Abstract
I topi sono spesso usati come donatori e riceventi trapianto di cuore negli studi di immunologia dei trapianti grazie alla vasta gamma di topi transgenici e reagenti disponibili. Una difficoltà è presentato a causa delle ridotte dimensioni dell'animale e le considerevoli sfide tecniche della microchirurgia coinvolto nel trapianto di cuore. In particolare, un alto tasso di guasto tecnico subito dopo il trapianto può risultare dalla morte del destinatario e complicanze post-operatorie come la paralisi degli arti posteriori o un cuore non batte. Qui, la tecnica completa per il mouse eterotopico trapianto cardiaco è dimostrata, coinvolgendo raccolta del cuore del donatore e del suo successivo impianto in un topo ricevente. Il cuore del donatore viene raccolto subito dopo in situ perfusione con soluzione salina eparinizzata e freddo recisione dell'aorta ascendente e l'arteria polmonare. L'operazione destinatario prevede la preparazione dell'aorta addominale e la vena cava inferiore (IVC), seguita daend-to-side anastomosi dell'aorta donatore con l'aorta destinatario utilizzando una singola corsa 10-0 microsuture e una simile anastomosi dell'arteria polmonare donatore con il destinatario IVC. A seguito dell'operazione l'animale viene iniettato con 0,6 ml di soluzione salina normale per via sottocutanea e permesso di recuperare su una piastra elettrica 37 ° C. I risultati di 227 trapianti di cuore del mouse sono riassunti con un tasso di successo a 48 ore del 86,8%. Dei fallimenti del 13,2% entro 48 ore, 5 (2,2%) hanno sperimentato la paralisi degli arti posteriori, 10 (4,4%) hanno avuto un cuore non batte a causa di innestare lesione ischemica e / o trombosi, mentre il 15 (6,6%) sono morti entro 48 ore .
Introduction
Modelli animali di trapianto di organi in grado di fornire informazioni preziose per migliorare il trattamento dei pazienti sottoposti a trapianto clinici. Modelli murini sono particolarmente utili per studiare il meccanismo immunitario di rigetto del trapianto o accettazione a causa della vasta gamma di topi e reagenti specifici per i topi che non sono disponibili per altri modelli animali 1-3 geneticamente modificati. Una sfida con i modelli murini di trapianto è la piccola dimensione dei donatori e dei riceventi che richiede notevole abilità tecnica per ottenere risultati soddisfacenti.
Una tecnica è stata descritta per la prima per il trapianto eterotopico di cuori nei ratti 4 che è stato successivamente adattato per il mouse trapianto di cuore da Corry et al 5. Questa tecnica, nella redazione del destinatario prima dell'operazione donatore e non perfusione del cuore del donatore, entrambi i quali sono suscettibili di compromettere la sopravvivenza del cuore o t trapiantatoegli destinatario. Il procedimento è stato ampiamente utilizzato come originariamente descritto per esaminare i meccanismi di rigetto del trapianto e tolleranza 6-8. Altri hanno adattato il ratto cuore procedura di trapianto originale di Ono e Lindsey per i trapianti di cuore nei topi 9,10. Più recentemente, è stata pubblicata una tecnica per il mouse trapianto cardiaco che ha superato alcuni dei problemi associati al metodo di Corry et al 11. Il protocollo qui descritto incorpora nostre modifiche, sulla base del metodo di Mottram et al 12, che comprendono: in situ perfusione con soluzione salina eparinizzata freddo subito dopo toracotomia ed esecuzione dell'operazione donatore prima dell'operazione destinatario per minimizzare il tempo di funzionamento destinatario. Inoltre, utilizziamo i piccoli morsetti vasi atraumatica invece di 6-0 cravatte di seta. Sebbene pinze nave hanno lo svantaggio di prendere più spazio che sono più facili da controllare rispetto legami, che non dovrebbe essere troppo stretto o allentatoe sono meno semplici da rimuovere rispetto morsetti. Il nostro metodo utilizza una singola sutura continua per vaso anastomosi, sebbene nella formazione iniziale fasi alternativa è quella di utilizzare suture al prossimali e distali angoli per garantire uniformità di suture e quindi la pervietà delle anastomosi.
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Protocol
Prima dell'inizio degli esperimenti, ottenere l'approvazione da Animal Care comitato etico dell'istituzione competente per gli esperimenti previsti. Mantenere i topi in conformità con i requisiti della vostra istituzione. Il seguente protocollo è stato approvato dai comitati Sydney University e Royal Prince Alfred Hospital.
Prima di iniziare l'intervento, tutti gli strumenti devono essere puliti a fondo e sterilizzati immergendo nel 80% di etanolo. Alcuni istituti prevedono la sterilizzazione in autoclave tuttavia questo potrebbe danneggiare gli strumenti di microchirurgia sottili a lungo termine. Ove possibile uso sterile materiale monouso.
1. Anestesia
- Anestetizzare mouse con isoflurano in un contenitore sigillato poi metterlo in posizione supina su una scheda operativa, che collega rapidamente cono di anestetico. Test di adeguatezza dell'anestesia pizzicando il piede posteriore per garantire che non vi è alcun riflesso.
- Shave la pelle con una lama chirurgica esterilizzare con l'80% di etanolo. Inoltre, 2% clorexidina nel 70% di alcol isopropilico può essere utilizzata per la sterilizzazione pelle. Durante l'induzione dell'anestesia concentrazione isoflurano è 3% ma ridurre questo fino a 1-1,5% per manutenzione. Apportare piccole modifiche a questa concentrazione per mantenere la respirazione regolare e la frequenza cardiaca. Mantenere la temperatura dell'animale su una piastra elettrica.
2. Funzionamento donatori
- Effettuare una toracotomia per esporre il cuore ed i vasi tagliando il torace attraverso entrambi i lati della gabbia toracica dal bordo costola fino al cavo ascellare seguita da un taglio trasversale a livello del xiphisternum per formare un lembo parete toracica. Sollevare questo lembo accanto alla testa e il pin alla scheda operativa. Strappare pericardio per esporre cuore e dei vasi.
- Sollevare la vena cava inferiore con una pinza in una mano e con l'altra iniettare 1 ml di soluzione fisiologica fredda prossimale eparinata al cuore attraverso la vena cava inferiore, poi mettere una fascetta piccola arteria sulla IVC di prevenzionet flusso della soluzione di perfusione attraverso il foro dell'ago.
- Utilizzo di garza e un cotton fioc, ritrarre il cuore verso il basso per esporre l'aorta ascendente e l'arteria polmonare. Passare una lama di una coppia di microscissors attraverso il canale (seno trasverso) posteriormente al fascio di aorta e l'arteria polmonare e tagliare l'aorta e l'arteria polmonare insieme come distalmente possibile per garantire lunghezza sufficiente per anastomosi.
- Legame e dividere la IVC, vena cava superiore destro (SVC), a sinistra SVC e vene polmonari con 6-0 filo di seta. Legare il IVC e SVC destra separatamente quindi inserire un singolo thread posteriore al cuore per circondare la SVC sinistra insieme a vene polmonari e legarlo. Raccolto il cuore dal sito donatore tagliando i vasi distali ai legami, poi riporla in freddo soluzione salina sterile a 4 ° C fino al momento del trapianto. Questo comporta la morte del donatore per dissanguamento.
3. Funzionamento del destinatario
- Anestetizzare l'destinatario come sopra (sezione 1). Radersi con cura addome per evitare l'irritazione, poi fare una laparotomia dalla mediana incisione dal pube al xiphisternum e ritrarre con graffette piegate a formare divaricatori. Avvolgere l'intestino in soluzione salina calda imbevuta garza sterile e ritrarre in alto a destra dell'addome.
- Per esporre l'aorta infra-renale e IVC, liberare i segmenti bundle di aorta e IVC dalla arteria renale sinistra e la vena alla biforcazione iliaca, suddividendoli dai vasi lombari utilizzando un dispositivo di cauterizzazione. Fate attenzione che la cauterizzazione è alla giusta temperatura ed utilizzato per un tempo sufficiente per dividere e sigillare le estremità dei vasi.
- Applicare piccoli morsetti vasi atraumatica per l'aorta e segmenti IVC distalmente e prossimalmente. Fare un'incisione nella parete anteriore dell'aorta dapprima fora un buco con un ago 30 G; poi tagliare un'incisione verticale con microscissors per adattarsi alle dimensioni dell'aorta donatore. Lavare il lume dell'aorta con soluzione salina eparinizzata per rimuovere eventuali blcoaguli OOD.
- Portare il cuore donatore al sito ricevente coperto con garza imbevuta di soluzione salina fredda e posizionarlo sul lato destro dell'addome. Assicurarsi che l'aorta donatore è posizionato vicino alla incisione sull'aorta destinatario e l'arteria polmonare donatore posizionato accanto al destinatario IVC.
- Anastomose lato end-to-aorta donatore all'aorta destinatario utilizzando esecuzione 10-0 suture in nylon partire dall'angolo prossimale e sutura sul lato sinistro prima fino a raggiungere l'angolo distale, in quale fase l'animale è ruotato di 180 °. Spostare delicatamente il cuore del donatore al lato sinistro dell'addome per esporre il lato destro dell'aorta e continuare sutura attraverso il lato destro della parete aortica dall'estremità distale all'estremità prossimale. Prima di chiudere l'anastomosi aortica, lavare delicatamente il lume con soluzione fisiologica eparinizzata per rimuovere eventuali coaguli e l'aria.
- Anastomose l'arteria polmonare donatore (PA) end-to-side con il destinatario IVC. Praticare un'incisione verticamente con microscissors nella parete anteriore della IVC in un sito in conformità con l'anastomosi dell'arteria. Anastomose il donatore PA al destinatario IVC con l'esecuzione di 10-0 suture in nylon a partire dalla fine distale della parete sinistra all'interno del lume della IVC. Dopo aver raggiunto l'estremità prossimale, continuare suture lungo la parete laterale anteriore destro fino all'estremità distale per completare l'anastomosi. Prima di chiudere l'anastomosi, lavare delicatamente il lume per eliminare eventuali grumi e aria.
- Prima di rilasciare la nave morsetti, posto pezzi di Gelfoam intorno ai siti di anastomosi, e applicare una leggera pressione con un applicatore di cotone fino a raggiungere l'emostasi. Al momento della rivascolarizzazione, allentare il blocco distale prima, seguita dalla pinza prossimale.
- Dopo rivascolarizzazione, applicare salina calda a 37 ° C per l'innesto esternamente per aiutare il recupero. L'innesto di solito inizia fibrillazione immediatamente e ritorna spontaneamente a ritmo sinusale in pochi minuti. Iniettare 0,6 ml caldisalina per via sottocutanea per mantenere l'idratazione del destinatario. Iniettare per via sottocutanea buprenorfina per l'analgesia prima del completamento di un intervento chirurgico
- Chiudere la ferita addominale con una sutura 5-0 assorbibile corsa per entrambi gli strati. Inizia completando lo strato interno e proseguire lungo la pelle.
4. Recupero e Graft monitoraggio
- Iniettare ampicillina per la profilassi di infezioni e collocare il recipiente su una piastra elettrica a 37 ° C per il recupero. La maggior parte degli animali recuperano rapidamente e di solito bevono e spesso mangia nel raggio di 3 ore. Se il mouse mostra segni di sofferenza, esaminare attentamente per determinare la causa. Se nessuna causa evidente, il trattamento con buprenorfina e monitorare attentamente. Consultare un veterinario se i sintomi sono gravi o persistono per più di 8 ore e prendere in considerazione l'eutanasia. Se necessario, dare continuando 12 iniezioni orarie di buprenorfina fino alla scomparsa dei sintomi. Se il mouse mostra segni di sofferenza dopo 8 ore, dare continuando 12iniezioni orarie di buprenorfina fino a che non risolvono. Consultare il veterinario se i sintomi persistono per più di 48 ore e euthanize se necessario.
- Controllo innesto battito cardiaco con la palpazione addominale diretta e registrare la forza del ritmo come + + + + per un innesto sano + per battere debole a causa di rifiuto avanzato e - come non battere a causa di completare il rigetto del trapianto. Controllo topi al giorno per i primi 10 giorni, poi 3 volte a settimana per tutta la durata dell'esperimento.
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Representative Results
Dopo un periodo di formazione iniziale, sono stati analizzati 227 casi di topo eterotopico trapianto di cuore nel nostro gruppo. Il tasso di successo nelle prime 24 ore è stata 90,3% e al 48 hr era 86,8%. Dei 30 (13,2%) guasti entro 48 ore, 5 (2,2%) hanno sperimentato paralisi degli arti posteriori e doveva essere l'eutanasia, 10 (4,4%) aveva un cuore non batte a causa di lesioni ischemia trapianto e / o trombosi, mentre il 15 (6,6%) sono morti entro 48 ore. Alcuni sopravvivenza dell'innesto sperimentali sono mostrati in Tabella 1 con una varietà di combinazioni di deformazione. Trapianti di cuore tra lo stesso donatore e ricevente ceppo sono state accettate a lungo termine, mentre i trapianti tra i ceppi non-identici sono stati respinti.
La comparsa di cuori trapiantati è mostrato in Fig. 1. La causa dell'insuccesso trapianto di cuore è generalmente determinata dal tempo dopo trapianto quando il cuore si è fermato in combinazione con la comparsa del cuore. Se necessario, la causadi cessazione del battito dovrebbe essere confermata mediante analisi istologica del cuore. Ad esempio, in un C57BL / 6 ceppo ricevente di un trapianto DBA / 2 cuore del donatore, il cuore ha cessato di battere il giorno 2, che è più insolito come rigetto nei riceventi non rivestite richiede solitamente almeno una settimana. Figura 1A mostra il cuore da questa destinatario con evidenza di trombosi e infarto del tessuto cardiaco. Nella combinazione di ceppo C57BL / 6 donatore di C57BL / 6 destinatario, il cuore non è stata respinta e sopravvissuto per> 100 giorni (Figura 1B). In questo caso il cuore era leggermente ridotto nelle dimensioni a causa di atrofia muscolare secondaria al suo status di non sostenere la vita. Al contrario, nella combinazione ceppo rigetto di DBA / 2 donatore di C57BL / 6 destinatario, il cuore trapiantato aveva cessato di battere al 7 ° giorno e ha mostrato evidenza di rigetto (Figura 1C). E 'stato completamente fibrotico e rimpicciolito da giorno 100 (Figura 1D).
Figura 1. Aspetto di trombosi, rifiutando e non rifiutando cuori trapiantati. (A) DBA / 2 cuore trapiantato a C57BL / 6 destinatario mostrando trombosi e cuore infartuato 7 giorni dopo il trapianto. (B) C57BL / 6 cuore trapiantato a C57BL / 6 destinatario che mostra un ben irrorato e battere il cuore 100 giorni dopo il trapianto. (C ) DBA / 2 cuore trapiantato a C57BL / 6 destinatario mostrando cuore respinto 7 giorni dopo il trapianto. (D) DBA / 2 cuore trapiantato a C57BL / 6 destinatario mostrando cuore respinto 100 giorni dopo il trapianto. Le frecce indicano il cuore trapiantato.
| Combinazioni | Sopravvivenze (giorni) | n | |
| B10.BR → B10.BR | > 200 x7 | 7 | > 200 |
| C57BL / 6 → C57BL / 6 | 40,> 200 x2 | 3 | > 200 |
| F1 → B10.BR | 8 x2, 9, 12 | 4 | 8.5 |
| 178,3 → B10.BR | 7 x2, x2 8, 9, 10, 12, 13 | 8 | 8.5 |
| C57BL / 6 → B10.BR | 8 x4, x2 9, 10 x5, 11, 12, 14 x2, 15 | 16 | 10 |
| BALB / c → C57BL / 6 | 7 x9 | 9 | 7 |
| DBA / 2 → C57BL / 6 | 6, 7 x10 | 11 | 7 |
La sopravvivenza del trapianto Tabella 1. Cuore in diverse combinazioni donatore / ricevente.
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Discussion
Trapianto di cuore Mouse è un metodo microchirurgico impegnativo, che richiede una notevole abilità chirurgica da padroneggiare. L'aspetto più difficile è il piccolo diametro dei vasi. Inoltre, è necessario limitare il tempo di funzionamento destinatario e sanguinamento. La tecnica per il mouse trapianto di cuore è stato descritto da Corry et al. nel 1973 e successivamente da Mottram et al 12. I nostri modifiche includono i seguenti punti. In primo luogo, la perfusione immediata del cuore del donatore con il freddo soluzione salina eparinizzata seguente toracotomia e la recisione di aorta e arteria polmonare pacchetto subito dopo perfusione impedisce ischemia calda durante la raccolta. In secondo luogo, iniziando la preparazione destinatario subito dopo il completamento della raccolta donatore, invece di preparare il destinatario prima del donatore, riduce il tempo di esposizione addominale nel ricevente con conseguente miglioramento della sopravvivenza. Infine, l'uso di piccoli vasi atraumatica morsetti abbloccare il flusso di sangue, invece di legami per il destinatario pacchetto aorta / IVC, di solito si traduce in meno danni ai vasi e può ridurre l'incidenza di paralisi degli arti posteriori.
Inoltre, i seguenti punti sono importanti per il successo. La dimensione ottimale dei donatori e dei riceventi è di circa 23-26 g ed età ottimale è di 10 a 12 settimane. Animali più vecchi non hanno più grandi vasi e il loro aumento del grasso rende l'esposizione dell'aorta e IVC più difficile. Disidratazione e ipotermia del destinatario durante l'intervento chirurgico deve essere evitato. Intestino destinatario deve essere ben protetto dalla disidratazione con soluzione salina calda garza imbevuta e il destinatario può essere mantenuta su una stuoia di riscaldamento a 37 ° C. La garza deve essere mantenuto umido dalla applicazione regolare di fresco, soluzione salina calda durante l'operazione. Per ridurre al minimo la formazione di coaguli di sangue e emboli aria che può portare alla paralisi degli arti posteriori, i siti di anastomosi dei vasi devono essere ben lavata prima della chiusura. Intestinale deve essere attentamente sostituito Completisu di trapianto per prevenire qualsiasi torsione del mesentere. L'iniezione sottocutanea di 0,6 ml soluzione salina calda aiuta il recupero degli animali, mentre un maggiore volume di liquidi per via endovenosa subito dopo l'intervento chirurgico può causare ipertensione e sanguinamento delle anastomosi. Limitare il tempo che l'aorta destinatario e IVC sono fissati croce per meno di 30 min migliorerà il tasso di successo.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dal Consiglio nazionale della sanità e ricerca medica (NHMRC) dell'Australia progetto di Grant 1.029.205, dalla Fondazione Microsearch dell'Australia, e dalla Myee Codrington Research Foundation medica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Operating microscope | Leica, Heerbrugg, Switzerland | M651 | 10-25X magnification |
| Anesthetic machine | Vet Quip Pty Ltd, Sydney, Australia | Vett3 | Capable of delivering a mixture of isoflurane and oxygen in air |
| Operating board | Hardware store or office supplier | Dense cork or synthetic capable of taking pins | |
| Heparinized saline (5 U/ml, 4 °C) | Pfizer, USA | FW25 | In 1 ml syringe with 23 G needle on ice |
| Normal saline (37 °C) | AstraZeneca Pty Ltd, Australia | 4538 | In 1 ml syringe with 23 G needle on warm pad |
| Sutures 10- nylon, 5-0 Vicryl | Ethicon, Inc. NJ, USA | 2870G/J421H | |
| Buprenorphine (0.05 mg/kg in 0.1 ml saline) | Reckitt Benckiser, Sydney, Australia | In 1 ml syringe with 23 G needle on ice | |
| Ampcillin (5 mg/kg in 0.1 ml saline) | Aspen, Sydney, Australia | In 1 ml syringe with 23 G needle on ice | |
| Gel Foam | Pharmacia & Upjohn Co. USA | 801289304 | Cut into small pieces |
| High temperature cautery device | Medtronic, USA | 8444000 | |
| Heating Pad/Right Temp | Kent Scientific Corporation, Turrington, CT 06790 | ||
| Microsurgery instruments: | Shanghai Medical Instruments Co. Ltd., | ||
| Microneedleholders | Shanghai, China | WT2020 | |
| Microscissors | " " | WT1020 | |
| Microforceps (straight tip) | " " | WA3010 | |
| Microforceps (curved tip) | " " | WA3020 | |
| Micromosquito clamps (1 pair) | " " | W40350 | |
| Microvessel atraumatic clamps (1 pair) | " " | W40130/W40150 |
References
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