationele boord, snel verbinding verdoving neuskegel. Test toereikendheid van de anesthesie door te knijpen de achterste voet te verzekeren dat er geen reflex.
- Scheer de huid met een chirurgisch mes ensteriliseren met 80% ethanol. Daarnaast kunnen 2% chloorhexidine in 70% isopropylalcohol gebruikt voor huid sterilisatie. Tijdens de inductie van de anesthesie de isofluraan concentratie van 3%, maar beperken deze tot 1-1,5% voor onderhoud. Maak kleine aanpassingen aan deze concentratie aan regelmatige ademhaling en hartslag te behouden. Handhaaf de temperatuur van het dier op een verwarmingselement.
2. Donoroperatie
- Maak een thoracotomie naar het hart en vaten bloot door het snijden van de borst door beide zijden van de ribbenkast van de rib rand tot aan de oksel, gevolgd door een dwarse snede op het niveau van de xiphisternum een borstwand flap te vormen. Til deze klep omhoog naast het hoofd en speld het aan de operationele bestuur. Scheur hartzakje naar het hart en vaten bloot.
- Til de onderste holle ader met een tang in de ene hand en met de andere Injecteer 1 ml koud gehepariniseerde zoutoplossing proximaal van hart door de IVC, zet dan een kleine slagader klem op het IVC aan preventiet stroom van perfusieoplossing terug door de naald gat.
- Met behulp van gaas en een wattenstaafje, trekken het hart naar beneden om de opgaande aorta en de longslagader bloot. Pass een blad van een paar microscissors door het kanaal (dwarse sinus) posterieur van de bundel aorta en longslagader en snijd de aorta en longslagader samen zoveel distaal mogelijk voldoende lengte te hebben voor anastomose.
- Stropdas en verdeel de IVC, rechter superieure vena cava (SVC), links SVC en longvenen behulp 6-0 zijden draad. Bind het IVC en rechts SVC afzonderlijk plaats dan een enkele draad posterior naar het hart naar links SVC samen omringen met pulmonale aderen en bind het. Oogst het hart van de donor site door distale snijden van de schepen aan de banden, dan opslaan in koude steriele zoutoplossing bij 4 ° C tot transplantatie. Dit resulteert in de dood van de donor door verbloeding.
3. Ontvanger Operation
- Verdoven van deontvanger zoals hierboven beschreven (paragraaf 1). Scheren zorgvuldig buik om irritatie te voorkomen, maak dan een laparotomie door incisie van schaambeen naar xiphisternum en trek met behulp van paperclips gebogen om retractors vormen. Wikkel de darm in warme steriele zoutoplossing gedrenkt gaas en trekken naar de rechterbovenhoek van de buik.
- Om de infra-renale aorta en IVC bloot, bevrijden de gebundelde segmenten van de aorta en IVC uit de linker nierslagader en ader aan de iliacale bifurcatie door ze te delen van de lumbale vaartuigen met een cauterisatie-apparaat. Zorg ervoor dat de cauterisatie is op de juiste temperatuur en gebruikt voor voldoende tijd om de uiteinden vat verdelen en af te dichten.
- Breng een kleine atraumatische klemmen vaartuig naar de aorta en IVC segmenten distaal en proximaal. Een incisie in de voorwand van de aorta door eerst een gat prikken met een 30 G naald; knip een incisie verticaal met microscissors de grootte van de donor aorta passen. Spoel de aorta lumen met gehepariniseerde zoutoplossing om elke bl verwijderenood stolsels.
- Breng het donorhart aan de ontvanger plaats bedekt met gaas gedrenkt in koude zoutoplossing en plaats aan de rechterkant van de buik. Zorg ervoor dat de donor aorta is gepositioneerd naast de insnijding op de ontvanger aorta en de donor longslagader gepositioneerd naast de ontvanger IVC.
- Anastomose de donor aorta end-to-side de ontvanger aorta met actief 10-0 nylon hechtingen vanaf het proximale hoek en hechten aan de linkerzijde eerste tot aan de distale hoek, in welk stadium de dier wordt 180 ° gedraaid. Beweeg het donorhart aan de linkerkant van de buik naar de rechterkant van de aorta bloot en blijven hechten door de rechterkant van de aorta van het distale uiteinde naar het proximale uiteinde. Voor het sluiten van de aorta-anastomose, voorzichtig spoelen het lumen met gehepariniseerde zoutoplossing aan een stolsel en lucht te verwijderen.
- Anastomose de donor pulmonale arterie (PA) end-to-side met de ontvanger IVC. Maak een insnijding vertisch met microscissors in de voorwand van de IVC op een locatie overeenkomstig de slagader anastomose. Anastomose de donor PA ontvanger IVC actief 10-0 nylon hechtingen vanaf het distale uiteinde van de linker wand in het lumen van de IVC. Na het bereiken van het proximale uiteinde, verder hechtingen langs de rechter zijwand tot aan het distale einde aan de anastomose voltooien. Voor het sluiten van de anastomose, voorzichtig spoelen het lumen om eventuele stolsels en lucht te verwijderen.
- Voor het vrijgeven van het schip klemmen, plaats stukjes Gelfoam rond de anastomose sites, en druk zachtjes met een katoenen applicator totdat hemostase is bereikt. Ten tijde van revascularisatie, laat het distale klem, gevolgd door de proximale klem.
- Na revascularisatie, gelden warme zoutoplossing bij 37 ° C om de graft extern om het herstel te helpen. De ent begint meestal fibrillatie onmiddellijk en keert spontaan naar sinusritme binnen een paar minuten. Injecteer 0,6 ml warmzoutoplossing subcutaan hydratatie van de ontvanger behouden. Injecteer subcutaan buprenorfine analgesie vóór de operatie te
- Sluit de abdominale wond met een 5-0 absorbeerbare lopende hechtdraad voor zowel de lagen. Begin met het invullen van de binnenste laag en verder langs de huid.
4. Herstel en Graft Monitoring
- Injecteer ampicilline voor profylaxe van infectie en plaats de ontvanger op een verwarmingselement bij 37 ° C gedurende herstel. De meeste dieren herstellen snel en worden meestal drinken en eten vaak binnen 3 uur. Als de muis toont tekenen van nood, aandachtig onderzoeken om oorzaak te bepalen. Als er geen duidelijke oorzaak, de behandeling met buprenorfine en de voet volgen. Een dierenarts te raadplegen als de symptomen ernstig of aanhoudend zijn meer dan 8 uur en overwegen euthanasie. Indien nodig, geef voortdurende 12 uurlijkse injecties van buprenorfine tot de symptomen verdwijnen. Als de muis toont tekenen van nood na 8 uur, geven voortgezette 12hourly injecties van buprenorfine tot ze op te lossen. Raadpleeg de dierenarts als de symptomen blijven voor meer dan 48 uur en euthanaseren indien nodig.
- Monitor graft hartslag door directe abdominale palpatie en noteer de sterkte beat als + + + + voor een gezonde transplantaat + zwakke maatslag door geavanceerde afwijzing en - als niet kloppend door afstoting van het transplantaat te voltooien. Monitor muizen dagelijks gedurende de eerste 10 dagen, vervolgens 3x per week gedurende de duur van het experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Na een eerste training periode werden 227 gevallen van muis heterotope harttransplantatie in onze groep geanalyseerd. Het succes binnen de eerste 24 uur werd 90,3% en na 48 uur was 86,8%. Van de 30 (13,2%) storingen binnen 48 uur, 5 (2.2%) ervaren verlamming en moesten ze worden gedood, 10 (4,4%) hadden een niet-kloppend hart als gevolg van graft ischemie letsel en / of trombose, terwijl 15 (6.6%) stierven binnen 48 uur. Sommige experimentele transplantaat overleving zijn in tabel 1 met verschillende combinaties stam. Harttransplantaties tussen dezelfde donor en ontvanger stam werden aanvaard op lange termijn, terwijl transplantaties tussen niet-identieke stammen werden afgewezen.
Het uiterlijk van getransplanteerde harten wordt getoond in Figuur 1. De oorzaak van harttransplantatie niet wordt algemeen bepaald door de tijd na transplantatie als het hart gestopt verslagen in combinatie met het uiterlijk van het hart. Indien nodig, de oorzaakvan stopzetting van de slag moet worden bevestigd door histologische analyse van het hart. Bijvoorbeeld, in een C57BL / 6 stam ontvanger van een DBA / 2 donor harttransplantatie, het hart stopgezet kloppend op dag 2, wat zeer ongebruikelijk zoals afstoting bij ontvangers unsensitized duurt minimaal een week. Figuur 1A toont het hart van deze ontvanger met tekenen van trombose en infarct van het hartweefsel. In de stam combinatie van C57BL / 6 donor van C57BL / 6 ontvanger, is het hart niet verworpen en overleefde> 100 dagen (Figuur 1B). In dit geval is het hart enigszins in grootte door spieratrofie secundair aan de niet levensverlengende toestand had verlaagd. In tegenstelling, in het verwerpen stam combinatie van DBA / 2 donor van C57BL / 6 ontvanger, had de getransplanteerde hart ophield te kloppen bij dag 7 en bleek het bewijs van afwijzing (figuur 1C). Het was helemaal fibrotische en gekrompen tot dag 100 (figuur 1D).
Figuur 1. Voorkomen van trombose, verwerpen en niet-getransplanteerde harten. (A) DBA / 2 hart getransplanteerd naar C57BL / 6 ontvanger tonen trombose en infarct hart 7 dagen na transplantatie. (B) C57BL / 6 hart getransplanteerd naar C57BL / 6 ontvanger met een goed doorbloed en kloppend hart 100 dagen na de transplantatie. (C ) DBA / 2 hart getransplanteerd naar C57BL / 6 ontvanger toont afgewezen hart 7 dagen na de transplantatie. (D) DBA / 2 hart getransplanteerd naar C57BL / 6 ontvanger toont afgewezen hart 100 dagen na de transplantatie. Pijlen geven de getransplanteerde hart.
| Combinaties | Overleving (dagen) | n | |
| B10.BR → B10.BR | > 200 x7 | 7 | > 200 |
| C57BL / 6 → C57BL / 6 | 40,> 200 x2 | 3 | > 200 |
| F1 → B10.BR | 8 x2, 9, 12 | 4 | 8.5 |
| 178.3 → B10.BR | 7 x2, x2 8, 9, 10, 12, 13 | 8 | 8.5 |
| C57BL / 6 → B10.BR | X4 8, 9 x2, x5 10, 11, 12, 14 x2, 15 | 16 | 10 |
| BALB / c → C57BL / 6 | 7 x9 | 9 | 7 |
| DBA / 2 → C57BL / 6 | 6, 7 x10 | 11 | 7 |
Tabel 1. Hart entoverleving in verschillende donor / ontvanger combinaties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Muis harttransplantatie is een uitdagende microchirurgische methode die aanzienlijke chirurgische vaardigheid onder de knie vereist. De meest uitdagende aspect is de kleine diameter van de schepen. Bovendien moet de ontvanger werkingstijd en bloeden beperken. De techniek voor muizen harttransplantatie werd eerst beschreven door Corry et al.. in 1973 en vervolgens door Mottram et al. 12. Onze wijzigingen omvatten de volgende punten. Ten eerste, onmiddellijke perfusie van het donorhart met koud gehepariniseerde zoutoplossing na thoracotomie en doorsnijding van de aorta en de longslagader bundel kort na perfusie voorkomt warme ischemie tijdens het oogsten. Ten tweede begint de ontvanger preparaat snel na voltooiing van donor oogsten plaats van voorbereiden van de ontvanger voor de donor, verlaagt de buik belichtingstijd in de ontvanger met als gevolg verbetering van overleving. Tot slot, gebruik van kleine atraumatisch vaartuig klemmen naar block bloedstroom, in plaats van banden voor de ontvanger aorta / IVC bundel, resulteert meestal in minder schade aan de schepen en kan de incidentie van verlamming te verminderen.
Bovendien zijn de volgende punten belangrijk zijn voor succes. De optimale grootte van donoren en ontvangers is ongeveer 23-26 gram en optimale leeftijd is 10 tot 12 weken. Oudere dieren grotere vaartuigen en hun toegenomen verdikken blootstelling van de aorta en IVC moeilijker. Ontwatering en hypothermie van de ontvanger tijdens chirurgie worden vermeden. Ontvanger darm moet goed worden beschermd tegen uitdroging met warme zoutoplossing gedrenkt gaas en de ontvanger kan worden gehandhaafd op een verwarmings-mat bij 37 ° C. Het gaas moet door regelmatige toepassing van verse, warme zoutoplossing vochtig gehouden worden tijdens de operatie. Om bloedstolsels en luchtembolie die kunnen leiden tot verlamming minimaliseren, moet het vat anastomose plaatsen goed spoelen voor het sluiten zijn. Darmen moeten zorgvuldig worden vervangen, a.op transplantatie elke verdraaiing van het mesenterium voorkomen. Subcutane injectie van 0,6 ml warm zoutoplossing bevordert herstel dier terwijl een groter volume aan intraveneuze vloeistof snel na de operatie hypertensie en bloeden van anastomosen kan veroorzaken. Het beperken van de tijd dat de ontvanger aorta en IVC zijn kruis geklemd minder dan 30 minuten wordt het succes verbeteren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de National Health en Medical Research Council (NHMRC) van Australië Project Grant 1.029.205, door de Microsearch Foundation of Australia, en door de Myee Codrington Medical Research Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Operating microscope | Leica, Heerbrugg, Switzerland | M651 | 10-25X magnification |
| Anesthetic machine | Vet Quip Pty Ltd, Sydney, Australia | Vett3 | Capable of delivering a mixture of isoflurane and oxygen in air |
| Operating board | Hardware store or office supplier | Dense cork or synthetic capable of taking pins | |
| Heparinized saline (5 U/ml, 4 °C) | Pfizer, USA | FW25 | In 1 ml syringe with 23 G needle on ice |
| Normal saline (37 °C) | AstraZeneca Pty Ltd, Australia | 4538 | In 1 ml syringe with 23 G needle on warm pad |
| Sutures 10- nylon, 5-0 Vicryl | Ethicon, Inc. NJ, USA | 2870G/J421H | |
| Buprenorphine (0.05 mg/kg in 0.1 ml saline) | Reckitt Benckiser, Sydney, Australia | In 1 ml syringe with 23 G needle on ice | |
| Ampcillin (5 mg/kg in 0.1 ml saline) | Aspen, Sydney, Australia | In 1 ml syringe with 23 G needle on ice | |
| Gel Foam | Pharmacia & Upjohn Co. USA | 801289304 | Cut into small pieces |
| High temperature cautery device | Medtronic, USA | 8444000 | |
| Heating Pad/Right Temp | Kent Scientific Corporation, Turrington, CT 06790 | ||
| Microsurgery instruments: | Shanghai Medical Instruments Co. Ltd., | ||
| Microneedleholders | Shanghai, China | WT2020 | |
| Microscissors | " " | WT1020 | |
| Microforceps (straight tip) | " " | WA3010 | |
| Microforceps (curved tip) | " " | WA3020 | |
| Micromosquito clamps (1 pair) | " " | W40350 | |
| Microvessel atraumatic clamps (1 pair) | " " | W40130/W40150 |
References
- Aramaki, O., et al. Interleukin-10 but not transforming growth factor-beta is essential for generation and suppressor function of regulatory cells induced by intratracheal delivery of alloantigen. Transplantation. 79, 568-576 (2005).
- Chen, R. H., Bushell, A., Fuggle, S. V., Wood, K. J., Morris, P. J. Expression of granzyme A and perforin in mouse heart transplants immunosuppressed with donor-specific transfusion and anti-CD4 monoclonal antibody. Transplantation. 61, 625-629 (1996).
- Poulin, L. F., et al. Interleukin-9 promotes eosinophilic rejection of mouse heart allografts. Transplantation. 76, 572-577 (2003).
- Ono, K., Lindsey, E. S. Improved technique of heart transplantation in rats. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 57, 225-229 (1969).
- Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Primarily vascularized allografts of heart in mice. Transplantation. 16, 343-350 (1973).
- Larsen, C. P., et al. CD40-gp39 interactions play a critical role during allograft rejection. Suppression of allograft rejection by blockade of the CD40-gp39 pathway. Transplantation. 61, 4-9 (1996).
- Saitovitch, D., Bushell, A., Mabbs, D. W., Morris, P. J., Wood, K. J. Kinetics of induction of transplantation tolerance with a nondepleting anti-Cd4 monoclonal antibody and donor-specific transfusion before transplantation. A critical period of time is required for development of immunological unresponsiveness. Transplantation. 61, 1642-1647 (1996).
- Callaghan, C. J., et al. Regulation of allograft survival by inhibitory FcgammaRIIb signaling. J. Immunol. 189, 5694-5702 (2012).
- Qian, S., et al. Impact of donor MHC Class I or Class II antigen deficiency on first- and second-set rejection of mouse heart or liver allografts. Immunology. 88, 124-129 (1996).
- Wang, C., et al. Spontaneous acceptance of mouse kidney allografts is associated with increased Foxp3 expression and differences in the B and T cell compartments. Transpl. Immunol. 24, 149-156 (2011).
- Liu, F., Kang, S. M. Heterotopic Heart Transplantation in Mice. J. Vis. Exp. , (2007).
- Mottram, P. L., et al. Electrocardiographic monitoring of cardiac transplants in mice. Cardiovasc. Res. 22, 315-321 (1988).
