Summary
Teknikken presenteres her måler banen fritt svømming mikroskopiske arter ved hjelp av enkelt bølgelengde eksponering. C. elegans brukes til å demonstrere skygge bildebehandling som et billig alternativ til dyre mikroskoper. Denne teknikken kan tilpasses for å imøtekomme ulike orienteringer, miljøer og arter for å måle retning, hastighet, akselerasjon og krefter.
Abstract
Denne studien viser en billig og enkel teknikk som tillater måling av fysikalske egenskaper slik som posisjon, hastighet, akselerasjon og krefter som er involvert i motorisk oppførsel av nematoder suspendert i en kolonne med vann som respons på enkeltbølgelengder av lys. Vi demonstrerer hvordan man skal vurdere bevegelse av en mikroskopisk organisme ved hjelp av enkelt bølgelengde Shadow Imaging (SWSI) ved hjelp av to forskjellige eksempler.
Det første eksempel er en systematisk og statistisk bart studium av den gjennomsnittlige nedstigningen av C. elegans i en kolonne med vann. For denne studien brukte vi levende og døde villtype C. elegans. Når vi sammenlignet hastigheten og retningen på nematode aktiv bevegelse med den passive nedstigningen av døde ormer innenfor gravitasjonsfeltet, denne studien viste ingen forskjell i nedstigningen-tider. Den gjennomsnittlige nedstigningen var 1,5 mm / sek ± 0.1 mm / sek for både levende og døde ormer som bruker 633 nm sammenhengendelys.
Det andre eksemplet er en casestudie av utvalgte individuelle C. elegans endrer retning under nedstigningen i en vertikal vannsøyle. Akselerasjonen og kraft blir analysert i dette eksempel. Denne studien viser omfanget av andre fysiske egenskaper som kan evalueres ved hjelp SWSI stund vurderer atferden ved hjelp av enkle bølgelengder i et miljø som ikke er tilgjengelig med tradisjonelle mikroskoper. Ved hjelp av denne analyse beregnet vi en individuell nematode er i stand til stakk med en styrke i overkant av 28 nN.
Våre funn tyder på at levende nematoder øve 28 nN når du svinger, eller gå mot tyngdefelt. Resultatene antyder videre at nematoder passivt ned i en vannsøyle, men kan aktivt motstå tyngdekraften i første rekke ved å dreie retningen.
Introduction
Caenorhabditis elegans er en frittlevende gunstig jord nematode som er en kraftig modellorganisme for å studere mekanismer for genregulering, utvikling og mer nylig for å forstå sanse biologi og adferd. Til tross for at bare 302 nevroner, C. elegans er i stand til komplekse motorisk mønstre, reproduktive atferd, navigasjon, kjemotaksis og mange andre atferd. C. elegans har mechanoreceptors, chemoreceptors og med oppdage blå bølgelengder av lys (Ward et al., 2008) 1. Mens mye er kjent om den nevrale kretser av sensorimotor funksjon og generelle motorisk mønstre i C. elegans, mindre er kjent om svar på flere, samtidige stimuli eller mer komplekse miljøforhold enn kan modelleres under et mikroskop. Noen få studier har avdekket mer komplekse motorisk mønstre som er svært plast 2,3,4. Vår metodiske tilnærming vil muliggjøre studier av nematodes i løsning i sanntid hvor vi kan lett gi flere miljøforhold samtidig. Dette spørsmålet er vanskelig å løse ved hjelp av konvensjonelle objektbaserte bildeteknikker. Vi har utviklet en avbildningsteknikk som gjør det mulig å plassere nematoder i en vannsøyle for å undersøke motorisk oppførsel, så vel som å bestemme egenskapene til nematoder for å endre bevegelse som respons på forskjellige forhold i omgivelsene.
Enkelt Wavelength Shadow Imaging (SWSI) er presentert i denne artikkelen for første gang å ta opp svakhetene i tradisjonelle mikroskoper. Tradisjonelle mikroskoper er begrenset til å observere arter i en horisontal fokusplan noen få mikrometer i dybden 5,6. Angå enkelt bølgelengde studier, de fleste tradisjonelle mikroskoper bruke fargefiltre for å filtrere hvitt lys svært bredt, vanligvis, 50-100 nm. Ved hjelp av en laser for SWSI smalner bølgelengde utvalget til mindre enn 1 nm og samtidig opprettholde tegnificant lysintensitet 7. Tilsvarende, har enkeltbølgelengder som benyttes ved måling svømme frekvenser av C. elegans i sanntid åtte.
For den første demonstrasjonen av foreliggende fremgangsmåte vi overvåke den horisontale posisjon, x, og den vertikale stilling, y, av en frittsvømmende C. elegans i en vannsøyle, over en avstand på omtrent en centimeter. Spesielt er vi interessert i den vertikale bevegelsen siden tyngdekraften fungerer også vertikalt. Skråningen av en lineær tilpasning til vertikal posisjon gir den vertikale hastighet, v y, av nematode som det går nedover i vannsøylen: 
(1)
Den rotmiddelkvadrat av feilen (RMSE) 9 indikerer kvaliteten på plass og angir om den synkende hastighet er hovedsakelig konstant. De vertikale hastigheter blir deretter gjennomsnitt for EACh arter og døde ormer. Ved hjelp av disse resultatene, dra, som ormer erfaring kan anslås.
For det andre demonstrasjon av vår metode, vi valgte C. elegans som ikke stige med en konstant rate i motsetning til de fleste av ormer observert. De valgte ormer enten snudde og svømte oppover eller svevde en stund før du fortsetter nedstigningen. Fysisk, viser denne undersøkelsen at stakk av et svømmemikroorganisme kan beregnes. Newtons lover tilsier at en kropp som endrer retninger akselererer, noe som innebærer en netto kraft, 
, Er konstituert på at kroppen 10: 
(2)
der 
erden bevegelsesmengde, og t er tid. Akselerasjon av snekken er direkte proporsjonal med den kraft som virker på snekke ettersom massen av snekken forblir konstant. Som et resultat, er den vertikale nettokraft: 
(3)
hvor m er massen av en orm og y representerer den vertikale akselerasjon. Den nettokraft i vertikal retning utgjør da snekkeskyvekraft i samme retning. Den totale skyvekraft kan beregnes ved å ta den horisontale komponent i betraktning.
Protocol
En. C. elegans Forberedelse
- Forbered petri plater av ung voksen C. elegans som beskrevet i foregående forsøk med suspensjonen av C. elegans i en fluidfylt kyvette 11..
- På dagen for den videoanalyse, pick levende unge voksne nematoder direkte i en kyvette fylt med deionisert, destillert vann ved hjelp av en platina pick som beskrevet i trinn 2..
- Forbered døde C. elegans med kloroform eksponering. Fortsett ved å følge prosedyren beskrevet for å plukke levende nematoder beskrevet i trinn to.
2. Optisk Oppsett for videoanalyse
- Monter eksperimentelle oppsett for å lage skyggebilder som vist i Figur 1. Kameraet kan plasseres på valgfri avstand fra skjermen, så lenge det er i stand til å fange en frontal visning av skjermen. Et godt sted er ved siden av kyvetten som vender mot skjermen.
- Ved hjelp av minst to speil for åstyre avstembar Helium-neon laser utgang inn i en ekspander galileisk strålen, slik at strålen blir ekspandert til en diameter på 12 mm.
- Plasser en eller to nålehull i strålebanen, slik at strålen passerer gjennom porer uten å bli hindret. Bruk knappenålshull for å sikre justeringen opprettholdes.
- Rett utvidet stråle på en montert kvartskuvette som er 10 mm bred, 10 mm dype og 4 cm høy.
- Foredle strålen ved hjelp av en plano-konveks linse med en positiv brennvidde på 75 mm.
- Plasser en projeksjonsskjerm ca 120 cm fra linsen. Avstander større enn dette vil gi en større forstørrelse av skyggen bildet. Imidlertid vil kvaliteten av bildet reduseres med en lavere lysintensitet og en økt noticeability av diffraksjon forstyrrelser.
- Plasser en høyhastighetskamera, som er i stand til i det minste 60 bilder per sekund, rett ved siden av kyvetten som vender mot skjermen.
- Plasser en dissekere mikroskop nær den optiske settetopp for hurtig overføring av nematoder i kyvetten.
- Midlertidig feste et transparent linjal med mm-avdelinger til sentrum av kyvetteholderen vinkelrett på den utvidede strålen, slik at strålen prosjekter et forstørret bilde av linjalen inn på skjermen. Still lengden skala for videoanalyse.
- På projektorskjermen, merk skalaen avstand ved hjelp av en gjennomsiktig linjal utenfor sentrum fra det projiserte bildet for å unngå konflikt med anslaget. Klikk her for video.
- Spill dette bildet og måle forstørrelse. Fjern linjalen fra oppsettet. Gjenta dette trinnet for andre bølgelengder som vinkelen på brytning av lys for hver bølgelengde gjennom linsen vil variere på grunn av kromatiske avvik.
- Bytt kyvetten og fylle det til innen en mm av felgen med destillert vann.
- Begynn opptaket mens rommet lyset er på, slik at skalaen avstanden er inkludert i sammeopptakene som det projiserte bildet. Slå av lyset.
- Ved hjelp av en tynn, flat platinatråd plukke, flytte individuelle ung voksen C. elegans en om gangen fra den agarplate i kyvetten ved å berøre hakke opp til overflaten av vannet. Den nematode vil bli synlige i vannmassene når den kommer inn i strålen som følge av spredt lys. klikk her for video.
- Filme de projiserte bilder av ormer som de passerer gjennom den utvidede laserstrålen. Det er viktig å merke seg at det projiserte bildet er invertert, og ormene vil synes å bevege seg i motsatt retning av deres faktiske bevegelse. Ormer som er synkende med tyngdekraften vil synes å bevege seg oppover på skjermen (Figur 2).
Tre. Videodata Forberedelse
- Importer videoen i videoanalyseprogram.
- Sett skala ved hjelp av forstørrelsesfaktor tidligere bestemt.
- Track den lineære forskyvning av hodet på skygge nematode med i det minste 10 datapunkter over hele banen tatt.
- Finn hastigheten i vertikal retning ved å ta derivat ("Y", "Time") og dividere denne verdi med forstørrelsesfaktoren bestemt i trinn 2.2.
4. Data Analysis
- Analyser lineær nedstigningen av en C. elegans:
- Sjekk for å sikre at datapunktene i den vertikale posisjonen i forhold til tiden graf som regel danner en rett linje. Noen avvik kan bli ignorert på grunn av hodebevegelse av nematode. Hvis datapunktene generelt danner en rett linje, fortsetter du til trinn 4.1.2, ellers nedstigningen er ikke-lineær og analysen bør videreføres ved hjelp av trinn 5.1 i denne protokollen.
- Lag en lineær regresjonslinje ved å montere en rett linje 12 til data fra Analyse-menyen. Skråningen av denne linjen er deretter den vertikale hastighet av C.elegans. Skråningen er endringen i posisjonen dividert med endringen i tid over et bestemt intervall. Bestem synkende hastighet av de levende og døde ormer på denne måte (figur 3).
- Gjennomsnittlig de vertikale svømme hastigheter fra nematoder. En prøvestørrelse på omtrent 50 ormer er tilstrekkelig. Sammenligne svømme hastigheter i levende ormer med drift hastigheter i døde ormer.
5. Analyser-lineær bevegelse av C. elegans
- Fra § 3, velge en analysert videofil, som viser en ikke-lineær avstamning innenfor vannsøylen (figur 4). En ikke-lineær avstamning kan identifiseres ved hjelp av trinn 4.1.1 i denne protokollen.
- Velg 'Curve Fit' fra 'analyse' menyen i videoanalyse programvare. Velg en annen rekkefølge (kvadratisk) polynom. Monter kurven.
- For en region av interesse, kan du justere passform på grafen ved å skyve brakettene på hver side of passformen på grafen inntil kurven er svært nær datapunktene innenfor passform og / eller godt innenfor feilfeltene. Beslaget programmet gir et matematisk uttrykk for det monterte kurve, som er loddrett stilling i forhold til tiden. Vurdere montert kurve feil gitt av programmet forbundet med de fysiske egenskapene. En relativ feil på 15% eller mindre er vanligvis akseptabelt.
- Legg mer kurve passer til å dekke flere deler av data. Spline 13 funksjonene for optimal dekning: sørge for at kurven passer overlapping og prøve å justere tilstøtende kurver slik at bakkene kamp i de overlappende regioner.
- Skaff hastigheten for et område av interesse ved å ta den deriverte av kurven montert ved hjelp av det matematiske uttrykk oppnådd i trinn 5.1.3. Hastigheter kan variere i tid. Legg merke til at den deriverte er stigningstallet til en funksjon. Derivatet kan oppnås matematisk eller grafisk. I dette tilfellet er det hensiktsmessig å benytte den gitte matematiske uttression.
- Ta andre deriverte av de monterte kurver å oppnå akselerasjon. Akselerasjonen kan variere i tid.
- Multipliser akselerasjon av ormen masse til å beregne thrust, som ormen utøver. En rimelig estimert masse er 3 mg forutsatt at ormen består hovedsakelig av vann.
Representative Results
Steady Descent
Den første undersøkelse viser ikke skjelnes forskjell i de synkende priser av C. elegans under SWSI bruker 633 nm. De stigende prisene ble funnet å være konstant på 1,5 mm / sek ± 0.1 mm / sek for både live og døde C. elegans. Et utvalg på 50 ormer generert en rimelig variansen 7% for både levende og døde ormer. Det er ingen akselerasjon som virker på ormene siden synkende hastighet er konstant, slik at trekkraften er lik tyngdekraften minus oppdriftskraft. Dette innebærer at tettheten av snekken er litt større enn den til vann; Imidlertid, for beregningene nedenfor er det likevel hensiktsmessig å anta at tettheten av en nematode er omtrent den for vann.
Endre rekkefølge
Den andre undersøkelsen, en case-studie, viser at nematoder er i stand til å endre retning og kan svømme oppover mottyngdekraften. To kurver ble montert til den vertikale forskyvning av nematode, slik at de andre derivater av disse kurver kan være kile for å frem akselerasjon som funksjon av tiden (fig. 5). Det er tilrådelig å holde polynomet for så lavt som mulig og samtidig opprettholde en god passform. En lavere orden polynomial viser mindre variasjon i akselerasjon over tid. De høyere ordens polynomiske betingelser vil være ubetydelig, og derfor unødvendig, dersom rekkefølgen av polynomet for høyt. Denne ormen bremser med en konstant rate på 0,110 mm / sek 2 ± 0,002 mm / sek 2, snur seg og akselererer i takt 0.110 mm / sek 2 ± 0,002 mm / sek 2 inntil kort tid etter behandlingstid punktet. The C. elegans fortsetter å bevege seg oppover med en avtagende akselerasjon av 1,252 til 0,00708 t i mm / sek 2 inntil akselerasjonen faller til null. Med tanke på at Eq. 3, og en estimert orm massen av 3 & #956 g, gjennomgår ormen en vertikal nettokraft, F Ny, 0,33 pN inntil kort tid etter at omslaget punktet.
Descent: Det finnes tre typer av krefter som virker på ormen før ormen når snuoperasjonen punkt: tyngdekraften, dra, oppdrift og thrust (Figur 6a). Den nettokraft lik vektorsummen av alle de tre styrker. Her vi vurdere bare de vertikale komponenter:
F Ny = F Dy + F Ty-F g + F B (4)
hvor F B er oppdriftskraften. F g er lik i størrelse, men motsatte i retning i forhold til oppdriftskraften forutsatt at tettheten av den orm er at vann. Eq. 4 kan da skrives på følgende måte:
F Ny = F Dy + F Ty (5)
F Ny forblir konstant under nedstigningen. Dette innebærer atF Dy + F Ty forblir konstant inntil nematode når behandlingstid punktet. F Dy er størst ved toppen, som er begynnelsen av banen, og reduseres gradvis til null inntil hastigheten er null ved behandlingstid punkt mens F Ty må øke for å holde F Ny konstant.
Behandlingstid: Det er ikke noe drag kraft i vertikal retning på omslaget punkt siden den vertikale hastighet er lik null på det tidspunktet. De eneste krefter som virker i vertikal retning er tyngdekraften, - F g, oppdrift, F B og den vertikale ormen skyvekraft, F Ty, som vist i figur 6b. På dette tidspunkt, er vekten av C. elegans kan bestemmes:
F Ty = F Ny (6)
Den skyvekraft på undersiden av banen er da omtrent lik 0,33 pN, som er omtrent 0,001% av snekken vekt. Hensynrede for at den beregnede vekt, F g av en C. elegans er 28 NN,
Ascent: Tilsvarende under oppstigningen, drag øker, men peker ned (Figur 6c):
F Ny =-F Dy + F Ty (7)
Den skyvekraft implementert av spiralen, må nå være enda større, og er lik summen av trekkraften og vekten. Ormen er bremse ned etter begynner å svømme opp. Å svømme opp i samme takt som ormen ned, vil ormen må øve en oppadgående stakk av minst to ganger sin vekt.
Hovering
Et eksempel på en mark som bremser dens nedstigning i omtrent 3 sekunder er presentert i Figur 7. En 3. grads polynom er en rimelig form for helhets banen. Feilene i akselerasjon og hastighet fra denne form er mindre enn 15%. Ormen starter med en betydelig upward thrust, bremser ned og begynner å snu rundt på 68 sek; imidlertid den oppad akselerasjonen avtar kontinuerlig (fig. 8) inntil netto akselerasjon er lik null rundt 68,5 sek. Dette fører til slutt til en netto akselerasjon i nedadgående retning etterfulgt av et annet nullpunkt i hastighet (fig. 9) og nematode begynner å stige igjen på 69 sek.
Det er interessant at den maksimale observerte vertikale akselerasjon i dette tilfellet er 2,7 mm / sek 2. Akselerasjonen ved vendepunktene er 0.455 mm / sek 2 og - 0,455 mm / sek 2 henholdsvis; omtrent fire ganger så stor som i tilfellet med nematode som svinger rundt og svømmer opp. Bruke Eq. 6, kan det anslås at den oppadrettede skyvekraft er omtrent 1,32 pN ved den første vendepunkt. Ved det andre vendepunkt, er den netto negative akselerasjon, slik at den oppadrettede skyvekraft er 1,32 pN.
o: keep-together.within-page = "always"> 
Figur 1. Eksperimentell oppsett. Laseren, bjelke ekspander, linsen og skjermen er avgjørende for den eksperimentelle oppsettet. Styre speil og nålehull kan utelates, men vil gjøre den optiske innretting mindre stabil.
Figur 2. Enkelt bølgelengde Shadow Image (SWSI). Bruke 2 mW av 543 nm laserlys skyggen av en orm er projisert på en skjerm. Bildet er invertert slik at nematode synes å falle oppover.
424/51424fig3highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51424/51424fig3.jpg "/>
Fig. 3. Vertikal senkning av en enkelt villtype C. elegans i en vannsøyle. Denne nematode ble fulgt ved 633 nm koherent lys. Helningen på lineær tilpasning indikerer en nedadgående hastighet på 1,09 mm / sek ± 0,01 mm / sek. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 Displacement graf av en enkelt oppover svømming villtype C.. elegans. To kile passer spore den generelle sti av nematode. Den andre deriverte av fit viser akselerasjonen. Den maksimale akselerasjon blir lett bestemmes fra den første form: 0,110 mm / Sek 2 ± 0,002 mm / sek 2. Bare noen få feilfelt blir vist slik at de datapunkter og passform forblir synlig. Dette nematode ble skygget av 633 nm koherent lys. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Akselerasjon diagram av en enkelt villtype C. elegans. Denne nematode opprettholder en konstant oppadgående akselerasjon av 0.110 mm / sek 2 ± 0,002 mm / sek 2 forårsaker den til å bremse ned og deretter bevege seg oppover. Kort tid etter snuoperasjonen punkt akselerasjonen avtar jevnt og netto akselerasjon minker til null. g "target =" _blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. Force diagrammer for nedstigningen, vendepunkt og oppstigningen. Oppdrift og tyngdekraften er lik i størrelse og motsatt i retning slik at effekten av disse styrkene avbryte hverandre. De er derfor ikke vist i disse diagrammene. (A) Ormen er synkende med drag og thrust peker opp. (B) Ormen er på lavmål av banen uten drag. Thrust peker opp. (C) Ormen er stigende med dra peker nedover mens thrust peker opp.
"Src =" / files/ftp_upload/51424/51424fig7.jpg "/>
Figur 7. Displacement graf av enkelt svevende nematode. Ormen bremser ned og begynner å snu på ca 68 sek, men begynner synkende rundt 69 sek. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
.. Figur 8 Akselerasjon graf av en enkelt svevende nematode begynner Denne ormen med en oppadgående akselerasjon på 2,7 mm / sek 2, reduseres til null og til slutt har en nedadgående akselerasjon av -. 2,6 mm / sek 2 Vennligst klikk her for å se en større version av denne figuren.
Figur 9. Velocity graf av en enkelt svevende nematode. Denne ormen kommer til en stopp på 68 sek og begynner å dra oppover, bremser ned og går i null hastighet i vertikal retning på 69 sek etterfulgt av en nedstigning. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tabell 1. Gjennomsnittlig nedstigningen hastigheter på N2 C. elegans. 50 levende og 50 døde nematoder er tracked under nedstigningen. Den gjennomsnittlige hastigheten for de utforkjøringer er den samme for den levende og de døde ormer: 1,5 mm / sek ± 0.1 mm / sek.
Discussion
Den SWSI teknikken gir en ekstra måte å forstå motorisk evner av mikroskopiske organismer som frittlevende nematoder. Med denne teknikken har vi skilt mellom aktive locomotion (svømming) og passiv drift på grunn av tyngdekraften som opererer på døde nematoder. I tillegg, når frittsvømmende nematoder endre retning under bevegelse i vann, er vi i stand til å måle de motvirkende krefter og vinkelkrefter, som virker på nematoder, og som utøves av nematoder.
Nematoder møter ulike miljøforhold innenfor jord. Det er vann-lommer i jord, samt faste partikler og biologisk materiale av forskjellige former og teksturer. I tillegg, nematoder eksisterer innenfor et gravitasjons miljø som de svarer til 14. Videre er nematoder nær overflaten av jorden utsettes for forskjellige bølgelengder av lys, forandringer i temperatur og fuktighet, så vel som biologiskevariabler som bakterier, rov sopp og andre jordorganismer. Nematoder må svare på alle disse ulike variabler, svømming og gjennomgangen i ulike medier, snu og endre navigasjons strategier. Alle disse komplekse beregninger utføres av bare 302 neuroner, et undersett av disse er involvert i bevegelse, og 95 kroppsveggen muskelceller. Målinger av den typen beskrevet av SWSI teknikk gir viktig innsikt i hvordan nematoder oppnå dette navigasjons kompleksitet.
For den første del, har vi målt generelle synkende hastighet på villtype C. elegans i 633 nm lys. Ved hjelp av disse målingene, kan vi anslå drag kraft en orm møter.
For casestudie av en akselererende nematode, krefter involvert endring kontinuerlig siden de drag force endringer med fart. Det er noen utsagn som vi er i stand til å gjøre om de kreftene som virker på ormen. Som ormen bremser ned og prøver å swim oppover den vertikale komponenten av trekkraften avtar inntil den når null ved lave punkt av nematode bane. På dette tidspunkt må ormen har en oppadrettet kraft til å svømme opp.
Denne fremgangsmåte kan modifiseres på flere måter. Eventuelle mikroskopiske arter som navigerer i en klar væske kan spores ved hjelp SWSI. Studier kan gjennomføres med alle bølgelengder som er tilgjengelig for digitale kameraer. Digitale kameraer vil vanligvis plukke opp bølgelengder fra UV til nær IR. Dessuten kan horisontale studier gjennomføres ved å dirigere lasers vertikalt oppover. Arten kan deretter bli plassert på en horisontal gjennomsiktig underlag, som et objektglass. Justering av strålen ekspander eller forstørrelseslinse etter bjelken ekspander kan skjerpe uskarpe bilder. Brukeren skal være sikker på å feste alle komponentene til bordet for å sikre konsekvent og enkel strålejustering.
Fremgangsmåten er begrenset av tilgjengelig laser wavelengths og oppløsning. I hovedsak fordelene med denne metoden fremfor eksisterende mikroskoper, som er fleksibilitet i retninger og bølgelengder, er også svakheter siden oppsettet er enkelt. Usofistikert optikk og flekker av laseren begrense oppløsningen. Noen av disse ulempene kan sikkert bli bedre i fremtiden ved å inkludere romlig filter og projisere bildet direkte på en CCD-kamera.
De mest kritiske trinnene i protokollen kan lett lært som forsøket utføres for første gang. Plassering av nematode i kyvetten uten å skape turbulens er kritisk. Også, kan vibrasjoner forstyrre oppsettet og endre oppførselen av ormer. Vær sikker på å begrense strømmen, som blir brukt til å skyggebilde. 2 mW for en laserstråle som er 1 mm i diameter bør være maksimal for å unngå varme-effekt. Oppsettet bør testes for spredning effekter ved bruk av andre enn destillert vann væsker.
Foreløpig mest microscopes operere på en horisontalplanet ved hjelp av hvitt lys eller fargefiltre, som fortsatt er svært bred i bølgelengdeområdet. Mikroskop som virkelig bruker enkelt bølgelengder og har fleksibilitet i visnings scenario, dvs. horisontal plassering, er vanligvis begrenset til en fordel eller den andre. Også disse typer mikroskoper er vanligvis svært dyrt og fortsatt begrenset til fokusplan i motsetning til vår metode. Vårt oppsett kan lett bli bygget med et ekstremt lavt budsjett. Denne metoden er klar til å bli brukt av skoler, miljø selskaper så vel som andre enheter som opererer med liten midler. I fremtiden kan denne metoden brukes i en svært sofistikert oppsett for å studere sanntidseffekter på locomotion og mechanosensation av mikroskopiske arter. Denne metoden gjør enkelt bølgelengde studier ved et bredt spekter av vinkler og betraktningsdybde lett tilgjengelige.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi er takknemlige for støtte fra Vassar College Graduate Research Summer Institute (Ursi), Lucy Maynard Laks forskningsfond, NASA award No NX09AU90A, National Science Foundation Center for Forskning Excellence in Science and Technology (NSF-CREST) award Nei 0630388 og NSF award nr. 1058385.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tunable Helium-Neon laser | Research Electro-Optics | 30602 | Four wavelengths can be selected between 543 nm and 633 nm. |
| 2 Front Surface Aluminum Mirrors | Thorlabs | PF10-03-F01 | |
| High Speed Exilim Camera | Casio | ||
| Quartz Cuvette | Starna Cells | 21/G/5 | |
| LoggerPro (Software) | Vernier | http://www.vernier.com/products/software/lp/ | |
| Mathematica 8 | Wolfram | http://www.wolfram.com/ | |
| 5x-10x variable zoom Galilean beam expander | Thorlabs | BE05-10-A | |
| Plano-convex lens with a positive focal length of 75 mm | Thorlabs | LA1257 |
References
- Ward, A., Lie, J., Feng, Z., Xu, Z. S. Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans. Nature Neurosci. 11, 916-922 (2008).
- Pierce-Shimomura, J. T., Chen, B. L., Mun, J. J., Ho, R., Sarkis, R., McIntire, S. L. Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , 105-20987 (2008).
- Vidal-Gadea, A. G., Davis, S., Becker, L., Pierce-Shimomura, J. T. Coordination of behavioral hierarchies during environmental transitions in Caenorhabditis elegans. Worm. 1, 5-11 (2012).
- Berri, S., Boyle, J. H., Tassieri, M., Hope, I. A., Cohen, N. Forward locomotion of the nematode C. elegans is achieved through modulation of a single gait. HFSP Journal. 3, 186-193 (2009).
- Pawley, J. B. Objective Lenses for Confocal Microscopy. Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 3rd Edition, Springer. New York. (2006).
- Conrad, J. Depth of Field in Depth. Large Format Page Retrieved. , Available from: http://www.largeformatphotography.info/articles/DoFinDepth.pdf (2011).
- Demtröder, W. Laser Spectroscopy Basic Concepts and Instrumentation. , Springer 3rd Ed. New York. (2003).
- Magnes, J., Raley-Susman, K., Melikechi, N., Sampson, A., Eells, R., Bello, A., Lueckheide, M. Analysis of Freely Swimming C. elegans Using Laser Diffraction. Open J. Biophys. 2 (3), 101-107 (2012).
- Mood, A., Graybill, F., Boes, D. Introduction to the Theory of Statistics. , 3rd edition, McGraw-Hill. (1974).
- Taylor, J. R. Classical Mechanics. , University Science Books. (2005).
- Magnes, J., Susman, K., Eells, R. Quantitative Locomotion Study of Freely Swimming Micro-organisms Using Laser Diffraction. J. Vis. Exp. (68), (2012).
- Bevington, P. R. Data Reduction and Error Analysis for the Physical Sciences. , McGraw-Hill Book Company. New York. (1969).
- Lyche, T., Schumaker, L. L. Local spline approximation methods. Journal of Approximation Theory. 15 (4), 294-325 (1975).
- Kim, N., Dempsey, C. M., Kuan, C. -J., Zoval, J. V., O'Rourke, E., Ruvkun, G., Madou, M. J., Sze, J. Y. Gravity Force Transduced by the MEC-4/MEC-10 DEG/ENaC Channel Modulates DAF-16/FoxO Activity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 177, 835-845 (2007).
