Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Rekonstituering av β-catenin degradering i Published: June 17, 2014 doi: 10.3791/51425
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1,3
1Department of Cell and Developmental Biology and Program in Developmental Biology, Vanderbilt University Medical Center, 2Division of Gastroenterology, Hepatology & Nutrition and Division of Developmental Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 3Vanderbilt Ingram Cancer Center, Vanderbilt University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

En fremgangsmåte er beskrevet for å analysere proteinnedbrytning ved hjelp av radioaktivt merket og luciferase-fusjonsproteiner i Xenopus egg ekstrakt og dens tilpasning for high-throughput screening for lite molekyl modulatorer av proteinnedbrytning.

Abstract

Xenopus laevis egg ekstrakt er et godt karakterisert, robust system for å studere biokjemi av diverse cellulære prosesser. Xenopus egg ekstrakt er blitt brukt til å studere protein omsetning i mange cellulære sammenhenger, inkludert cellesyklus-og signaloverføringsbaner 1-3. Heri er en fremgangsmåte beskrevet for å isolere Xenopus egg ekstrakt som har blitt optimalisert for å fremme nedbrytning av den kritiske Wnt veien komponent, β-catenin. To forskjellige metoder er beskrevet for å vurdere β-catenin proteindegradering i Xenopus egg ekstrakt. En metode er visuelt rikt ([35 S]-radioaktivt merkede proteiner), mens den andre er lettere skalert for high-throughput-analyser (ildflueluciferase-merkede fusjonsproteiner). De teknikker som er beskrevet kan brukes til, men er ikke begrenset til, vurdere β-catenin protein turn og identifisere molekylære komponenter som bidrar til omsetningen. I tillegg er ABILligheten for å rense store mengder homogen Xenopus egg ekstrakt kombinert med kvantitative og lettvinte avlesning av luciferase-merket proteiner gjør at dette systemet skal være lett tilpasses for high-throughput screening for modulatorer av β-catenin degradering.

Introduction

Xenopus laevis egg ekstrakt har vært brukt mye til å studere mange cellebiologiske prosesser, inkludert cytoskeletal dynamikk, kjernefysisk sammenstilling og import, apoptose, ubiquitin metabolisme, cellesyklus progresjon, signaltransduksjon, og protein omsetning 1-17. Den Xenopus egg ekstrakt system er mottagelig for den biokjemiske analysen av en hærskare av cellulære prosesser fordi egg ekstrakt representerer i hovedsak ufortynnet cytoplasma som inneholder alle de essensielle cytoplasmatiske komponentene som er nødvendige for å utføre disse prosessene og gjøre det mulig etterforskning. Store mengder egg ekstrakt kan fremstilles på en gang for biokjemiske manipulasjoner som krever store mengder av materiale (f.eks, proteinrensing eller high-throughput screening) 18-20. En annen fordel er at konsentrasjonen av spesifikke proteiner i Xenopus egg ekstrakt som kan nøyaktig innstilles ved tilsetning av rekombinant protein og / eller immunodepletion av endoggent proteiner i motsetning til transfeksjon av plasmid-DNA, hvor ekspresjon av proteinet av interesse er vanskelig å kontrollere. I tillegg, kan mangelen på tilgjengelige rekombinante proteiner kan overvinnes ved tilsetning av transkripter som koder for proteinet av interesse ved å utnytte den nylagede Xenopus egg ekstrakt med høy kapasitet for å oversette eksogent tilsatt mRNA.

Reguleringen av protein degradering er kritisk for kontroll av mange cellulære stier og behandler 21. Xenopus egg ekstrakt har vært brukt mye for å studere protein degradering som systemet gir mulighet for flere måter å overvåke protein omsetning uten konfunderende påvirkninger av transkripsjon og oversettelse. Wnt signalveien er en høyt konservert signalveien som spiller avgjørende roller i utvikling og sykdom. Omsetningen av β-catenin, den viktigste effektor av Wnt veien, er sterkt regulert, og en økt steady-state lEvel av β-catenin er kritisk for aktivering av Wnt målgener. Betydningen av β-catenin degradering er markert med det faktum at mutasjoner i Wnt veien som hemmer β-catenin nedbrytning funnet i ~ 90% av alle sporadiske tilfeller av tykk-og endetarmskreft 22. β-catenin nedbrytning av komponenter i Wnt veien kan trofast rekapitulert i Xenopus egg ekstrakt for å studere mekanismen for omsetningen, så vel som for å identifisere nye små molekyl modulatorer av dens nedbrytning 2, 19, 20, 23-29.

Fremgangsmåter for fremstilling av Xenopus egg ekstrakt for å studere cellesyklus er blitt beskrevet i tidligere publikasjoner JOVE 30-32. Den aktuelle protokoll beskriver en modifikasjon av disse fremgangsmåter, og er optimalisert for degradering av [35 S]-radioaktivt merket β-catenin, og luciferase-merket β-catenin iXenopus egg ekstrakt. Den radiomerket degradering analysen gir mulighet for direkte visualisering av proteinnivåer via autoradiografi. [35 S] metionin er innlemmet i proteinet av interesse ved å bruke en in vitro oversettelses reaksjon som kan så bli direkte tilsatt til en nedbrytningsreaksjon. I tillegg vil det radio-merkede protein turn assay krever ikke et antistoff mot proteinet av interesse, eller en epitop tag, som kan påvirke proteinstabilitet. Fordi selv små endringer i proteinnivåer, noe som reflekteres i forandringer i intensiteten av det radioaktivt merkede proteinbånd, fremstilles lett visualisert ved autoradiografi, at [35 S]-radioaktivt merket nedbrytning assay representerer en meget nyttig metode for visualisering av protein turn 2.

Fusjon av β-catenin til ildflue luciferase (heretter referert til som bare "luciferase") gjør det mulig for nøyaktige og lettvinte kvantitative målinger av proteinnivåer, forfor å bestemme de kinetiske egenskaper av β-catenin omsetning 19, 20.. En stor fordel av luciferase-analysen er at den gir en sterk kvantitativ system som er lett skaleres opp. Den følgende protokollen gir enkle metoder for å analysere β-catenin nedbrytning, og en robust, effektiv og effektiv metode for high-throughput screening av nye β-catenin modulatorer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

En. Utarbeidelse av Xenopus Egg Extract

MERK: Hver frosk gir ca 1 ml av brukbare egg ekstrakt. Utdrag fra 10 frosker er vanligvis forberedt på en gang, og volumet av buffer beskrevet nedenfor er for å utføre en 10 frosk Xenopus egg ekstrakt prep. Buffervolumet kan bli justert tilsvarende for større eller mindre produkter av egg ekstrakt. Forbereder generert på denne måten konsekvent gi proteinkonsentrasjoner ≥ 50 mg / ml. Fremgangsmåte for innsamling av egg og behandle dem i ekstrakt er mest effektive når det utføres av to personer. (For grunnleggende frosk dyrehold teknikker, se Sive et al. 33).

  1. Egg Collection
    1. Å prime froskene, injisere hver kvinnelig frosk med 100 E gravid Mare Serum gonadotropin (PMSG) fra en rykende fersk 250 U / ml lager. Bruk en 3 ml tuberkulin sprøyte med en 27 G nål til å injisere subkutant, med skråkant avnålen opp, inn i den dorsale lymfe sac, som er plassert omtrent 1 cm fra midtlinjen fra den innsnittede misfarging langs lengden av benene på den frosk.
    2. Oppbevar primet frosker i vann (pluss 20 mM NaCl, se Sive et al. 33) ved 18 ° C i 5-10 dager. For stående vann tank systemer, er det dyretetthet ca 4 l vann per kvinnelig frosk. MERK: Den minste tid for grunning skal tre i kraft er fem dager, og effekten av grunning slites av etter 10 dager.
    3. Forbered 0.5x Marc modifiserte Ringers (MMR) løsning fra en 20x MMR lager. 20x MMR består av 2 M natriumklorid, 40 mM kaliumklorid, 40 mM kalsium-klorid, 20 mM magnesium-klorid, og 100 mM 4 - (2-hydroksyetyl)-1-piperazin-etansulfonsyre (HEPES), pH 7,4.
    4. Sett opp bøtter for alle injisert frosker (en frosk per 4 L bøtte). MERK: Selv om mer enn en frosk kan plasseres i samme bøtte for egg samling, hvis en av froskerdanner hovedsakelig dårlig kvalitet egg, vil en betydelig mengde arbeid være nødvendig for å skille de dårlig kvalitet egg fra de som er egnet for fremstilling av ekstrakt. Dermed maksimere antall frosker i samme tank for å minimere mengden av buffer som brukes for egg samle er ikke verdt risikoen.
    5. Injisere 750 U Humant choriongonadotropin (HCG) i rygg lymfe sac av hver frosk med en 27 G nål som beskrevet i 1.1.1.
    6. Plasser hver av HCG-injisert frosker i individuelle 4 L bøtter inneholder 0.5x MMR avkjølt til 16 ° C.
    7. Sett beholderne med frosker i en 16 ° C inkubator for å samle inn egg O / N (15-16 timer). MERK: opprettholde en passende temperatur er avgjørende for hele prosedyren, fra å samle egg til å forberede egg ekstrakt.
  2. Dejellying Eggs
    MERK: Egg er dekket med en gelé pels som må fjernes før du foretar ekstrakt. Sannsynligheten for spontan lysering av eggene øker etter hvert som tiden between egglegging og pakke forberedelse øker. Således er det viktig å gå gjennom følgende trinn så hurtig som mulig.
    1. Forbered 4 L 1x MMR, 50 ml av 0,1 x MMR, og 400 ml av 2% cystein, pH 7,7, laget i destillert vann. Opprettholde alle løsninger ved 16 ° C.
    2. Å utvise ekstra egg, forsiktig klem korsryggen og magen til frosken.
    3. Fjern frosker og mesteparten av MMR, å la eggene i ca 1-200 ml av MMR i hver bøtte.
    4. Fjern skitt med en overføring pipette, og vurdere kvaliteten på eggene: høy kvalitet egg er generelt preget av et klart skille mellom den mørke, pigmentert dyr halvkule og lett farget vegetal halvkule og har den høyeste mørk-til-lys kontrast. Kast med en overføring pipette noen egg som vises trevlet, spraglete, eller lysert (hvit og puffy) som de vil redusere den generelle kvaliteten av ekstraktet. Hvis> 10% av eggene er av dårlig kvalitet, er helebatch skal kastes.
    5. Kombiner egg inn i en 500 ml begerglass og hell ut så mye MMR som mulig mens du holder egg neddykket.
    6. Skyll eggene med forsiktige virvelbevegelser med dobbelt egg volumet av MMR. Gjenta to ganger, og fjerne eventuelle rester eller åpenbart dårlig kvalitet egg.
    7. Tilsett ca 100 ml 2% cystein til begerglass, virvle forsiktig for å blande, og la egg til takke med 5 min ved 16 ° C. Hell av cystein. MERK: Dejellying er preget av gradvis utseende gelé strøk flyter over egg og mer kompakt pakking av eggene som de nå okkuperer et mindre volum uten gelé strøk.
    8. Legg til ytterligere 100 ml 2% cystein, virvle, vent fem minutter, og deretter sakte hell av cystein. Gjenta til egg er blitt tett kompaktert (vanligvis ved den tredje cystein-behandling). Merk: Hvis eggene blir liggende for lenge i cystein, er de utsatt for lyse. Tilsvarende dejellied egg er skjør og utsatt for mekanisk lyse hvis deblir virvlet for kraftig eller hvis de blir utsatt for luft. Når eggene har blitt dejellied, er det viktig å hurtig videre til sentrifugeringstrinn.
    9. Hell av cystein, og skylle bort gelé pels og annet rusk ved forsiktig vask egg i 1x MMR. Hell av buffer forsiktig langs siden av begerglasset. Gjenta to ganger inntil MMR-løsning er ikke lenger skyet. Mens skylle med 1x MMR fortsette å fjerne de dårlige eggene ved hjelp av en overføring pipette.
    10. Utfør en endelig skånsom skylling med 30 ml 0.1x MMR, og forsiktig helle av så mye av bufferen som mulig. Igjen, fjern eventuelle åpenbart dårlige egg.
  3. Pakking og Knusing Eggs ved sentrifugering
    MERK: Ekstraktet beskrevet nedenfor som brukes for β-catenin nedbrytning er en variant av det cytostatisk faktor ekstrakt (metafase II-arrestert). I motsetning til de lave hastigheter og med høy hastighet ekstrakt anvendes for cellesyklus-studier, middels hastighet ekstrakt som fungerer best for β-catenin degradering. Jegnterphase ekstrakt tilsvar fremmer robust β-catenin degradering selv er mer arbeidskrevende å forberede seg.
    1. Legg Leupeptin, pepstatin, Aprotinin blanding (LPA, en proteaseinhibitor) ved 10 ug / ml (fortynnet fra en 10 mg / ml stamløsning i DMSO) og Cytochalasin D på 20 mikrogram / ml (fortynnet fra en 10 mg / ml stamløsning i DMSO) i de resterende 20 ml av 0,1 x MMR.
    2. Legg 0. X MMR inneholder LPA og Cytochalasin D til de vasket egg, virvle forsiktig, og inkuberes i 5 minutter ved 16 ° C.
    3. Overfør eggene i 16 ° C før-kjølt 50 ml sentrifugerør, tillater egg å slå seg, og å fjerne gjenværende buffer fra toppen. For å unngå eksponering til luft, trekke tilbake en liten mengde buffer til overføringspipetten før uttak av egg for overføringen. Fortsett å overføre flere egg inn i sentrifugerør og fjerne gjenværende buffer fra toppen av røret før eggene fylle sentrifugerøret til toppen, noe som vil maksimere utbyttet avpakke.
    4. For å pakke egg, spin-sentrifugerør ved 400 xg i 60 sekunder ved 4 ° C ved hjelp av en rotor med fast vinkel. Fjern gjenværende buffer fra toppen av sentrifugerør.
    5. For den knusende spinn, spinne rør på 15 000 xg i 5 min ved 4 ° C.
  4. Samle Cytoplasmatisk lag av Extract
    MERK: Fremgangsmåten som er beskrevet nedenfor avviker fra det klassiske metode for å stikke hull på siden av sentrifugerøret for å samle den cytoplasmiske sjikt. Denne protokollen har blitt tilpasset for forenkling og for bruk med bestemte sentrifugerør, som er gjenbrukbare. Ingen merkbare forskjeller i kinetikk av β-catenin degradering er funnet med begge metodene. På dette punktet ekstrakt skal holdes kalde under hele prosessen, og alle trinn bør utføres ved 4 ° C.
    1. Tømme et hull i lipid lag med P1000 pipettespissen.
    2. Samle cytoplasmisk sjikt (mellom det mørke pigmenterte sjikt og light lipid lag) ved hjelp av en ny P1000 pipette tips til rene pre-kjølt sentrifugerør (Figur 1). For høy kvalitet ekstrakt som robust degraderer β-catenin, minimere mengden av pigmentert og lipid lag som er trukket med cytoplasmatisk lag.
    3. Spin ekstrahert cytoplasmisk sjikt ved 15.000 xg i 10 min ved 4 ° C og igjen samle cytoplasmisk sjikt. Gjenta spinn og utvinning 1X. MERK: Ekstraktet skal være "stråfarget." Hvis det ikke er vesentlig kontaminering med den pigmenterte og lipid lag på dette tidspunkt, kan man gjenta spin en gang, selv om overdreven spinn vil redusere kapasiteten av ekstraktet for å degradere β-catenin.
    4. Legg LPA og Cytochalasin D til ekstraktet ved sluttkonsentrasjoner på 10 ug / ml hver. MERK: Ved hjelp av metoden som er beskrevet gir en ganske konsekvent total protein-konsentrasjon på omtrent 50 mg / ml (52,41 ± 5,40 mg / ml, n = 3 separate preps) i Xenopus f.eksg ekstrakter.
    5. (Valgfritt) For oversettings analyser, legge avkortet mRNA (0,1 mg / ml), RNAsin (1,5 U / ml), og energigjenvinning blanding (2.2.1) og inkuber reaksjonen på RT for 2 timer (for ytterligere informasjon se Salic et al. 2. og Sive et al. 33). Bruk oversatt utdrag umiddelbart for β-catenin degraderings analyser eller hurtigfrys i flytende nitrogen for senere bruk. MERK: Nylaget ekstrakt har en høy kapasitet til å oversette eksogent lagt mRNA, men dessverre er denne kapasiteten tapt når uttrekket er frosset. Avkortet mRNA kan lett fremstilles ved hjelp av kommersielt tilgjengelige sett.
    6. Snap-fryse ekstrakt i flytende nitrogen. MERK: Ekstrakter lagres i små (200 mL) alikvotene for engangsbruk, fordi de raskt miste sin evne til å degradere β-catenin hvis refrozen. For langtidslagring, kan ekstrakt lagres i flytende nitrogen. For kortvarig lagring, kan ekstraktet oppbevares ved -80 ° C, selv om kapasiteten of ekstrakt å degradere β-catenin kan bli dramatisk redusert med forlenget lagring ved -80 ° C (mer enn 2 måneder).

2. Forbereder Extract for β-catenin Degradation analysen

  1. Nedbryting fra Xenopus Extract
    MERK: En stor fordel med Xenopus ekstrakt er evnen til lett å utarme komponenter av en vei og presist legge tilbake en definert mengde av et protein for å fastslå dets doseavhengige effekter.
    1. Bruk nylaget Xenopus egg ekstrakt eller raskt tine frosne ekstrakt og legg på is. Utføre alle utregningene i kulden.
    2. Legg ekstrakt til 1/10 av volumet av pelleterte antistoff eller affinitet perlene (f.eks, 20 ml pelleterte perler til 200 ml ekstrakt). For å minimalisere fortynning av ekstraktet, trekke seg så mye væske fra kulene som mulig før tilsetning av ekstrakten ved hjelp av gel laste tips med lange, koniske tips.
    3. Roter ekstrakt-vulsten blanding ved 4 ° C i 1 time.
    4. Spin-ekstrakt-perle blanding på 12 600 xg i mikrofuge ved 4 ° C i 30 sek. Alternativt, hvis magnetiske kuler er brukt, anvende magnetisk felt for å samle-perler.
    5. Overføring utarmet ekstrakt til en frisk mikrosentrifugerør på is. Vær forsiktig så du ikke å overføre noen perler med ekstrakt.
    6. Bekreft effektiviteten av uttømming av immunoblotting både utarmet ekstrakt og perler.
    7. Forbered ekstrakt for β-catenin degradering analysen som beskrevet i 2.2.
  2. Optimalisere Xenopus Pakk for β-catenin Degradation
    MERK: β-catenin nedbrytning i Xenopus egg ekstrakt er en energiavhengig prosess som raskt tapper de endogene ATP butikker. Følgelig, blir en energi regenerering system for å opprettholde robust β-catenin degradering.
    1. Forbered en 20x energigjenvinning (ER) blanding bestående av 150 mM kreatinfosfat, 20 mM ATP, 600 mikrogram / ml kreatinfosfokinase,og 20 mM MgCl2. ER skal alikvotert og lagret ved -80 ° C. Unngå gjentatte fryse / tine sykluser ved hjelp av små frosne porsjoner.
    2. Raskt tine Xenopus egg ekstrakt ved å gni den frosne røret mellom hendene. Plasser røret på is like før hele ekstraktet har smeltet.
    3. Tilsett 10 pl av energigjenvinning blanding (20x ER) til en alikvot (200 pl) i Xenopus egg ekstrakt. Bland grundig ved raskt flicking røret og puls virvling. Puls-spinn og umiddelbart plassere på is.
    4. (Valgfritt) Omsetningen av β-catenin kan bli noe forbedret i Xenopus egg ekstrakt ved tilsetting av ubiquitin (1,25 mg / ml final). Cycloheximide (0,1 mg / ml final) kan også være tilsatt for å minske oversettelse av endogene transkripsjoner.
    5. Delmengde de riktige volumer for degradering analysen inn i pre-kjølt mikrofugerør på is. For radiomerket β-catenin degraderings analyser, ta ut 2-5 ml pakke for hvert tidspunkt. </ Li>

Tre. Radiomerket β-catenin degradering analysen i Xenopus egg ekstrakt

MERK: Alle trinn skal utføres på is med mindre annet er angitt.

  1. Forbereder Radiomerket β-catenin
    1. Forbered fersk in vitro-syntetisert [35 S] metionin-radiomerket protein ved hjelp av kommersielt tilgjengelige kits. MERK: Generering av 35 (87 dager halveringstid) S-merkede proteiner er enkelt og effektivt produsert ved hjelp av kommersielt tilgjengelige in vitro-coupled transkripsjon-oversettelse kits. Det er viktig at det translaterte proteinet er tilstrekkelig merket slik at endringer i protein omsetningen lett kan visualiseres.
    2. For å bekrefte vellykket radiomerking, utføre SDS-PAGE/autoradiography med 0,5 mL av den oversatte protein. Tall intensiteten av den radiomerkede β-catenin band ved hjelp av ImageJ, Imagequant, eller en alternativ kvantitativ software program. MERK: Det radiomerkede β-catenin protein bandet skal være godt synlig på film i løpet av få timer (4-6 t).
    3. Snap-fryse radiomerket protein i flytende nitrogen for oppbevaring til bruk. Merk: Langvarig lagring (> 2 måneder) og multippel fryse / tine (større enn 2) kan sterkt påvirke kapasiteten til radiomerket β-catenin å nedbrytes robust i Xenopus egg ekstrakt. Vanligvis stabiliteten av radioaktivt merkede proteiner avtar betraktelig etter 1 måneds lagring ved -80 ° C; dermed gir relativt nylaget radiomerket β-catenin beste resultatene i disse nedbrytnings analyser.
  2. Utføre β-catenin Degradation analysen
    1. Legg 1-3 pl (alt etter styrken av den radioaktivt merkede bånd-signal) av in vitro-translatert β-catenin (og andre proteiner, små molekyler, etc. som blir testet) i 20 pl av Xenopus reaksjonsblandingen på is. Bland grundig ved quickly blar i røret, og en kort puls med virvling; Dette er et viktig skritt som Xenopus egg ekstrakt er veldig tyktflytende, og ufullstendig blanding vil påvirke konsistensen av resultatene. Puls spinn og legg på is.
    2. Start β-catenin nedbrytningsreaksjon ved å forskyve rørene til RT.
    3. På det angitte tidspunkt, fjernes på 1-5 ml av prøven og blandes umiddelbart med SDS-prøvebuffer (5 x volum) for å stoppe reaksjonen. For å sørge for at degradering reaksjon er helt avsluttet, flick tube flere ganger og vortex kraftig.
    4. Utfør SDS-PAGE/autoradiography. Kjør en ml ekvivalenter (~ 50 mg protein) av ekstraktet for hvert tidspunkt / kjørefelt. Nedbrytning av β-catenin i Xenopus egg ekstrakt bør være dokumentert ved tidsavhengig reduksjon i intensiteten av radiomerket β-catenin bandet Figur 2. Kvantifiser resultater ved hjelp ImageJ, Imagequant, eller andre foretrukne bildebehandlingsprogrammer om nødvendig.
    5. (Optional) Sug SDS-polyakrylamidgel i fikseringsoppløsning (10% eddiksyre og 30% metanol i destillert vann) før tørking for å redusere bakgrunnsradioaktiviteten og øke kvaliteten av bildet.

4. Β-catenin-luciferase Degradation analysen i Xenopus Egg Extract

Utføre alle trinnene på is mindre annet er angitt.

  1. Forbereder β-catenin-luciferase
    1. Syntetisere ikke-radioaktiv merking, luciferase-merket β-catenin ved hjelp av transkripsjon-transla kombinert system med fullstendig aminosyre-blanding.
    2. Bekrefte produksjon av luciferase-merket β-catenin ved å måle luciferase-aktivitet 0,5 til 1 pl av reaksjonen. Vurdere bakgrunn luminescence ved å måle luminescens fra en uoversatt reaksjon mix. MERK: Flere kommersielle kits er tilgjengelig for måling av luciferase aktivitet. Langlivede luminescens, derimot, fungerer spesielt godt for nedbrytning assay.
  2. Utføre β-catenin-luciferase Degradation analysen
    1. Tine og forberede Xenopus egg ekstrakt som i 2.2.
    2. Legg in vitro-oversatt β-catenin-luciferase fusjon (fra 4,1) inn forberedt Xenopus reaksjon mix (fra 2,2) på is og bland godt som i 3.2.1. MERK: Aktiviteten av β-catenin luciferase som tilsettes til ekstrakten er typisk mellom 20 - 50 000 relative luminescens heter (RLU) / ml ekstrakt (basert på målinger innhentet fra 4.1.2). Fra signal skal være omtrent 100000 RLU (2-5 ml av den in vitro-translatert β-catenin-luciferase smelting).
    3. Shift ekstraktet til RT for å starte reaksjonen nedbrytning.
    4. Ta en porsjon av reaksjonen ved det angitte tidspunkt og hurtigfrys i flytende nitrogen. MERK: Triplikatprøver blir typisk fjernet for analyse for hvert tidspunkt. Frossen ekstrakt kan lagres ved -80 ° C until de er klare til å bli analysert.
    5. Tine prøvene is, overføringsprøver på standard hvite 96-brønners plater på is, og fremgangsmåte for luciferase-aktivitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En skjematisk β-catenin nedbrytning i Xenopus egg ekstrakt er vist i figur 2A. 35. S-merkede β-catenin ble inkubert i Xenopus egg ekstrakt, ble aliquoter (1 ml ekstrakt ekvivalent) fjernes til riktig tid, og prøver ble underkastet SDS-PAGE etterfulgt av autoradiografi. β-catenin nedbrytning av komponenter i Wnt veien er mediert av ubiquitin-proteasom-systemet 2, og degradering av [35 S]-radioaktivt merket β-catenin i Xenopus ekstrakt inhiberes ved tilsetning av de proteasominhibitor MG132 figur 2B. Nedbrytning av β-catenin av komponentene i Wnt veien er avhengig av dets fosforylering av GSK3P 34.. GSK3 avhengig nedbrytning kan lett demonstrert på flere måter ved hjelp Xenopus egg ekstrakt: 1) Den β-catenin (SA) mutant (GSK3 fosforylering sider mutert til alanines) er stabilisert i Xenopus egg ekstrakt i forhold til villtype-β-catenin protein figur 2B. 2) Lite molekyl inhibitorer av GSK3P (LiCl) likeledes hemme nedbrytning av β-catenin (figur 2C). 3) Til slutt, uttømming av GSK3 fra Xenopus egg ekstrakten inhiberer nedbrytning av β-catenin; degradering kan bli reddet ved tilsetting av eksogene GSK3 Tall 2D-E.

Det radioaktivt merkede β-catenin nedbrytning analysen gir en spesielt informativ visuell vurdering av dens virke nedbrytning (dvs. ubiquitin-formidlet nedbrytning versus apoptotisk spalting). Autoradiografi, er imidlertid arbeidskrevende, og for det meste begrenset for high-throughput-analyse av veien (f.eks screening for lite molekyl modulatorer av Wnt veien). Den β-catenin-luciferase nedbrytning analysen er lettere og raskere kvantifiserbar som mengden av luminescens som slippes ut er direkte proporsjonal med amount av β-catenin-luciferase protein. Denne funksjonen gjør det luciferase assay enkel og lett tilpasses for high-throughput analyser.

Det er viktig å fastslå at luciferase fusjon har lignende egenskaper som det i nonfusion protein. Dette kan bestemmes empirisk ved å fusjonere luciferase protein til N-enden, C-enden eller internt. Fusjon av luciferase til N-eller C-terminus av β-catenin påvirker ikke dens kapasitet til å aktivere Wnt målgener incultured pattedyrceller eller dens omløpshastighet i Xenopus egg ekstrakt 2, 19, 20.

Et representativt β-catenin-luciferase assay nedbrytning i Xenopus egg ekstrakt er vist i figur 3A, der nedbrytning av β-catenin-luciferase ble vurdert ved SDS-PAGE/autoradiography av radiomerket protein, og luciferase-aktivitet av de fusjon. Satsen for degradation av β-catenin-luciferase er lik den ukodede β-catenin protein. Reguleringen av nedbrytning for β-catenin-luciferase blanding er i hovedsak identisk med nonfusion protein som tilsetning av LiCl eller uttømming av GSK3 resulterte i inhibering av β-catenin-luciferase omsetning. Som vist i figur 3B-C, endringer i den radioaktive signal av β-catenin-luciferase protein paralleller endringene i luciferase enzymatisk aktivitet over tid. Et problem som oppstår fra å bruke β-catenin-luciferase (spesielt fusjonsprotein generert fra in vitro transkripsjon-oversettelse system) er bakgrunnen luciferase signal forårsaket av bruk av interne translasjonsforskning startsider eller tidlig translasjonell oppsigelse Figur 3D. Dette problemet kan noen ganger overvinnes ved å optimalisere DNA-konsentrasjon som brukes i IVT reaksjonen. Vi fikk imidlertid ikke observere en nedgang i bakgrunnen luciferase aktivitet når vi varierteplasmid DNA-konsentrasjon for vår bestemt β-catenin-luciferase konstruere. Det er sannsynlig at vi må reengineer fusjonsproteinet via mutagenese for ytterligere å minimalisere indre translasjonelle start-områder og / eller for tidlig avslutning av den translasjons-β-catenin-luciferase-fusjonsprotein. Fordi luciferase protein er ganske stabile over tid løpet av nedbrytningen reaksjon i Xenopus egg ekstrakt figur 3A, men dette bakgrunnssignalet kan ganske enkelt trekkes dersom forholdet mellom den avkortede luciferase protein til den full-lengde β-catenin fusjon er kjent .

En styrken av luciferase-analysen er evnen til å skalere til en multi-brønn format som gjør det mulig å utføre high-throughput screening for modulatorer av β-catenin degradering. I figur 4 er en representativ dambrett-analyse er vist ved hjelp av en inhibitor av β-catenin nedbrytning, MG132, som hemmer proteasom. Resultatet av sjakkbretteksperiment angir at analysen er ensartet og reproduserbar i en 96-brønns-format og viser dens egnethet for high-throughput screening.

Figur 1
Figur 1. En skjematisk fremstilling av preparatet av konsentrert Xenopus egg ekstrakt. Eggene hentes fra HCG-injisert Xenopus laevis hunner, komprimert med en lav hastighet (400 xg) spin, og knuste og adskilt med en middels hastighet (15000 xg ) spinn. Vær nøye med å injisere subkutant i rygg lymfe sac, fjerne de dårlige eggene forsiktig, og nøye skille høy kvalitet cytoplasmatisk ekstrakt fra lavere kvalitet mørkere ekstrakt som nevnt i teksten.

igure 2 "fo: content-width =" 5in "fo: src =" / files/ftp_upload/51425/51425fig2highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51425/51425fig2.jpg "/>
Figur 2. Β-catenin degraderer robust når det inkuberes i Xenopus egg ekstrakt. A) Et skjematisk av en degradering assay. B) [35 S]-merket β-catenin fremstilt ved en IVT reaksjon degraderer robust når det inkuberes i Xenopus egg ekstrakt. Tilsetting av MG132 (200 mm) til Xenopus egg ekstrakt hemmer β-catenin degradering. Mutasjon til alanines av GSK3 phosphosites innenfor β-catenin (β-catenin SA) eller tillegg av LiCl (25 mm) C) hemmer β-catenin degradering. D) GSK3 bindingssetet av Axin (aminosyrer 506-560) effektivt tapper GSK3 fra Xenopus egg ekstrakt. E) GSK3-utarmet Xenopus egg ekstrakt hemmer β-catenin fornedrelse og kan bli reddet av tillegg of rekombinant GSK3 (0,1 mg / ml). Tilsetting av LiCl (25 mm) blokkerer kapasitet av rekombinant GSK3 å redde β-catenin nedbrytning i GSK3-utarmet ekstrakt. Klikk her for å se større bilde.

Figur 3
Fig. 3. Luciferase-merket β-catenin nedbrytes når inkubert i Xenopus egg ekstrakt. A) Radiomerket β-catenin-luciferase nedbrytes i en hastighet lik den for ukodede β-catenin protein. Som med villtype-proteinet, tilsetning av LiCl (25 mM) inhiberer β-catenin-luciferase degradering. Luciferase alene ikke merkbart snu i Xenopus egg ekstrakt. Endringer i luciferase-aktivitet av de β-catenin-luciferase fusjon parallelt endringene i sine protein nivåer. B) Tilsetting av LiCl (25 mm) eller uttømming av GSK3 C) hemmer β-catenin-luciferase omsetning, ved å måle luciferase aktivitet. D) Immunoblotting for in vitro oversatt β-catenin- luciferase (ved hjelp av et anti-luciferase-antistoff) viste vesentlige mengder av fritt luciferase protein i enkelte preps som sannsynligvis bidrar til en høyere bakgrunnen sammenlignet med radiomerket nedbrytning assay. for å vise større bilde.

Figur 4
Figur 4 regulert. Nedbrytning av β-catenin-luciferase in Xenopus ekstrakt kan tilpassesen high-throughput-format. Representative dambrett-analyse for β-catenin-luciferase ved hjelp MG132 (450 uM) som en inhibitor av β-catenin degradering. Skraverte kolonnene angir MG132-behandlede brønner, og lettere søylene representerer kjøretøy (DMSO)-behandlet brønner. Kvantifisering og Z-faktor beregningsresultatet i en score på 0,3 indikerer en akseptabel analyse for potensiell bruk i high-throughput screening.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Xenopus egg ekstrakt er en robust biokjemisk system for å undersøke β-catenin omsetning. Konsentrasjonen av β-catenin i Xenopus egg ekstrakt er ca 25 nM 2. Under optimale betingelser er det egg-ekstrakt kan nedbryte β-catenin med en hastighet på 50 til 100 nM / hr, og er halv-maksimal ved 200 nM 24. Det er flere viktige skritt for vellykket tilberedning av β-catenin degradering bruker Xenopus egg ekstrakt. Disse omfatter 1) å generere høykvalitets Xenopus egg ekstrakt og den måte ved hvilken egg ekstrakt fremstilles, 2) for å generere kvalitetsradiomerket β-catenin og β-catenin-luciferase proteinet, 3) å optimalisere reaksjons-betingelsene for å støtte β-catenin nedbrytning, og fire ) korrekt prosessering av reaksjons tidspunkter.

En høy kvalitet fremstilling av Xenopus egg ekstrakt hvori β-catenin er robust nedbrytes avhenger både av kvaliteten av the egg og hvor eggene blir behandlet før knusing trinn samt hvor ekstraktet blir deretter sentrifugert for å oppnå den endelige ekstrakt. Som nevnt i protokollen, er det viktig å sikre at bare høye egg kvalitet (dokumentert av skarp kontrast mellom det mørke dyret halvkule og lys vegetal halvkule) brukes, at dårlig kvalitet egg (trevlet, spettet, eller hvite puffs) er fjernet i hele prosessen, at eggene blir holdt på et kjølig temperatur (16 ° C) i løpet av fremgangsmåten, og at fremgangsmåten blir utført så raskt som mulig. Det er viktig ikke å ofre kvalitet for mengden av ekstrakt. I tillegg, som tidligere nevnt, egg fra en frosk som legger dårlig kvalitet egg (> 10%) bør være helt forkastet.

Ekstraktet som er beskrevet ovenfor er en modifikasjon av meiose II-arrestert CSF ekstrakt 11.. Utarbeidelse av Xenopus egg ekstrakt for β-catenin nedbrytning (middels hastighet ekstrakt) differe fra klassiske ekstrakter utarbeidet for å studere cellesyklus 30-32, som er lav hastighet eller høy hastighet ekstrakter 35. Tilpasning Xenopus egg ekstrakt for optimal nedbrytning av andre proteiner kan kreve endring av sentrifugehastighet og antall spins. Lav hastighet ekstrakt inneholder intakte organeller og andre store cellulære komponenter. Således vil høyere hastighetsspinn endre sammensetningen av ekstraktet og potensielt fjerne inhiberende og / eller essensielle komponenter som påvirker nedbrytning av proteinet av interesse. Fremstillingen av mellomprodukt hastighet ekstrakt som her er beskrevet er tilpasset for nedbrytning av β-catenin av komponentene i Wnt veien. Spinning ekstraktet som er større enn 4 ganger i betydelig grad kan redusere kapasiteten av ekstraktet for å degradere β-catenin (selv om den har minimal virkning på nedbrytningen av en annen Wnt komponent, Axin). β-catenin er utsatt for caspase-mediert proteolyse i lav hastighet spin ekstrakt og ikke noticeably brytes ned i high-speed spin ekstrakt. Således er det sannsynlig at forskjellige hastighets ekstrakter vil være optimal for nedbrytning av komponenter i andre signalveier.

Generering av 35 S-β-catenin og β-catenin-luciferase kan utføres ved hjelp av en rekke kommersielt tilgjengelige kit. Protein produksjon ved hjelp av transkripsjon-oversettelse koplet system er svært avhengig av kvaliteten på plasmid: svært ren midi-preparater av plasmider fungerer bedre og er mer pålitelige i forhold til DNA mini-forberedelser. For radiomerking β-catenin, fersk innhentet [35 S] metionin eller translabel ([35 S] metionin pluss [35 S] cystein) er å foretrekke. Legg merke til at metionin og cystein begge har en tendens til å oksidere med langvarig lagring og dermed redusere deres innlemmelse i β-catenin ved in vitro transkripsjon-transla-koplet reaksjon. For langvarig lagring og gjentatt frysing-tiningsykluser kan inhibere nedbrytning, blir små mengder av radiomerket β-catenin fremstilt i en tid og brukes kort tid etter.

Mengden av protein oversatt og antallet methionines i proteinet bestemme styrken av radiomerket signal. For β-catenin, bør det ikke være noen problemer med å få sterke radioaktive signaler for nedbrytnings analyser. For proteiner med få methionines og / eller som ikke oversette godt, en [35 S] metionin og [35 S] cystein blanding kan brukes i stedet for [35 S] metionin og / eller lagt til en epitop tag (Myc) som inneholder flere methionines. Selv om suksess med ulike ekspresjonsplasmider som inneholder de aktuelle fag-arrangører (T7, T3, og SP6) kan fås for in vitro transkripsjon-oversettelse reaksjoner, pCS2 basert plasmid gir generelt de beste resultatene. I tillegg er signalet av det oversatte protein kan av og til økes dramatisk ved å fjerne den endogene 5'UTR. Til slutt, for storskalaforsøk (f.eks high-throughput screening), en stor mengde av rekombinant β-catenin-luciferase kan være nødvendig. β-catenin-luciferase fra Sf9 / baculovirus system forringer med liknende kinetikk som villtype β-catenin i Xenopus ekstrakt og embryoer to. Alternativt, en high-yield in vitro uttrykk system (f.eks hvetekim-basert) har blitt brukt for high-throughput screening 19, 20.

For å pålitelig å måle nedbrytningen av β-catenin i avtrekkssystemet, er det viktig at det første signal fra enten radiomerket β-catenin eller luciferase β-catenin fusjon er tilstrekkelig robust. Således viss mengde av optimalisering av experimenter på størrelsen av nedbrytning analysen er antallet tidspunkter nødvendig, og effektiviteten av in vitro translasjonsprodukter reaksjons will være nødvendig. Ved montering av nedbrytningsreaksjon, er det flere trinn kan man ta for å øke sjansen for å få robuste degradering. For det første bør alle reagenser tines raskt og plassert på is før deres fullstendige tin. På grunn av at nedbrytningen av β-catenin, er svært energiavhengig, er det viktig at ER er relativt frisk. For det andre er Xenopus egg ekstrakt tyktflytende, og det er viktig at reaksjonen blir grundig blandet etter tilsetning av radiomerket β-catenin/β-catenin-luciferase fusjon, ER, protein, små molekyl-modulatorer, etc. For det tredje, pre-inkubering av reaksjons bland i 20-30 min på is gir mer reproduserbare resultater ved testing av effekter av små molekyl modulatorer.

Evnen til å utarme proteiner fra Xenopus egg ekstrakt representerer et kraftig verktøy for å bedømme proteinfunksjon og deres konsentrasjonsavhengige effekter. Som et eksempel kan vi vise at tappe GSK3 fra Xenopus egg ekstrakt blokker nedbrytning av β-catenin, indikerer den viktige rollen GSK3 i β-catenin omsetning. Forskjellige uttømming betingelser må bestemmes empirisk for forskjellige proteiner. For eksempel, vil tallrike proteiner krever en økning i mengden av antistoff eller affinitetsligand perler som brukes for å oppnå fullstendig tømming. Et godt utgangspunkt er å benytte pakkede kuler til 1/10 av volumet av ekstraktet for å minimere ekstrakt fortynning. I tillegg til styrken av binding av antistoff / affinitetsligand til målproteinet, typen av perler (som sepharose, agarose, eller magnetisk) anvendes kan innvirke på effektiviteten av protein uttømming fra Xenopus egg ekstrakt 36.. Endelig ville det være ideelt å analysere omfanget av uttømming (typisk ved immuno). Når β-catenin reaksjonen er fullført, kan den måte ved hvilken prøvene blir behandlet i stor grad påvirke resultatene av forsøket. Konsentrasjonen avXenopus egg ekstrakt preps fremstilt på den beskrevne måte er 52,41 mg / ml ± 5,40 mg / ml, og det er viktig ikke å overbelaste kapasiteten på SDS-PAGE-gel; Dette er ikke et problem med luciferase-β-catenin assay. Således, for hvert tidspunkt, ikke mer enn 1 ml ekvivalent av ekstrakt skal bli lastet inn i hvert kjørefelt på en SDS-PAGE gel. For ytterligere forbedring av kvaliteten av resultatene, vil gelen fiksering trinn (valgfritt) å redusere bakgrunnsradioaktiviteten og øke signal-til-støy-forhold. For luciferase assay, en reduksjon fra en opprinnelig signal fra 100000 RLU i Xenopus egg ekstrakt reflekterer trofast endringen i protein nivåene av β-catenin-luciferase-fusjonsprotein.

Den Xenopus egg ekstrakt systemet representerer et attraktivt system for å studere reguleringen av β-catenin degradering. Ekstraktet systemet gir mulighet for nøyaktig kontroll av konsentrasjonen av individuelle proteiner via uttømming og rekonstitusjonsfremgangsmåter sjon. Evnen til å overvåke deres innflytelse på kinetikken til β-catenin omsetning over tid muliggjør en bedre forståelse av den biokjemiske mekanisme av denne avgjørende skritt i Wnt signaltransduksjon. Slike manipulasjoner har gitt dyp innsikt i de komplekse molekylære interaksjoner mellom komponentene i Wnt veien og var kritisk for utviklingen av det første matematisk modell av Wnt veien 24.. En påminnelse er at konsentrasjonene av Wnt veien komponenter i Xenopus egg ekstrakt og pattedyr cellelysater har blitt funnet å være forskjellig, som muligens gjenspeiler forskjeller i måten Wnt veien er regulert under embryo versus den voksne situasjonen 37. Kapasitet til å utføre både radioaktive og enzymatiske, luciferase-baserte analyser ved hjelp Xenopus egg ekstrakt gir ekstra kraftige utfyllende kvalitative og kvalitative verktøy for å studere biokjemiske regulering av β-catenin degradering.

t "> I tillegg til å overvåke omsetningen av β-catenin, kan nedbrytning av den negative Wnt regulator, Axin, overvåkes i Xenopus egg ekstrakt enten som en radiomerket protein eller fusjon til luciferase. Ved hjelp av en variant av luciferase, Renilla, smeltet til Axin, ble tidligere tilrettelagt for luciferase degradering analysen inn i en high-throughput format å samtidig skjerme for modulatorer av to Wnt veien proteiner, β-catenin og Axin 19, 20. identifisert Denne biokjemiske skjermen FDA-godkjente stoffet, pyrvinium at økt og redusert nedbrytningshastigheten for β-catenin og Axin, henholdsvis i Xenopus egg ekstrakt 19.. Pyrvinium ble deretter validert i dyrkede humane celler, og i forskjellige modellorganismer (for eksempel Xenopus og C. elegans) som et lite molekyl som hemmer av den kanoniske Wnt pathway. Oppsummert er Xenopus egg ekstrakt systemet en allsidig biokjemisk system that kan utnyttes i et mangfold av måter å studere mekanismen av Wnt signal samt for identifisering av små molekyl modulatorer av Wnt veien. Den biokjemiske metode som er beskrevet heri kan anvendes på andre signalveier, der proteindegradering kan spille en kritisk rolle.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Vi takker Laurie Lee for kritisk lesing av manuskriptet. TWC er støttet av en American Heart Association Predoctoral Fellowship (12PRE6590007). MRB er støttet av en National Cancer Institute trening stipend (T32 CA119925). SSH er støttet av National Institutes of Health (R01DK078640). EL er støttet av National Institutes of Health (R01GM081635 og R01GM103926).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) ProSpec hor-272-A Reconstituted with distilled water before use. 
Human chorionic gonadotropin Sigma CG10-10VL
Potassium chloride Fisher BP366-1
Sodium chloride Research Products International S23020-5000.0
Magnesium chloride Fisher BP214-500
Calcium chloride Acros Organics AC42352-5000
HEPES Fisher BP310-1
Cysteine Acros Organics AC17360-1000
Leupeptin Sigma L2884-10MG
Aprotinin Sigma A1153-10MG
Pepstatin Sigma P4265-5MG
Cytochalasin B Sigma C8273-10MG
3 ml syringe: Luer Lock tip Becton Dickinson 309657
27 G needle Becton Dickinson 305109
96 well solid white polystyrene microplate, round bottomed Corning 3605
Steady-Glo luciferase assay system Promega E2520 Store long-term at -80 °C, can store for up to 1 month at -20 °C
TNT Sp6 coupled reticulocyte lysate system Promega L4600
TNT Sp6 high-yield wheat germ protein expression system Promega L3260 Generally higher yield than reticulocyte lysate 
EasyTag Express protein labeling mix [S35] Perkin Elmer NEG772007MC
Creatine phosphate Sigma 27920-5G
ATP Sigma A2383-5G
Creatine phosphokinase Sigma C3755-35KU
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D8418-50ML
Dual-Glo luciferase assay system Promega E2920 Same storage conditions as Steady-Glo
50 ml Centrifuge tubes Fisher Scientific 0556214D
Sorvall SS-34 fixed angle rotor Thermo Scientific 28020
115 V 50/60 Hz Minicentrifuge Fisher Scientific 05-090-128
mMessage mMachine Sp6 kit Ambion AM1340
Anti-firefly luciferase antibody Abcam ab16466
Anti-GSK3 antibody BD Transduction Laboratories 610201
FLUOStar Optima BMG Labtech
Sorvall RC-6 Plus centrifuge Thermo Scientific
16 °C Incubator Percival Scientific

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Glotzer, M., Murray, A. W., Kirschner, M. W. Cyclin is degraded by the ubiquitin pathway. Nature. 349, 132-138 (1991).
  2. Salic, A., Lee, E., Mayer, L., Kirschner, M. W. Control of beta-catenin stability: reconstitution of the cytoplasmic steps of the wnt pathway in Xenopus egg extracts. Molecular Cell. 5, 523-532 (2000).
  3. Murray, A. W. Cell cycle extracts. Methods in cell biology. 36, 581-605 (1991).
  4. Dabauvalle, M. C., Scheer, U. Assembly of nuclear pore complexes in Xenopus egg extract. Biology of the cell / under the auspices of the European Cell Biology Organization. 72, 25-29 (1991).
  5. Tutter, A. V., Walter, J. C. Chromosomal DNA replication in a soluble cell-free system derived from Xenopus eggs. Methods Mol Biol. 322, 121-137 (2006).
  6. Theriot, J. A., Rosenblatt, J., Portnoy, D. A., Goldschmidt-Clermont, P. J., Mitchison, T. J. Involvement of profilin in the actin-based motility of L. monocytogenes in cells and in cell-free extracts. Cell. 76, 505-517 (1994).
  7. Maresca, T. J., Heald, R. Methods for studying spindle assembly and chromosome condensation in Xenopus egg extracts. Methods Mol Biol. 322, 459-474 (2006).
  8. Shennan, K. I. Xenopus egg extracts: a model system to study proprotein convertases. Methods Mol Biol. 322, 199-212 (2006).
  9. Kornbluth, S., Yang, J., Powers, M. Analysis of the cell cycle using Xenopus egg extracts. Current protocols in cell biology / editorial board, Juan S. Bonifacino ... [et al.]. 11, (2006).
  10. Chan, R. C., Forbes, D. I. In vitro study of nuclear assembly and nuclear import using Xenopus egg extracts. Methods Mol Biol. 322, 289-300 (2006).
  11. Masui, Y., Markert, C. L. Cytoplasmic control of nuclear behavior during meiotic maturation of frog oocytes. The Journal of experimental zoology. 177, 129-145 (1971).
  12. Forbes, D. J., Kirschner, M. W., Newport, J. W. Spontaneous formation of nucleus-like structures around bacteriophage DNA microinjected into Xenopus eggs. Cell. 34, 13-23 (1983).
  13. Lohka, M. J., Masui, Y. Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components. Science. 220, 719-721 (1983).
  14. Newport, J. W., Kirschner, M. W. Regulation of the cell cycle during early Xenopus development. Cell. 37, 731-742 (1984).
  15. Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312, 237-242 (1984).
  16. Blow, J. J., Laskey, R. A. Initiation of DNA replication in nuclei and purified DNA by a cell-free extract of Xenopus eggs. Cell. 47, 577-587 (1986).
  17. Verma, R., et al. Ubistatins inhibit proteasome-dependent degradation by binding the ubiquitin chain. Science. 306, 117-120 (2004).
  18. Yu, H., King, R. W., Peters, J. M., Kirschner, M. W. Identification of a novel ubiquitin-conjugating enzyme involved in mitotic cyclin degradation. Curr Biol. 6, 455-466 (1996).
  19. Thorne, C. A., et al. Small-molecule inhibition of Wnt signaling through activation of casein kinase 1alpha. Nature Chemical Biology. 6, 829-836 (2010).
  20. Thorne, C. A., et al. A biochemical screen for identification of small-molecule regulators of the Wnt pathway using Xenopus egg extracts. Journal of Biomolecular Screening. 16, 995-1006 (2011).
  21. Hinkson, I. V., Elias, J. E. The dynamic state of protein turnover: It's about time. Trends in Cell Biology. 21, 293-303 (2011).
  22. Kinzler, K. W., Vogelstein, B. Lessons from Hereditary Colorectal Cancer. Cell. 87, 159-170 (1996).
  23. Lee, E., Salic, A., Kirschner, M. W. Physiological regulation of [beta]-catenin stability by Tcf3 and CK1epsilon. J Cell Biol. 154, 983-993 (2001).
  24. Lee, E., Salic, A., Krüger, R., Heinrich, R., Kirschner, M. W. The roles of APC and Axin derived from experimental and theoretical analysis of the Wnt pathway. PLoS Biology. 1, (2003).
  25. Seeling, J. M., et al. Regulation of beta-catenin signaling by the B56 subunit of protein phosphatase 2A. Science. 283, 2089-2091 (1999).
  26. Guger, K. A., Gumbiner, B. M. beta-Catenin has Wnt-like activity and mimics the Nieuwkoop signaling center in Xenopus dorsal-ventral patterning. Dev Biol. 172, 115-125 (1995).
  27. Cselenyi, C. S., et al. LRP6 transduces a canonical Wnt signal independently of Axin degradation by inhibiting GSK3's phosphorylation of β-catenin. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 8032-8037 (2008).
  28. Jernigan, K. K., et al. Gbetagamma activates GSK3 to promote LRP6-mediated beta-catenin transcriptional activity. Science Signaling. 3, (2010).
  29. Major, M. B., et al. Wilms tumor suppressor WTX negatively regulates WNT/beta-catenin signaling. Science. 316, 1043-1046 (2007).
  30. Cross, M. K., Powers, M. Obtaining eggs from Xenopus laevis females. J Vis Exp. , (2008).
  31. Cross, M. K., Powers, M. Preparation and fractionation of Xenopus laevis egg extracts. J Vis Exp. , (2008).
  32. Willis, J., DeStephanis, D., Patel, Y., Gowda, V., Yan, S. Study of the DNA damage checkpoint using Xenopus egg extracts. J Vis Exp. , (2012).
  33. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus Laevis : A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
  34. Rubinfeld, B., et al. Binding of GSK3β to the APC-β-Catenin Complex and Regulation of Complex Assembly. Science. 272, 1023-1026 (1996).
  35. Salic, A., King, R. W. Identifying small molecule inhibitors of the ubiquitin-proteasome pathway in Xenopus egg extracts. Methods in Enzymology. 399, 567-585 (2005).
  36. Trinkle-Mulcahy, L., et al. Identifying specific protein interaction partners using quantitative mass spectrometry and bead proteomes. J Cell Biol. 183, 223-239 (2008).
  37. Tan, C. W., et al. Wnt signalling pathway parameters for mammalian cells. PLoS One. 7, (2012).

Tags

Molecular Biology , protein degradering radiomerket substans luciferase autoradiography high-throughput screening
Rekonstituering av β-catenin degradering i<em&gt; Xenopus</em&gt; Egg Extract
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, T. W., Broadus, M. R.,… More

Chen, T. W., Broadus, M. R., Huppert, S. S., Lee, E. Reconstitution Of β-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract. J. Vis. Exp. (88), e51425, doi:10.3791/51425 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter