Abstract
Les souris sont souvent utilisés comme donneurs de transplantation cardiaque et les bénéficiaires dans les études de l'immunologie de transplantation en raison de la large gamme de souris transgéniques et des réactifs disponibles. Une difficulté se présente en raison de la petite taille de l'animal et les défis techniques considérables de la microchirurgie impliqués dans la transplantation cardiaque. En particulier, un taux élevé de défaillance technique tôt après la transplantation peut entraîner la mort de destinataire et les complications post-opératoires telles que la paralysie des membres postérieurs ou un cœur non-battant. Ici, la technique complète pour une transplantation cardiaque hétérotopique de la souris est démontrée, impliquant la récolte du cœur du donneur et de son implantation ultérieure dans une souris receveuse. Le cœur du donneur est prélevé immédiatement après la perfusion in situ avec une solution saline héparinée froid et transection de l'aorte ascendante et de l'artère pulmonaire. L'opération de destinataire comprend la préparation de l'aorte abdominale et la veine cave inférieure (IVC), suivie paranastomose bout à l'autre de l'aorte du donneur avec l'aorte destinataire à l'aide d'une seule course 10-0 microsuture et une anastomose similaire de l'artère pulmonaire du donneur avec le bénéficiaire IVC. Suite à l'opération de l'animal reçoit une injection de 0,6 ml par voie sous cutanée de solution saline normale et on la laisse se remettre sur un coussin chauffant de 37 ° C. Les résultats de 227 transplantations cardiaques de souris sont résumées avec un taux de réussite à 48 h de 86,8%. Des échecs 13,2% dans les 48 heures, 5 (2,2%) ont connu une biche paralysie des membres, 10 (4,4%) avait un cœur non-battant en raison de greffer des blessures et / ou thrombose ischémique, tandis que 15 (6,6%) sont décédés dans les 48 heures .
Introduction
Les modèles animaux de transplantation d'organes peuvent fournir des informations précieuses pour améliorer le traitement des patients transplantés cliniques. Modèles de souris sont particulièrement utiles pour l'étude du système immunitaire de rejet de greffe d'organe ou de l'acceptation en raison de la large gamme de souris et des réactifs spécifiques pour les souris qui ne sont pas disponibles pour d'autres modèles animaux génétiquement modifiés 1-3. Un défi avec des modèles murins de transplantation est la petite taille des donneurs et des receveurs qui nécessite une grande maîtrise technique pour obtenir des résultats satisfaisants.
Une technique a été décrite pour la première à la transplantation hétérotopique de coeurs de rats 4 qui a ensuite été adaptés pour une transplantation cardiaque de la souris par Corry et al 5. Cette technique consiste à préparer le bénéficiaire avant l'opération des bailleurs de fonds et aucune perfusion du cœur du donneur, qui sont tous deux de nature à compromettre la survie du cœur ou t transplantéil destinataire. La procédure a été largement utilisé comme décrit à l'origine pour étudier les mécanismes de rejet de greffe et de la tolérance 6-8. D'autres ont adapté la procédure de transplantation cardiaque d'origine de rat de Ono et Lindsey pour les transplantations cardiaques chez les souris 9,10. Plus récemment, une technique a été publié pour la transplantation cardiaque de la souris qui a éliminé certains des problèmes associés à la méthode de Corry et al 11. Le protocole décrit ici incorpore les modifications, en fonction de la méthode de Mottram et al 12, qui comprennent: la perfusion in situ avec une solution saline héparinée froide immédiatement après thoracotomie et effectuer l'opération de donneur préalablement à l'opération de destinataire pour minimiser destinataire temps d'opération. En outre, nous utilisons des petites pinces atraumatiques navires au lieu de 6-0 cravates en soie. Bien pinces de navires ont l'inconvénient de prendre plus d'espace ils sont plus faciles à contrôler que les liens qui ne doit pas être trop serré ou lâcheet sont moins faciles à enlever que des pinces. Notre procédé utilise un surjet seul récipient pour anastomose, bien que dans l'apprentissage initial d'une scène alternative est d'utiliser des sutures de fixation à l'extrémité proximale et distale des coins pour assurer la régularité de sutures et donc la perméabilité de l'anastomose.
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Protocol
Avant le début des expériences, obtenir l'approbation du comité d'éthique de protection des animaux de l'institution compétente pour les expériences prévues. Maintenir la souris dans la conformité avec les exigences de votre institution. Le protocole suivant a été approuvé par les comités de l'Université de Sydney et Hôpital Royal Prince Alfred.
Avant de commencer la chirurgie, tous les instruments doivent être soigneusement nettoyés et stérilisés par trempage dans 80% d'éthanol. Certains établissements prévoient autoclave mais cela peut endommager les instruments de microchirurgie fines sur le long terme. Lorsque l'utilisation possible du matériel stérile à usage unique.
1. Anesthésie
- Anesthésier la souris avec de l'isoflurane dans un récipient fermé, puis placez-le sur le dos sur un conseil d'exploitation, reliant rapidement nez anesthésie cône. adéquation de test de l'anesthésie en pinçant l'arrière-pied pour s'assurer qu'il n'y a pas de réflexe.
- Raser la peau avec une lame chirurgicale etstériliser à 80% d'éthanol. En outre, 2% de chlorhexidine à 70% d'alcool isopropylique peut être utilisé pour la stérilisation de la peau. Au cours de l'induction de l'anesthésie la concentration d'isoflurane est de 3%, mais réduire ce à 1-1,5% pour l'entretien. Faire des ajustements mineurs à cette concentration pour maintenir une respiration régulière et la fréquence cardiaque. Maintenir la température de l'animal sur un coussin chauffant.
2. Opération des bailleurs de fonds
- Faire une thoracotomie pour exposer le coeur et les vaisseaux en coupant la poitrine à travers les deux côtés de la cage thoracique, à partir du bord de la nervure jusqu'à l'aisselle suivie par une coupe transversale au niveau de l'appendice xiphoïde pour former un rabat de paroi de la poitrine. Soulevez ce volet à côté de la tête et la broche à la carte d'exploitation. Détachez péricarde pour exposer le cœur et les vaisseaux.
- Soulevez la veine cave inférieure avec une pince dans une main et avec l'autre injection de 1 ml froid hépariné saline proximale à cœur par la veine cave inférieure, puis mettre une petite pince de l'artère sur la VCI à préventiont débit de solution de perfusion à travers le trou de l'aiguille.
- Utilisation de la gaze et un coton-tige, rentrer le coeur vers le bas pour exposer l'aorte ascendante et l'artère pulmonaire. Passer une lame d'une paire de microciseaux à travers le canal (sinus transverse) postérieur à l'ensemble de l'aorte et l'artère pulmonaire et l'aorte coupée et l'artère pulmonaire ainsi que dans toute la mesure du possible de manière distale afin d'assurer une longueur suffisante pour l'anastomose.
- Cravate et diviser la VCI, à droite la veine cave supérieure (VCS), laissés SVC et veines pulmonaires en utilisant 6-0 fil de soie. Attachez l'IVC et à droite SVC séparément, puis placer un seul postérieure de fil au cœur d'encercler le SVC gauche avec les veines pulmonaires et de l'attacher. Récolter au cœur du site donneur en coupant les vaisseaux distaux des liens, de le stocker dans une solution saline stérile froide à 4 ° C jusqu'à la transplantation. Il en résulte la mort du donneur par la saignée.
3. Fonctionnement du bénéficiaire
- Anesthésier ladestinataire comme ci-dessus (section 1). Raser soigneusement abdomen pour éviter l'irritation, puis faire une laparotomie par incision médiane de pubis à xiphisternum et se rétracter à l'aide de trombones pliés pour former des écarteurs. Enveloppez l'intestin dans une solution saline stérile gaze imbibée chaud et se rétracter à la partie supérieure droite de l'abdomen.
- Pour exposer l'aorte sous-rénale et IVC, libérer les segments groupés de l'aorte et IVC de l'artère rénale gauche et la veine de la bifurcation iliaque en les divisant par les vaisseaux lombaires en utilisant un dispositif de cautérisation. Veillez à ce que le cautère est à la bonne température et utilisé pendant un temps suffisant pour diviser et sceller les extrémités du navire.
- Appliquer petites pinces atraumatiques navire à l'aorte et segments IVC distale et proximale. Faire une incision dans la paroi avant de l'aorte par perforation d'abord un trou avec une aiguille de 30 G; puis couper une incision verticale avec microciseaux pour correspondre à la taille de l'aorte du donneur. Rincer la lumière de l'aorte avec du sérum physiologique hépariné pour enlever toute blcaillots ood.
- Apportez le cœur du donneur sur le site receveur recouvert de gaze trempé dans une solution saline froide et placez-le sur le côté droit de l'abdomen. Assurez-vous que l'aorte du donneur est placé à côté de l'incision sur l'aorte destinataire et l'artère pulmonaire du donneur positionné à côté du destinataire IVC.
- Anastomoser le côté fin à donneur aorte de l'aorte destinataire en utilisant l'exécution 10-0 fils de nylon à partir du coin proximale et suture sur le côté gauche d'abord jusqu'à atteindre le coin distal, étape à laquelle l'animal est tourné de 180 °. Déplacez doucement le cœur du donneur sur le côté gauche de l'abdomen pour exposer le côté droit de l'aorte et continuer suture par le côté droit de la paroi aortique de l'extrémité distale à l'extrémité proximale. Avant de clore l'anastomose aortique, rincer doucement la lumière avec du sérum physiologique hépariné pour enlever tout caillot et de l'air.
- Anastomoser le donneur artère pulmonaire (AP) fin à côte avec le bénéficiaire IVC. Faire une incision verquement avec microciseaux dans la paroi avant de l'IVC à un site en conformité avec l'anastomose de l'artère. Anastomoser le donneur PA au destinataire IVC, avec l'exécution 10-0 fils de nylon à partir de l'extrémité distale de la paroi de gauche dans la lumière de la VCI. Après avoir atteint l'extrémité proximale, continuer le long de sutures de la paroi latérale avant droite jusqu'à l'extrémité distale pour compléter l'anastomose. Avant de clore l'anastomose, rincer doucement la lumière pour éliminer les caillots et de l'air.
- Avant de relâcher le serrage des navires, placer des morceaux de Gelfoam autour des sites d'anastomose, et appliquer une légère pression avec un applicateur de coton jusqu'à l'hémostase. Au moment de la revascularisation, relâcher la pince distale en premier, suivi par la pince proximale.
- Après revascularisation, appliquer une solution saline chaude à 37 ° C sur le greffon à l'extérieur pour aider sa reprise. Le greffon commence habituellement fibrillation immédiatement et retourne spontanément à un rythme sinusal en quelques minutes. Injecter 0,6 ml chaudesdu sérum physiologique par voie sous cutanée à maintenir l'hydratation du destinataire. Injecter en sous-cutané de la buprénorphine pour une analgésie avant l'achèvement de la chirurgie
- Fermer la plaie abdominale avec un 5-0 surjet résorbable pour les deux couches. Commencez par remplir la couche intérieure et continuer le long de la peau.
4. Récupération et de greffe de surveillance
- Injecter ampicilline pour la prophylaxie de l'infection et de placer le destinataire sur un coussin chauffant à 37 ° C pour la récupération. La plupart des animaux guérissent rapidement et sont généralement de boire et de manger souvent à moins de 3 heures. Si la souris montre des signes de détresse, examiner de près pour déterminer la cause. Si aucune cause évidente, le traitement à la buprénorphine et suivre de près. Consulter un vétérinaire si les symptômes sont sévères ou persistent plus de 8 heures et envisager l'euthanasie. Si nécessaire, donner la poursuite 12 injections de buprénorphine horaire jusqu'à ce que les symptômes disparaissent. Si la souris montre des signes de détresse après 8 h, donner continuant 12injections de buprénorphine horaire jusqu'à ce qu'ils résolvent. Consulter le vétérinaire si les symptômes persistent pendant plus de 48 heures et euthanasier si nécessaire.
- Surveillance du rythme cardiaque du greffon par palpation abdominale direct et enregistrer la force de battement comme + + + + pour une greffe sain pour + de temps faible à cause du rejet de pointe et - comme non battre en raison de compléter le rejet de la greffe. Surveiller les souris tous les jours pendant les 10 premiers jours, puis 3x par semaine pour la durée de l'expérience.
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Representative Results
Après une période de formation initiale, 227 cas de la souris hétérotopique transplantation cardiaque dans notre groupe ont été analysés. Le taux de réussite dans les 24 premières heures était de 90,3% et à 48 h, il est de 86,8%. Sur les 30 (13,2%) des défaillances dans les 48 heures, 5 (2,2%) ont connu une paralysie des membres postérieurs et a dû être euthanasié, 10 (4,4%) avait un cœur non-battant pour cause de blessure et / ou de thrombose du greffon ischémie, tandis que 15 (6,6%) sont décédés dans les 48 heures. Des survies greffés expérimentaux sont présentés dans le tableau 1 avec une variété de combinaisons de contrainte. Transplantations cardiaques entre le même donateur et bénéficiaire souche ont été acceptées à long terme tandis que les greffes entre les souches non-identiques ont été rejetées.
L'apparition des cœurs transplantés est représenté sur la figure 1. La cause de l'échec de la transplantation cardiaque est généralement déterminée par le temps après la transplantation lorsque le coeur a cessé de battre en combinaison avec l'apparence du coeur. Si nécessaire, la causede cessation de battement doit être confirmée par l'analyse histologique du cœur. Par exemple, dans une souche bénéficiaire d'une greffe DBA / 2 de coeur de donneur C57BL / 6, le cœur a cessé de battre le jour 2, qui est très inhabituel que le rejet chez les receveurs non sensibilisées prend habituellement au moins une semaine. Figure 1A montre le cœur de cette destinataire avec la preuve de la thrombose et de l'infarctus du tissu cardiaque. Dans la combinaison de souche C57BL / 6 donneur de C57BL / 6 destinataire, le coeur n'a pas été rejetée et a survécu à> 100 jours (figure 1B). Dans ce cas, le cœur avait légèrement réduites en taille en raison de l'atrophie musculaire secondaire à son maintien de la vie statut non. En revanche, dans la combinaison de souche rejet de DBA / 2 donneur de C57BL / 6 destinataire, la greffe du coeur avait cessé de battre au jour 7 et présentaient des signes de rejet (figure 1C). Il était complètement fibrotique et rétréci par jour 100 (figure 1D).
Figure 1. Aspect de thrombose, en rejetant et non-rejet de cœurs transplantés. (A) DBA / 2 coeur transplanté à C57BL / 6 destinataire montrant thrombose et infarctus cardiaques 7 jours après la transplantation. (B) C57BL / 6 transplantation cardiaque à C57BL / 6 destinataire montrant un bien perfusé et le cœur battant 100 jours après la transplantation. (C ) DBA / 2 coeur transplanté à C57BL / 6 destinataire montrant coeur rejeté les 7 jours après la transplantation. (D) DBA / 2 coeur transplanté à C57BL / 6 destinataire montrant coeur rejeté 100 jours après la transplantation. Les flèches indiquent la greffe du coeur.
| Combinaisons | Survivances (jours) | n | |
| B10.BR → B10.BR | > 200 x7 | 7 | > 200 |
| C57BL / 6 → C57BL / 6 | 40,> 200 x2 | 3 | > 200 |
| F1 → B10.BR | X2 8, 9, 12 | 4 | 8.5 |
| 178,3 → B10.BR | 7 x2, x2 8, 9, 10, 12, 13 | 8 | 8.5 |
| C57BL / 6 → B10.BR | 8 x4, 9 x2, x5 10, 11, 12, 14 x2, 15 | 16 | 10 |
| BALB / c → C57BL / 6 | 7 x9 | 9 | 7 |
| DBA / 2 → C57BL / 6 | 6, 7 x10 | 11 | 7 |
Tableau 1. Coeur la survie du greffon dans différentes combinaisons donneur / receveur.
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Discussion
Transplantation cardiaque Mouse est une méthode microchirurgicale difficile qui exige des compétences chirurgicales considérable à maîtriser. L'aspect le plus difficile est le petit diamètre des vaisseaux. En outre, il est nécessaire de limiter la durée d'utilisation de destinataire et les saignements. La technique de transplantation cardiaque de la souris a été décrite par Corry et al. en 1973 et par la suite par Mottram et al 12. Nos modifications comprennent les points suivants. Tout d'abord, la perfusion immédiate du cœur du donneur de sérum physiologique hépariné froid suivant thoracotomie et résection de l'aorte et l'artère pulmonaire ensemble peu de temps après la perfusion empêche ischémie chaude lors de la récolte. En second lieu, à partir de la préparation de destinataire peu de temps après l'achèvement de donneur récolte, au lieu de préparer le destinataire avant le donneur, réduit le temps d'exposition abdominale chez le receveur avec une amélioration conséquente de la survie. Enfin, l'utilisation de petit navire atraumatique pinces à bverrouiller la circulation sanguine, à la place des liens pour le destinataire aorte / IVC faisceau, se traduit généralement par moins de dommages aux navires et peut réduire l'incidence de la paralysie des membres postérieurs.
En outre, les points suivants sont importants pour le succès. La taille optimale des donneurs et des receveurs est d'environ 23 à 26 g et l'âge optimal est de 10 à 12 semaines. Les animaux plus âgés n'ont pas de plus grands navires et de leur augmentation de la graisse rend l'exposition de l'aorte et IVC plus difficile. La déshydratation et d'hypothermie du destinataire lors de la chirurgie doivent être évités. l'intestin du bénéficiaire doit être bien protégé de la déshydratation à l'aide d'eau chaude salée gaze imbibée et le destinataire peut être maintenue sur une natte de chauffage à 37 ° C. La gaze doit être maintenu humide par l'application régulière de frais, eau chaude salée pendant l'opération. Afin de minimiser la formation de caillots sanguins et d'embolie d'air qui peut conduire à la paralysie des membres postérieurs, les sites d'anastomose des vaisseaux doivent être bien rincés avant la fermeture. Intestin doit être remplacé attentivement completisur la transplantation pour éviter toute torsion du mésentère. Injection sous-cutanée de 0,6 ml de sérum physiologique chaud aide à la récupération des animaux alors un plus grand volume de liquide par voie intraveineuse peu de temps après la chirurgie peut causer l'hypertension et le saignement des anastomoses. Limiter le temps que l'aorte destinataire et IVC sont croix serrés à moins de 30 minutes permettra d'améliorer le taux de réussite.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le Conseil national de la santé et de la recherche médicale (NHMRC) de l'Australie subvention de projet de 1.029.205, par la Fondation Microsearch de l'Australie, et par la Fondation Myee Codrington recherche médicale.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Operating microscope | Leica, Heerbrugg, Switzerland | M651 | 10-25X magnification |
| Anesthetic machine | Vet Quip Pty Ltd, Sydney, Australia | Vett3 | Capable of delivering a mixture of isoflurane and oxygen in air |
| Operating board | Hardware store or office supplier | Dense cork or synthetic capable of taking pins | |
| Heparinized saline (5 U/ml, 4 °C) | Pfizer, USA | FW25 | In 1 ml syringe with 23 G needle on ice |
| Normal saline (37 °C) | AstraZeneca Pty Ltd, Australia | 4538 | In 1 ml syringe with 23 G needle on warm pad |
| Sutures 10- nylon, 5-0 Vicryl | Ethicon, Inc. NJ, USA | 2870G/J421H | |
| Buprenorphine (0.05 mg/kg in 0.1 ml saline) | Reckitt Benckiser, Sydney, Australia | In 1 ml syringe with 23 G needle on ice | |
| Ampcillin (5 mg/kg in 0.1 ml saline) | Aspen, Sydney, Australia | In 1 ml syringe with 23 G needle on ice | |
| Gel Foam | Pharmacia & Upjohn Co. USA | 801289304 | Cut into small pieces |
| High temperature cautery device | Medtronic, USA | 8444000 | |
| Heating Pad/Right Temp | Kent Scientific Corporation, Turrington, CT 06790 | ||
| Microsurgery instruments: | Shanghai Medical Instruments Co. Ltd., | ||
| Microneedleholders | Shanghai, China | WT2020 | |
| Microscissors | " " | WT1020 | |
| Microforceps (straight tip) | " " | WA3010 | |
| Microforceps (curved tip) | " " | WA3020 | |
| Micromosquito clamps (1 pair) | " " | W40350 | |
| Microvessel atraumatic clamps (1 pair) | " " | W40130/W40150 |
References
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