Abstract
Los ratones a menudo se utilizan como donantes de trasplante de corazón y de los beneficiarios en los estudios de la inmunología del trasplante debido a la amplia gama de ratones transgénicos y reactivos disponibles. Una dificultad se presenta debido al pequeño tamaño del animal y los desafíos técnicos considerables de la microcirugía involucrados en el trasplante de corazón. En particular, una alta tasa de fallo técnico poco después del trasplante puede ser consecuencia de la muerte del receptor y las complicaciones postoperatorias tales como parálisis de las extremidades posteriores o un corazón no late. Aquí, la técnica completa para un trasplante cardíaco heterotópico ratón se demuestra, que implica la recolección del corazón del donante y su posterior implante en un ratón receptor. El corazón del donante se cosecha inmediatamente después de la perfusión in situ con solución salina heparinizada fría y transección de la aorta ascendente y la arteria pulmonar. La operación de receptor implica la preparación de la aorta abdominal y la vena cava inferior (VCI), seguido poranastomosis de extremo a lado de la aorta del donante con la aorta destinatario utilizando un solo funcionamiento 10-0 microsutura y una anastomosis similar de la arteria pulmonar del donante con el receptor IVC. Después de la operación el animal se inyecta con 0,6 ml por vía subcutánea con solución salina normal y se le permite recuperarse de una almohadilla térmica 37 ° C. Los resultados de 227 trasplantes de corazón de ratón se resumen con una tasa de éxito a las 48 h de 86,8%. De los 13,2% de fallos dentro de 48 horas, 5 (2,2%) experimentaron parálisis de las extremidades posteriores, 10 (4,4%) tenían un corazón sin latir debido a injertar lesiones y / o trombosis isquémica, mientras que 15 (6,6%) fallecieron dentro de las 48 horas .
Introduction
Los modelos animales de trasplante de órganos pueden proporcionar información valiosa para mejorar el tratamiento de los pacientes con trasplante clínico. Los modelos de ratón son particularmente útiles para estudiar el mecanismo inmunológico de rechazo de trasplante de órgano o aceptación debido a la amplia gama de ratones y reactivos específicos para los ratones que no están disponibles para otros modelos animales 1-3 modificados genéticamente. Uno de los retos con los modelos de ratón de trasplante es el pequeño tamaño de los donantes y los receptores que requiere considerable habilidad técnica para lograr resultados satisfactorios.
Una técnica fue descrita por primera vez para el trasplante heterotópico de corazón en ratas 4 que fue adaptado posteriormente para el trasplante de corazón de ratón por Corry et al 5. Esta técnica implicó la preparación del receptor antes de la operación de donante y sin perfusión del corazón del donante, ambos de los cuales son susceptibles de comprometer la supervivencia del corazón o t trasplantadoél recibe. El procedimiento ha sido ampliamente utilizado como se describe originalmente para examinar los mecanismos de rechazo de trasplante y la tolerancia 6-8. Otros han adaptado el procedimiento de trasplante de corazón originales de rata de Ono y Lindsey para trasplantes de corazón en ratones 9,10. Más recientemente, se publicó una técnica para el ratón trasplante de corazón que se sobrepuso a algunos de los problemas asociados con el método de Corry et al 11. El protocolo descrito aquí incorpora nuestras modificaciones, basados en el método de Mottram et al 12, que incluyen: en la perfusión in situ con solución salina heparinizada fría inmediatamente después de la toracotomía y la realización de la operación de donantes antes de la operación destinatario para minimizar el tiempo de operación de receptor. Además, utilizamos pequeñas pinzas atraumáticas vasos en lugar de 6-0 corbatas de seda. Aunque las abrazaderas de los vasos tienen la desventaja de tener más espacio que son más fáciles de controlar que los lazos, que no debe ser demasiado apretado o sueltoy son menos fáciles de eliminar que abrazaderas. Nuestro método utiliza una única sutura continua para la anastomosis recipiente, aunque en el aprendizaje inicial etapas de una alternativa es usar suturas de sujeción en los extremos proximal y distal esquinas para garantizar la uniformidad de las suturas y de este modo la permeabilidad de la anastomosis.
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Protocol
Antes del comienzo de los experimentos, obtener la aprobación del Comité de Ética del cuidado animal de la institución pertinente para los experimentos planeados. Mantener los ratones en la conformidad con los requisitos de su institución. El siguiente protocolo ha sido aprobado por los comités de la Universidad de Sydney y el Hospital Royal Prince Alfred.
Antes de comenzar la cirugía, todos los instrumentos deben limpiarse a fondo y se esterilizaron por inmersión en etanol al 80%. Algunas instituciones estipulan autoclave sin embargo, esto puede dañar los instrumentos de microcirugía finos en el largo plazo. Siempre que sea posible el uso de equipo desechable estéril.
1. Anestesia
- Anestesie ratón con isoflurano en un recipiente sellado y luego colocarlo en decúbito supino sobre una tabla de funcionamiento, conectando rápidamente cono de la nariz anestésico. Prueba de adecuación de la anestesia pellizcando la pata trasera para asegurar que no hay reflejo.
- Shave la piel con una cuchilla quirúrgica yesterilizar con etanol al 80%. Además, clorhexidina al 2% en 70% de alcohol isopropílico se puede utilizar para la esterilización de la piel. Durante la inducción de la anestesia de la concentración de isoflurano es del 3%, pero reducir esto a 1-1,5% para el mantenimiento. Hacer pequeños ajustes a esta concentración para mantener una respiración regular y la frecuencia cardíaca. Mantenga la temperatura del animal sobre una almohadilla térmica.
2. Operación de donantes
- Hacer una toracotomía para exponer el corazón y los vasos cortando el pecho a través de ambos lados de la caja torácica desde el borde de costilla hasta la axila seguido de un corte transversal a nivel de la xiphisternum para formar un colgajo de la pared torácica. Levante esta solapa hacia arriba al lado de la cabeza y el pin a la placa operativo. Arranque pericardio para exponer el corazón y los vasos.
- Levante la vena cava inferior con unas pinzas en una mano y con la otra inyectar 1 ml frío proximal salina heparinizada al corazón a través de la vena cava inferior, a continuación, poner una abrazadera de las arterias pequeñas en el IVC para prevenciónt flujo de la solución de perfusión a través del agujero de la aguja.
- El uso de una gasa y un bastoncillo de algodón, retraiga el corazón hacia abajo para exponer la aorta ascendente y la arteria pulmonar. Pasar una hoja de un par de microtijeras a través del canal (seno transverso) posterior al haz de la aorta y la arteria pulmonar y cortar la aorta y la arteria pulmonar juntos hasta distalmente como sea posible para asegurar una longitud suficiente para la anastomosis.
- Empate y dividir el IVC, la vena cava superior derecha (SVC), izquierda SVC y las venas pulmonares utilizando hilo de seda 6-0. Ate el IVC y derecha SVC separado y luego coloque un solo hilo posterior al corazón para rodear el SVC izquierda junto a las venas pulmonares y atarlo. Coseche el corazón de la zona donante mediante la reducción de los vasos distales a los lazos, a continuación, guárdelo en una solución salina estéril en frío a 4 º C hasta el trasplante. Esto da lugar a la muerte del donante por desangrado.
3. Operación Receptor
- Se anestesia ladestinatario que el anterior (sección 1). Afeitarse con cuidado el abdomen para evitar la irritación, a continuación, hacer una laparotomía por línea media incisión desde el pubis al xiphisternum y retraer el uso de clips de papel doblado para formar retractores. Envuelva el intestino en caliente salina empapado gasa estéril y se retraen a la parte superior derecha del abdomen.
- Para exponer la aorta infra-renal y la vena cava inferior, liberar los segmentos de paquetes de aorta y vena cava inferior de la arteria renal izquierda y la vena a la bifurcación ilíaca dividiendo ellos de los vasos lumbares utilizando un dispositivo de cauterio. Tenga cuidado de que el cauterio esté a la temperatura correcta y se utiliza durante un tiempo suficiente para dividir y sellar los extremos de los vasos.
- Aplicar pequeñas pinzas atraumáticas vasos a la aorta y segmentos IVC distal y proximal. Hacer una incisión en la pared frontal de la aorta por primera perforación de un agujero con una aguja 30 G; luego se corta una incisión vertical con micro tijeras para que coincida con el tamaño de la aorta de donantes. Enjuague el lumen de la aorta con solución salina heparinizada para eliminar cualquier blcoágulos ood.
- Traiga el corazón del donante a la zona receptora cubierto con una gasa empapada en solución salina fría y colóquela en el lado derecho del abdomen. Asegúrese de que la aorta del donante se coloca al lado de la incisión en la aorta receptor y la arteria pulmonar del donante posicionado al lado del receptor IVC.
- Anastomosan el lado de extremo a extremo de la aorta del donante a la aorta destinatario utilizando corriendo 10-0 de nylon partir de la esquina y la sutura proximal a lo largo del lado izquierdo primero, hasta llegar a la esquina distal, en cuya etapa el animal se gira 180 °. Mover suavemente el corazón del donante hacia el lado izquierdo del abdomen para exponer el lado derecho de la aorta y continuar la sutura a través del lado derecho de la pared aórtica desde el extremo distal hasta el extremo proximal. Antes de cerrar la anastomosis aórtica, lave suavemente el lumen con solución salina heparinizada para eliminar cualquier coágulo y aire.
- Anastomosis de la arteria pulmonar del donante (PA) de extremo a lado con el destinatario IVC. Hacer una incisión verticamente con microtijeras en la pared frontal de la VCI en un sitio de conformidad con la anastomosis de la arteria. Anastomosan el donante PA para el destinatario IVC con el funcionamiento de suturas de nylon 10-0 a partir de el extremo distal de la pared de la izquierda dentro del lumen de la vena cava inferior. Después de alcanzar el extremo proximal, continuar suturas a lo largo de la pared lateral delantera derecha hasta el extremo distal para completar la anastomosis. Antes de cerrar la anastomosis, lave suavemente la luz para eliminar cualquier coágulo y aire.
- Antes de liberar el buque, abrazaderas colocar piezas de Gelfoam alrededor de los sitios de anastomosis, y aplique una presión suave con un aplicador de algodón hasta conseguir la hemostasia. En el momento de la revascularización, liberar la pinza distal primero, seguido por la mordaza proximal.
- Tras la revascularización, aplique una solución salina caliente a 37 ° C para el injerto de forma externa para ayudar a su recuperación. El injerto por lo general comienza auricular inmediatamente y vuelve espontáneamente a ritmo sinusal dentro de unos pocos minutos. Inyectar 0,6 ml de abrigopor vía subcutánea de solución salina para mantener la hidratación del destinatario. Inyectar por vía subcutánea buprenorfina para la analgesia antes de la finalización de la cirugía
- Cierre la herida abdominal con una sutura continua absorbible 5-0 para ambas capas. Comience por completar la capa interna y continuará a lo largo de la piel.
4. Recuperación y Monitoreo de injerto
- Inyectar la ampicilina para la profilaxis de la infección y colocar el receptor sobre una almohadilla de calentamiento a 37 ° C durante la recuperación. La mayoría de los animales se recuperan rápidamente y por lo general están bebiendo y comiendo a menudo menos de 3 horas. Si el ratón muestra signos de sufrimiento, examinar de cerca para determinar la causa. Si hay una causa obvia, el tratamiento con buprenorfina y vigilar de cerca. Consulte a un veterinario si los síntomas son severos o persisten más de 8 horas y considerar la eutanasia. Si es necesario, dar continuo 12 inyecciones por hora de buprenorfina hasta que los síntomas desaparezcan. Si el ratón muestra signos de sufrimiento después de 8 horas, que sigan siendo 12inyecciones por hora de buprenorfina hasta que los que resuelven. Consulte con el veterinario si los síntomas continúan por más de 48 horas y la eutanasia si es necesario.
- Monitorear injerto latido del corazón mediante palpación abdominal directa y registrar la fuerza de latido como + + + + para un injerto sano a + para tiempo débil debido al rechazo avanzada y - como no golpes debido a completar el rechazo del injerto. Monitorear los ratones diariamente durante los primeros 10 días, a continuación 3 veces por semana durante la duración del experimento.
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Representative Results
Después de un periodo de formación inicial, se analizaron 227 casos de ratón heterotópico trasplante de corazón en nuestro grupo. La tasa de éxito dentro de la primera 24 horas fue del 90,3% y a las 48 horas era 86,8%. De los 30 (13,2%) los fallos dentro de 48 horas, 5 (2,2%) experimentaron parálisis de las extremidades posteriores y tuvo que ser sacrificado, 10 (4,4%) tenía un corazón sin latir debido a la lesión de isquemia del injerto y / o trombosis, mientras que 15 (6,6%) fallecieron dentro de las 48 horas. Algunas supervivencias de injerto experimentales se muestran en la Tabla 1 con una variedad de combinaciones de deformación. Los trasplantes de corazón entre el mismo donante y cepa receptora se aceptaron a largo plazo, mientras que los trasplantes entre las cepas no idénticos fueron rechazadas.
La aparición de los corazones trasplantados se muestra en la Figura 1. La causa de la insuficiencia trasplante de corazón es generalmente determinada por el tiempo después del trasplante cuando el corazón dejó de latir en combinación con la aparición del corazón. Si es necesario, la causade cese del latido debe ser confirmado por análisis histológico del corazón. Por ejemplo, en una cepa receptora de un trasplante de DBA / 2 de los donantes de corazón C57BL / 6, el corazón dejó de latir en el día 2, que es más común como el rechazo en receptores no sensibilizados por lo general toma por lo menos una semana. Figura 1A muestra el corazón de este destinatario con pruebas de trombosis e infarto del tejido del corazón. En la combinación de la cepa C57BL / 6 donantes para C57BL / 6 receptor, el corazón no fue rechazada y sobrevivió durante> 100 días (Figura 1B). En este caso, el corazón se había reducido ligeramente de tamaño debido a la atrofia muscular secundaria a su condición de no mantener la vida. En contraste, en la combinación cepa rechazo de DBA / 2 de donantes a ratones C57BL / 6 receptor, el corazón trasplantado había cesado de latir por día 7 y mostró evidencia de rechazo (Figura 1C). Fue completamente fibrótica y encogida por día 100 (Figura 1D).
Figura 1. Aparición de trombosis, rechazo y no rechazo de los corazones trasplantados. (A) de DBA / 2 corazón trasplantado a ratones C57BL / 6 receptor mostrando trombosadas y del corazón infartado 7 días después del trasplante. (B) C57BL / 6 corazón trasplantado a ratones C57BL / 6 receptor que muestra una buena perfusión y el corazón palpitante 100 días después del trasplante. (C ) DBA / 2 corazón trasplantado a ratones C57BL / 6 receptor que muestra el corazón rechazado 7 días después del trasplante. (D) DBA / 2 corazón trasplantado a ratones C57BL / 6 receptor que muestra el corazón rechazado 100 días después del trasplante. Las flechas indican el corazón trasplantado.
| Combinaciones | Las supervivencias (días) | n | |
| B10.BR → B10.BR | > 200 x7 | 7 | > 200 |
| C57BL / 6 → C57BL / 6 | 40,> 200 x2 | 3 | > 200 |
| F1 → B10.BR | X2 8, 9, 12 | 4 | 8.5 |
| 178,3 → B10.BR | 7 x2, x2 8, 9, 10, 12, 13 | 8 | 8.5 |
| C57BL / 6 → B10.BR | 8 x4, 9 x2, x5 10, 11, 12, 14 x2, 15 | 16 | 10 |
| BALB / c → C57BL / 6 | 7 x9 | 9 | 7 |
| DBA / 2 → C57BL / 6 | 6, 7 x10 | 11 | 7 |
Tabla 1. Corazón supervivencia del injerto en diferentes combinaciones donante / receptor.
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Discussion
Ratón trasplante de corazón es un método microquirúrgico difícil que requiere considerable habilidad quirúrgica de dominar. El aspecto más difícil es el pequeño diámetro de los vasos. Además, es necesario limitar el tiempo de funcionamiento destinatario y sangrado. La técnica para el trasplante de corazón de ratón fue descrita por primera vez por Corry et al. en 1973 y posteriormente por Mottram et al 12. Nuestros modificaciones incluyen los siguientes puntos. En primer lugar, la perfusión inmediata del corazón del donante con solución salina heparinizada en frío tras la toracotomía y la transección de la aorta y la arteria pulmonar paquete poco después de la perfusión previene la isquemia caliente durante la cosecha. En segundo lugar, a partir de la preparación destinatario pronto después de la finalización de la recolección de los donantes, en lugar de preparar el receptor antes de que el donante, reduce el tiempo de exposición abdominal en el receptor, con la consiguiente mejora en la supervivencia. Por último, el uso de pequeño vaso atraumática abrazaderas abbloquear el flujo de sangre, en lugar de los lazos para el destinatario de la aorta / VCI paquete, por lo general resulta en menos daño a los vasos y puede reducir la incidencia de la parálisis de la extremidad posterior.
Además, los siguientes puntos son importantes para el éxito. El tamaño óptimo de los donantes y los receptores es de alrededor de 23 a 26 gy la edad óptima es de 10 a 12 semanas. Los animales más viejos no tienen buques de mayor tamaño y de su aumento de la grasa hace que la exposición de la aorta y la vena cava inferior más difícil. La deshidratación y la hipotermia del receptor durante la cirugía deben ser evitados. Intestinal destinatario debe estar bien protegido de deshidratación utilizando solución salina caliente gasa empapada y el destinatario se puede mantener en una estera de calefacción a 37 ° C. La gasa debe mantenerse húmedo por la aplicación regular de fresca, salina caliente durante la operación. Para reducir al mínimo la formación de coágulos de sangre y embolia de aire que puede conducir a la parálisis de las extremidades posteriores, los sitios de las anastomosis de los vasos deben estar bien sonrojado antes del cierre. Intestino debe ser reemplazado cuidadosamente completien de trasplante para evitar cualquier torsión del mesenterio. La inyección subcutánea de 0,6 ml de solución salina tibia ayuda a la recuperación de los animales, mientras que un mayor volumen de líquido por vía intravenosa después de la cirugía puede causar hipertensión y hemorragia de la anastomosis. La limitación del tiempo que la aorta destinatario y IVC se cruz sujetan a menos de 30 min mejorará la tasa de éxito.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el Health and Medical Research Council Nacional (NHMRC) de Australia Proyecto Subvención 1.029.205, por la Fundación Microsearch de Australia, y por la Fundación de Investigación Médica Myee Codrington.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Operating microscope | Leica, Heerbrugg, Switzerland | M651 | 10-25X magnification |
| Anesthetic machine | Vet Quip Pty Ltd, Sydney, Australia | Vett3 | Capable of delivering a mixture of isoflurane and oxygen in air |
| Operating board | Hardware store or office supplier | Dense cork or synthetic capable of taking pins | |
| Heparinized saline (5 U/ml, 4 °C) | Pfizer, USA | FW25 | In 1 ml syringe with 23 G needle on ice |
| Normal saline (37 °C) | AstraZeneca Pty Ltd, Australia | 4538 | In 1 ml syringe with 23 G needle on warm pad |
| Sutures 10- nylon, 5-0 Vicryl | Ethicon, Inc. NJ, USA | 2870G/J421H | |
| Buprenorphine (0.05 mg/kg in 0.1 ml saline) | Reckitt Benckiser, Sydney, Australia | In 1 ml syringe with 23 G needle on ice | |
| Ampcillin (5 mg/kg in 0.1 ml saline) | Aspen, Sydney, Australia | In 1 ml syringe with 23 G needle on ice | |
| Gel Foam | Pharmacia & Upjohn Co. USA | 801289304 | Cut into small pieces |
| High temperature cautery device | Medtronic, USA | 8444000 | |
| Heating Pad/Right Temp | Kent Scientific Corporation, Turrington, CT 06790 | ||
| Microsurgery instruments: | Shanghai Medical Instruments Co. Ltd., | ||
| Microneedleholders | Shanghai, China | WT2020 | |
| Microscissors | " " | WT1020 | |
| Microforceps (straight tip) | " " | WA3010 | |
| Microforceps (curved tip) | " " | WA3020 | |
| Micromosquito clamps (1 pair) | " " | W40350 | |
| Microvessel atraumatic clamps (1 pair) | " " | W40130/W40150 |
References
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