Summary
ここで紹介するテクニックは自由に単一波長露光を用いて微細な種を泳ぐのパスを測定します。 でエレガンスは、高価な顕微鏡の安価な代替としてシャドウイメージを示すために使用される。この技術は、方向、速度、加速度、力を測定するために様々な向き、環境および化学種を収容するように適合させることができる。
Abstract
本研究では、光の単一波長に応じて、水の列に懸濁させ、線虫の運動器官の行動に関与して位置、速度、加速度、力などの物理的特性の測定を可能にする安価で簡単な方法を示しています。我々は2つの異なる例を使用して、単一の波長シャドウイメージング（SWSI）を使用して微細な生物の運動性を評価する方法を示します。
最初の例は、Cの平均降下の体系的かつ統計的に実行可能な研究である水の欄に虫 。この研究のために、我々は生きていると死んだ野生型Cを使用我々は重力場の中死んワームの受動的な下降と虫活発な動きの速度および方向を比較すると虫。、本研究では、降下倍に差は認められなかった。平均降下は、コヒーレント633 nmのを使用してライブとデッドワームの両方のための0.1ミリメートル/秒±1.5ミリメートル/秒であったライト。
第二の例では、SELECT、個々のCのケーススタディである虫の垂直水柱における降下中に方向を変える。加速力は、この例では分析される。このケーススタディは、従来の顕微鏡ではアクセスできない環境で、単一の波長を用いて行動を評価しながらSWSIを用いて評価することができ、他の物理的特性の範囲を示しています。我々は、個々の線虫を推定し、この分析を使用すると、28を超えるnNの力で押圧することができる。
我々の調査結果は、回転、または重力場に対して移動するときに生きている線虫は28 nNのを発揮することを示している。の知見は、さらに、線虫が受動的水の欄に下降するが、積極的に主に方向を回転させることにより重力に耐えることができることを示唆している。
Introduction
線虫（Caenorhabditis elegans）は 、感覚生物学と行動を理解するための遺伝子調節、開発、最近のメカニズムを研究するための強力なモデル生物である自由生活に有益な土壌線虫である。唯一の302ニューロンにもかかわらず、C.エレガンスは、運動器官のパターン、生殖行動、ナビゲーション、走化性および他の多くの複雑な挙動が可能である。C.虫は機械受容、化学受容、さらには光（Ward ら 、2008）1の青色の波長を検出を有している。多くは、感覚運動機能の神経回路とCの一般的な運動器官のパターンについてはほとんど知られていながら、 虫は 、以下では、顕微鏡下でモデル化することができるよりも、複数の同時刺激又はより複雑な環境条件に対する反応について知られている。いくつかの研究は非常にプラスチック製の2,3,4である、より複雑な運動器官のパターンを明らかにした。私たちの方法論的アプローチは、NEMの研究が可能になります我々はすぐに、同時に複数の環境条件を提供することができ、リアルタイムで溶液中atodes。この質問は、従来の顕微鏡ベースのイメージング技術を用いて対処することは困難である。私達は私達の運動器官の挙動を調べるために水柱内線虫を配置するだけでなく、異なる環境条件に応答して運動を変更するために、線虫の能力を決定することを可能にするイメージング技術を開発した。
単一波長シャドウイメージング（SWSI）は、従来の顕微鏡の欠点に対処するために初めてこの論文で提示されている。伝統的な顕微鏡は、深さ5,6水平焦点面数ミクロンに種を観察するために制限されています。単一波長の研究に関しては、最も伝統的な顕微鏡は非常に広く、一般的に、50〜100nmの白色光をフィルタリングするためにカラーフィルタを使用しています。符号を維持しながらSWSIためのレーザを使用すると、1nm未満の波長の選択を狭めるificant光強度7。同様に、単一の波長は、C.の遊泳周波数を測定するために使用されているリアルタイム8 虫 。
本手法の最初のデモンストレーションのために、我々は自由に泳いでの水平方向の位置、X、および垂直方向の位置、Yを監視約センチメートルの距離で水柱におけるエレガンス 。重力にも垂直方向に作用するので特に、我々は、垂直方向の動きに興味を持っている。それは水柱に下降する垂直位置への線形フィットの勾配は、線虫の垂直速度、νyを与える。 
（1）
誤差（RMSE）9の二乗平均平方根は、フィットのクオリティを示しており、下降速度はほぼ一定であるかどうかを示します。垂直方向の速度が次いでEACのために平均化されるH種とデッドワーム。これらの結果を使用して、ワームの経験を推定することができるドラッグ。
私たちの方法の第二のデモンストレーションのために、我々はCを選択した観察ワームの大半とは異なり、一定の速度で降下していなかった虫 。選択されたワームは振り向くと、上向きに泳いまたは下降を続ける前に、しばらくの間で推移どちらか。物理的には、このケーススタディは、スイミング微生物の推力を算出することができることを示している。ニュートンの法則は、方向性を変えるボディは正味の力を意味する、促進することを指示し、 
、その本体10に作用している。 
（2）
どこ
です線形運動量とtは時間である。ワームの質量は一定のままであるので、ワームの加速度がウォームに作用する力に直接比例する。その結果、垂直方向の正味の力は、次のとおりです。 
（3）
mは、ワームの質量であり、yは垂直方向の加速度を表す。垂直方向の正味の力は、同じ方向にワームの推力を表します。総推力を考慮に水平成分を取ることによって算出することができる。
Protocol
1。C.虫の準備
- 若年成人でのペトリ皿を準備しますCの懸濁する前の実験で説明したように虫流体満たされたキュベット11内の虫 。
- ビデオ分析の当日、そのままステップ2で説明したように、プラチナのピックを使用して、脱イオン蒸留水で満たされたキュベットにライブの若い大人の線虫を選択します。
- 死んCを準備クロロホルム曝露とエレガンス 。ステップ2で説明したライブ線虫を選んで記載した手順に従って続行します。
ビデオ分析のための2。光学装置
- 図1に示すように、影の画像を作成するための実験装置を組み立てる。カメラであれば、画面の正面図を捕捉することができるように、画面から任意の距離に配置することができる。良い場所は、画面に直面してキュベットに隣接しています。
- 少なくとも二つのミラーをするために使用してビームは、12mmの直径に拡張されるように、ガリレイビームエキスパンダーに調整可能なヘリウムネオンレーザ出力を操縦する。
- ビームが遮られずにピンホールを通過するようにビーム経路内に1つまたは2つのピンホールを配置する。位置合わせが維持される保証するために、ピンホールを使用してください。
- 10ミリメートルの深さ4センチ、10ミリメートル幅で取り付けられた石英キュベットに拡大されたビームを演出します。
- 75ミリメートルの正の焦点距離の平凸レンズを使ってビームを拡大。
- 約120センチメートルレンズからの投写画面に配置します。これを超える距離では影の画像のより大きな拡大率が得られます。しかしながら、画像の品質は、より低い光強度と回折干渉の増加目立ちに減少する。
- すぐ隣の画面に直面してキュベットに、少なくとも60 FPSが可能な高速度カメラを配置します。
- 光学セットの近くに解剖顕微鏡を配置キュベットへの線虫の迅速な転送のためのアップ。
- ビームは、画面上に定規の拡大像を投影するように一時的に拡大されたビームに対して垂直なキュベットホルダの中心にMM部門と透明定規を固定します。ビデオ分析のための長さスケールを設定します。
- 投影スクリーン上の投影との干渉を避けるために投影された画像から透明定規オフセンターを使用して、スケールの距離をマーク。 ビデオについては、ここをクリックしてください。
- この画像を記録し、倍率を測定します。セットアップから定規を削除します。レンズを通して波長毎に光の屈折の角度として他の波長に対して、この手順を繰り返します色収差によるもので異なります。
- キュベットを交換し、蒸留水でリムの1ミリメートル以内にそれを埋める。
- スケールの距離を同じに含まれるように部屋のライトがオンになっている間録音を開始投影された画像などの映像。ライトの電源をオフにします。
- 薄くて平らに白金線ピックを使って、個々の若い成人での移動水の表面に触れることによりピックキュベットに寒天プレートから一度に1つのエレガンス 。それが原因で、散乱光に光を入射すると、線虫は、水柱に見えるようになります。 ビデオはこちらをクリックしてください。
- 彼らは拡大されたレーザビームを通過するワームの投影像を撮影。なお、投影像が反転すると、ワームがそれらの実際の動きとは反対方向に移動するように表示されることに留意することが重要である。重力で下降しているワームは、（ 図2）画面上で上方向に移動するように表示されます。
3。ビデオデータ準備
- ビデオ解析プログラムにビデオをインポートします。
- 以前に決定倍率を使用してスケールを設定します。
- TRACKとらパス全体にわたって少なくとも10のデータ·ポイントを持つ影の線虫の頭部の直線変位。
- 誘導体（「Y」、「時間」）を考えて、垂直方向の速度を見つけて、ステップ2.2で決定された倍率で、この値を割る。
4。データ解析
- Cの線形下降を分析虫 ：
- 対時間のグラフの縦位置のデータポイントは、一般的に直線を形成していることを確認してください。いくつかの逸脱は、線虫の頭の動きに無視することができます。データ点は、一般的に直線を形成している場合、それ以外の降下が非線形であると分析は、このプロトコルのステップ5.1を使用して継続されるべきで、4.1.2に進みます。
- 解析メニューからのデータへの直線12を嵌合することにより、線形回帰直線を作成します。この線の勾配は、次いでCの垂直方向の速度である。虫 。スロープは、特定の間隔での時間の変化で割った位置の変化である。このように生死ワームの下降速度（ 図3）を決定します。
- 線虫からの垂直遊泳速度を平均する。約50ワームのサンプルサイズで十分です。死んワームズドリフト速度でライブワームズ水泳速度を比較してください。
5℃の非線形運動を分析虫
- 第3節から、水柱（ 図4）内の非線形降下を示しており、分析されたビデオファイルを選択します。非線形降下は、このプロトコルのステップ4.1.1を用いて同定することができる。
- ビデオ分析ソフトウェアの「分析」メニューから「カーブフィット」を選択します。二次（二次）多項式を選択します。カーブにフィット。
- 関心のある領域については、各側Oのブラケットをスライドさせることで、グラフ上のフィット感を調整カーブフィット内および/またはウェルエラーバー内のデータ点に非常に近くなるまで、グラフ上にフィットfは。フィッティングプログラムは、時間に対する垂直方向の位置で近似曲線のための数学的な表現を提供します。物理的特性に関連したプログラムによって与えられた近似曲線の誤差を考慮してください。以下の15％の相対誤差は、通常は許容されます。
- 追加全曲線は、データの追加部分を覆うようにフィットする。スプライン13の最適な適用範囲のための関数：曲線はオーバーラップが収まることを確認し、重複領域になるように斜面の試合隣接カーブを揃えるようにしてください。
- ステップ5.1.3で得られた数式を用いて、近似曲線の導関数を取ることによって、関心領域のための速度を求める。速度が時間的に変化することがあります。誘導体は関数の傾きであることに注意してください。誘導体は、数学的またはグラフィックを得ることができる。この場合、指定された数学的な式とすることを使用するのは合理的であるession。
- 加速を得るために、フィット曲線の二次導関数を取る。加速度が時間的に変化することがあります。
- ワームは発揮推力を計算するためにワームの質量の加速を掛けます。合理的な推定質量はワームが水主に構成されていることを仮定して3μgのです。
Representative Results
着実ディセント
最初の調査は、C.の降下率に区別可能な違いを示していません633 nmのを使用してSWSI中の虫 。下降速度は、生存および死亡C.両方0.1 100mm /秒±1.5 100mm /秒で一定であることが見出された虫 。 50ワームのサンプルサイズは、生者と死者のワームの両方のための7％の合理的な分散を生成した。ドラグ力が重力マイナス浮力と等しくなるように下降速度が一定であるので、ワームに作用する加速度は存在しない。これは、ワームの密度が水よりもわずかに大きいことを意味する;ただし、以下の推定に線虫の密度がおよそその水であることを前提とすることは現実的である。
方向を変える
第二の調査、ケーススタディでは、線虫が方向を変化させることが可能であり、反対上向きに泳ぐことができることを実証している重力。これらの曲線の2次微分を対時間の加速（ 図5）は、グラフにスプラインすることができるように、二つの曲線は、線虫の垂直方向の変位に適合させた。 それは良いフィット感を維持しながら、可能な限り低く多項式秩序を維持することをお勧めします。下多項式オーダーは時間をかけて、加速中の変動が少ないことを示す。多項式の次数が高すぎる場合、より高次の多項式の項は無視できるので、不要となる。このワームは、2±0.002ミリメートル/秒2、向きを変えて、すぐ後まで同じレート0.110ミリメートル/秒2±0.002ミリメートル/秒2で加速0.110ミリメートル/秒の一定速度で減速 ターンアラウンド·ポイント。 C.加速度がゼロになるまで、100mm /秒2での0.00708 T - 虫は 1.252の減少の加速で上方に移動し続けています。心式の維持。 3、および3＆＃の推定イモムシの大群956、G、ワームはまもなくターンアラウンド·ポイントの後まで0.33のPN垂直正味の力、F ニューヨーク州 、受ける。
ディセント：重力、ドラッグ、浮力と推力（ 図6a）：ワームはターンアラウンド·ポイントに到達するまでのワームに作用する力の3種類があります。正味の力は、すべての3つの力のベクトル和に等しい。ここでは、垂直成分のみを考慮してください。
F はNy = F のDy + F TY-F G + F B（4）
ここで、F Bは、浮力である。 F G ワームの密度が水のそれであると仮定浮力方向に大きさが等しいが反対である。式4次に、以下のように記述できます。
F はNy = F のDy + F のTy（5）
F Nyが降下中一定に保たれる。これが意味すること線虫は、ターンアラウンド·ポイントに到達するまで、F のDy + F Tyが一定に保たれる。 F Dyが 、パスの先頭にある最上部に最も大きく、速度が方向転換点でゼロになるまで、徐々にゼロに減らすが、F のTy F ニューヨーク一定に保つために増加しなければならない。
ターンアラウンド：垂直速度がその時点でゼロに等しいので、折り返し点での垂直方向には抵抗力がありません。 図6bに示すように、F gは 、浮力、F B及び垂直ウォーム推力F のTy -垂直方向に作用する唯一の力は重力である。この時点で、Cの推力虫を決定することができる。
F のTy = F ニューヨーク（6）
軌道の下部の推力はその後、ワームの重量の約0.001％である0.33 PN、ほぼ等しい。を考慮そのアカウント予想重量、 温度のF G 虫は、28 nnとなり
アセント：同様に、上昇中、ドラッグは増加するが（ 図6c）ダウン指摘されている。
F ニーオルスン =-F のDy + F のTy（7）
ワームによって実装推力は今でも大きいことと、抵抗力と重量の合計に等しくなければならない。このワームは、最大泳ぎ始めた後に減速している。ワームが降りと同じ速度で泳ぐことを、このワームは、少なくとも2倍の重さの上向きの推力を発揮しなければならない。
ホバリング
約3秒間の降下を遅くするワームの例が図7に示されている。 第3次多項式は、全体のパスのための合理的なフィット感です。このフィットからの加速度と速度の誤差は15％未満である。ワームは、重要なupwaで始まるRDの推力は、遅くなり、68秒で好転し始め;しかし、上向きの加速度が連続的に減少した（ 図8） NET加速するまで68.5秒を中心にゼロに等しい。これは、最終的には、速度の別の零点に続く下方向の正味の加速につながる（ 図9） 線虫は、69秒で再び下降し始める。
なお、この場合の最大の観察された垂直加速度が2.7ミリメートル/秒2であることは興味深い。転換点での加速度は0.455ミリメートル/秒2とある-それぞれ100mm /秒2 0.455;向きを変えてまで泳ぐ線虫の場合よりも約4倍大きい。式を使用した。図6には、上方への推力が第転機において約1.32 pNであると推定できる。上向きの推力は1.32 pNであるように、第2の転換点に、正味の加速度が負である。
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図1。実験装置。レーザービームエキスパンダ、レンズとスクリーンに実験に不可欠である。ステアリングミラーおよびピンホールが省略されてもよいが、光学的位置合わせはあまり安定します。
図2。単一波長影像（SWSI）。543 nmのレーザー光の2 mWのワームの影を使用して、スクリーンに投影される。線虫が上向きに落ちるように見えるように画像を反転します。
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図3。シングル野生型Cの垂直降下水柱内の虫はこの線虫は、633 nmのコヒーレント光の影にした。線形近似の傾きが0.01ミリメートル/秒±1.09ミリメートル/秒の下方への速度を示します。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図4。単一の上向きの水泳野生型Cの変位グラフ虫 。二つのスプラインフィットは、線虫の全体的なパスをトレースします。フィットの二次導関数は、加速を明らかにしている。 0.110ミリメートル：最大加速度を簡単に最初のフィットから決定され /秒2±0.002ミリメートル/秒2。データポイントとフィットが表示されたままになるようにわずか数エラーバーが表示されます。この線虫は、633 nmのコヒーレント光の影にした。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図5。シングル野生型での加速グラフ虫 。この線虫は、スローダウンして、上方に移動させる0.110ミリメートル/秒2±0.002ミリメートル/秒2の一定の上向きの加速度を維持します。まもなくターンアラウンド·ポイントの後に加速度が徐々に減少し、正味加速度がゼロに減少する。 G "ターゲット=" _blank ">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
これらの力の影響は互いに打ち消し合うように、 点と上昇。浮力と重力旋回下降するための図6フォース図は、大きさおよび方向の反対で等しい。したがって、これらは、これらの図に示されていない。（A）ワームは上向きドラッグ＆推力で下降している。（B）ワームは、ドラッグすることなく弾道の低い点にある。推力は上を向いている。（C）ワームは推力が上を向いている、一方、ドラッグが下を向いて昇順です。
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図7。シングルホバリング虫の変位グラフ。ワームは遅くなり、約68秒で好転し始めたが周りに69秒降順が開始されます。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図8つのホバリング虫の加速グラフこのワームは、2.7ミリメートル/秒2の上向きの加速度で始まるゼロに減少し、最終的に下方への加速がある- 。2.6ミリメートル/秒2を 大きくVERSを表示するには、こちらをクリックしてください。この図のイオン。
図9。シングルホバリング虫の速度グラフ。このワームは、68秒で停止すると上方向に向かうことに始まり、遅くなり、下降が続く69秒で垂直方向にゼロ速度に到達した。 見るにはこちらをクリックしてくださいこの図の拡大版。
表1。N2 での平均下降速度虫 。ライブ50および50死んだ線虫はtRているその降下中に肯定応答。下り坂の平均速度は、生死のワームでも同じです。0.1ミリメートル/秒±1.5ミリメートル/秒。
Discussion
SWSI技術は、自由生活性線虫のような微細な生物の運動器官の機能を理解するための追加手段を提供します。この技術を用いて、我々は、重力が死んで線虫で動作するアクティブな運動（水泳）および受動ドリフトを区別しています。自由遊泳の線虫が水中で移動中に方向を変える時に加えて、我々は線虫を操作して線虫によって発揮され、抵抗力と角度力を測定することができます。
線虫は土壌内の異なる環境条件が発生した。水土の中のポケットだけでなく、固体粒子と異なる形状やテクスチャの生物学的材料があります。また、線虫は、彼らが14に対応する重力環境内に存在します。また、土壌表面付近のセンチュウは、異なる光の波長、温度や湿度の変化、ならびに生物学的に露出している細菌、捕食真菌および他の土壌生物のような変数。線虫は、ナビゲーションの戦略を回して変更すること、様々なメディアで泳ぐとクロール、これらすべての異なる変数に応答する必要があります。これらの複雑な計算は全て、唯一の302ニューロン、運動に関与しているのサブセット、および95体壁筋細胞によって行われる。 SWSI技術によって記述さ種類の測定は、線虫は、このナビゲーションの複雑性を達成する方法に重要な洞察を提供しています。
最初の部分のために、我々は野生型C.全体の下降速度を測定した633 nmの光の中で虫 。これらの測定値を使用して、我々はドラグ力をウォーム遭遇を推定することができる。
加速線虫のケーススタディでは、力は速度の抵抗力が変化するため、継続的な変化を伴った。我々はこのワームに作用する力について作ることができるいくつかの文があります。ワームは遅くなるとSWしようとするそれは虫の軌道の低点でゼロに達するまで上方へイムドラグ力の垂直成分は減少する。この時点で、このワームは、最大泳ぐ上向きの力を持っている必要があります。
この方法は、いくつかの方法で修飾することができる。透明な液体に移動し、任意の微細な種がSWSIを使用して追跡することができます。研究は、デジタルカメラにアクセス可能である任意の波長を用いて行うことができる。デジタルカメラは、通常、紫外線から近赤外線までの波長をピックアップします。また、水平方向の研究は、鉛直上方にレーザを向けることによって行うことができる。種は、次に、顕微鏡スライドのように、水平な透明な表面上に配置することができる。ビームエキスパンダーの後にビームエキスパンダや拡大レンズを調整すると、ぼやけた画像をシャープにすることができます。ユーザーは、一貫性があり、簡単なビームアライメントを確実にするために、テーブルにすべてのコンポーネントを固定してくださいする必要があります。
この方法は、利用可能なレーザwavelengtによって制限されるHSおよび解像度。セットアップが簡単であるため、本質的には方向や波長の柔軟性されている既存の顕微鏡に比べてこの方法の利点は、、も弱点があります。レーザーの素朴な光学系とスペックルの分解能を制限する。これらの欠点のいくつかは、確かに、空間フィルタを含む、CCDカメラ上に直接画像を投影することにより、将来的に向上させることができる。
実験が初めて実行されるように、プロトコルの中で最も重要なステップを容易に知ることができる。乱流を作成せずにキュベットで線虫を置くことが重要です。また、振動がセットアップを妨害し、ワームの動作を変更することがあります。画像をシャドウするために使用されている電力を制限するようにしてください。直径1mmのレーザビームのための2mWでは、加熱効果を回避するために最大であるべきである。セットアップは、蒸留水以外の液体を使用する際に散乱効果のためにテストする必要があります。
現在、ほとんどの男icroscopesは波長範囲でまだ非常に広範である白色光またはカラーフィルタを使用して水平面上で動作する。真の単一波長を使用すると視聴シナリオにおける柔軟性を有する顕微鏡、 すなわち水平配置は、通常、1つの利点又は他のこれらに限定されている。また、顕微鏡のこれらのタイプは通常、非常に高価で、まだ我々の手法とは異なり、焦点面に限定されている。私たちのセットアップは簡単、非常に低予算で構築できます。この方法は、学校、環境の企業だけでなく、少しの資金で動作する他のエンティティによって使用される準備ができている。将来的には、この方法は、微細な種の運動とmechanosensation上でリアルタイムの効果を研究することは非常に洗練されたセットアップに使用することができる。この方法では、角度や容易に入手、視聴の深さの広い範囲で単一波長の研究を行います。
Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
私たちは、ヴァッサー大学学部研究夏期研究所（URSI）、ルーシー·メイナードサーモン研究基金、米航空宇宙局（NASA）賞第NX09AU90A、科学技術の研究の卓越性のための国立科学財団センター（NSF-CREST）賞号の支援に感謝しています0630388およびNSF賞番号1058385。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tunable Helium-Neon laser | Research Electro-Optics | 30602 | Four wavelengths can be selected between 543 nm and 633 nm. |
| 2 Front Surface Aluminum Mirrors | Thorlabs | PF10-03-F01 | |
| High Speed Exilim Camera | Casio | ||
| Quartz Cuvette | Starna Cells | 21/G/5 | |
| LoggerPro (Software) | Vernier | http://www.vernier.com/products/software/lp/ | |
| Mathematica 8 | Wolfram | http://www.wolfram.com/ | |
| 5x-10x variable zoom Galilean beam expander | Thorlabs | BE05-10-A | |
| Plano-convex lens with a positive focal length of 75 mm | Thorlabs | LA1257 |
References
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