Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

إعادة تشكيل β-catenin تدهور في Published: June 17, 2014 doi: 10.3791/51425
* These authors contributed equally

Summary

ووصف طريقة لتحليل تدهور البروتين باستخدام رديولبلد والبروتينات luciferase المراسل الانصهار في القيطم استخراج البيض والتكيف من أجل الفرز الفائق الإنتاجية للجهري جزيء صغير من تدهور البروتين.

Abstract

القيطم المورق استخراج البيض هو، نظام قوي يتميز جيدا لدراسة الكيمياء الحيوية من العمليات الخلوية المختلفة. وقد استخدمت القيطم استخراج البيض لدراسة دوران البروتين في العديد من السياقات الخلوية، بما في ذلك دورة الخلية ومسارات نقل الإشارة 1-3. هنا، يتم وصف طريقة لعزل القيطم استخراج البيض الذي تم الأمثل لتعزيز تدهور المكون مسار WNT الحرجة، β-catenin. يتم وصف طريقتين مختلفتين لتقدير β-catenin تدهور البروتين في البيض القيطم استخراج. أسلوب واحد هو بالمعلومات بصريا ([35 S]-رديولبلد البروتينات)، في حين أن الآخر يتم تحجيم بسهولة أكبر لفحوصات عالية الإنتاجية (يراعة luciferase المراسل الموسومة البروتينات الانصهار). الأساليب المذكورة يمكن استخدامها ل، ولكن ليس على سبيل الحصر، تقييم β-catenin البروتين دوران وتحديد المكونات الجزيئية التي تسهم في حجم اعمالها. بالإضافة إلى ذلك، أبيإيتي لتنقية كميات كبيرة من متجانسة القيطم استخراج البيض جنبا إلى جنب مع قراءات الكمية والسهل من البروتينات الموسومة luciferase المراسل يسمح هذا النظام ليتم تكييفها بسهولة للكشف عن الإنتاجية العالية للجهري من تدهور β-catenin.

Introduction

وقد استخدم القيطم المورق استخراج البيض على نطاق واسع لدراسة العديد من العمليات البيولوجية الخلية بما في ذلك ديناميات هيكل الخلية، والتجمع النووية والاستيراد، وموت الخلايا المبرمج، والتمثيل الغذائي اليوبيكويتين، تقدم دورة الخلية، نقل الإشارة، والبروتين دوران 1-17. والقيطم البيض استخراج النظام قابلة للتحليل كيميائي حيوي من حشد غفير من العمليات الخلوية لاستخراج البيض يمثل أساسا السيتوبلازم غير مخفف يحتوي على كافة مكونات حشوية الأساسية اللازمة لتنفيذ هذه العمليات وتمكين التحقيق. كميات كبيرة من استخراج البيض يمكن أن تكون على استعداد في وقت واحد للتلاعب البيوكيميائية التي تتطلب كميات كبيرة من المواد (على سبيل المثال، وتنقية البروتين أو الفرز الفائق الإنتاجية) 18-20. ميزة أخرى هي أن تركيز بروتينات معينة في القيطم استخراج البيض يمكن تعديلها على وجه التحديد عن طريق إضافة المؤتلف البروتين و / أو immunodepletion من endogالبروتينات enous على النقيض من ترنسفكأيشن من الحمض النووي البلازميد حيث التعبير عن بروتين من الفائدة من الصعب السيطرة عليها. بالإضافة إلى ذلك، عدم وجود البروتينات المؤتلف متوفرة ويمكن التغلب عليها عن طريق إضافة نصوص ترميز البروتين من الفائدة، والاستفادة من قدرة الطازجة القيطم استخراج البيض العالية لترجمة مرنا وأضاف خارجيا.

تنظيم تدهور البروتين أمر بالغ الأهمية من أجل السيطرة على العديد من مسارات الخلوية والعمليات 21. وقد استخدم على نطاق واسع القيطم استخراج البيض لدراسة تدهور البروتين كما يسمح النظام عن طرق متعددة لرصد دوران البروتين دون التأثيرات الخلط بين النسخ والترجمة. إشارات مسار WNT هو مسار الإشارات حفظا للغاية أن يلعب أدوارا حاسمة في تطوير والمرض. دوران β-catenin، والمستجيب الرئيسية للمسار WNT، ودرجة عالية من التنظيم، وزادت حالة استقرار لترايفل من β-catenin هو أمر حاسم لتفعيل الجينات المستهدفة WNT. وسلط الضوء على أهمية تدهور β-catenin من حقيقة أن الطفرات في مسار WNT التي تمنع تدهور β-catenin جدت في ~ 90٪ من جميع حالات متفرقة من سرطان القولون والمستقيم 22. تدهور β-catenin بواسطة مكونات من مسار WNT يمكن تلخيصها بإخلاص في استخراج البيض القيطم لدراسة آلية من حجم اعمالها، وكذلك لتحديد جهري جزيء صغير الرواية من تدهورها 2، 19، 20، 23-29.

وقد وصفت وسائل لإعداد القيطم استخراج البيض لدراسة دورة الخلية في المنشورات السابقة إن الرب 30-32. يصف البروتوكول الحالي لتعديل هذه الأساليب والأمثل لتدهور [35 S]-β-رديولبلد catenin والموسومة luciferase المراسل β-catenin فيالقيطم استخراج البيض. تدهور فحص رديولبلد يسمح للرؤية مباشرة من مستويات البروتين عن طريق تصوير الإشعاع الذاتي. أدرج [35 S] ميثيونين في البروتين من الفائدة باستخدام ترجمة رد فعل في المختبر التي يمكن بعد ذلك إضافتها مباشرة إلى رد فعل تدهور. بالإضافة إلى ذلك، لا يتطلب البروتين رديولبلد دوران فحص الأجسام المضادة ضد البروتين من الفائدة أو علامة حاتمة، والتي يمكن أن تؤثر على استقرار البروتين. لأنه حتى التغيرات الصغيرة في مستويات البروتين، كما يتجلى في التغيرات في كثافة البروتين رديولبلد الفرقة، وتصور بسهولة عن طريق تصوير الإشعاع الذاتي، و[35 S]-رديولبلد يمثل تدهور فحص وسيلة مفيدة جدا لرؤية بروتين دوران 2.

انصهار β-catenin ليراعة luciferase (المشار إليها فيما يلي باسم ببساطة "luciferase المراسل") يسمح لقياس الكمي الدقيق والسهل من مستويات البروتين، من أجللتحديد الخصائص الحركية للβ-catenin دوران 19، 20. والميزة الرئيسية للمقايسة luciferase المراسل هو أنه يوفر نظام كمي قوية على أن يتم تحجيم بسهولة. يوفر بروتوكول التالية أساليب بسيطة لمعايرة تدهور β-catenin وطريقة قوية وفعالة، وفعالة لالفرز الفائق الإنتاجية من رواية جهري β-catenin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد القيطم استخراج البيض

ملاحظة: كل الضفدع ينتج ما يقرب من 1 مل من استخراج البيضة صالحة للاستعمال. وعادة ما يتم إعداد مقتطفات من 10 الضفادع في وقت واحد، وحجم المخزن المؤقت هو موضح أدناه لإجراء 10 الضفدع القيطم استخراج البيض الإعدادية. حجم المخزن المؤقت يمكن تعديلها وفقا لذلك لتحضير أكبر أو أصغر من استخراج البيض. محضرات ولدت بهذه الطريقة تسفر باستمرار تركيزات البروتين ≥ 50 ملغ / مل. عملية جمع البيض ومعالجتها في استخراج هو الأكثر فعالية عندما أجريت من قبل شخصين. (للحصول على تقنيات تربية الضفادع الأساسية، انظر SIVE وآخرون 33).

  1. جمع البيض
    1. لرئيس الضفادع، وضخ كل الضفادع الإناث مع 100 U من الحوامل ماري المصل موجهة الغدد التناسلية (PMSG) من تقدم طازجة 250 الأسهم U / مل. استخدام 3 مل حقنة السلين مع 27 G إبرة لحقن تحت الجلد، مع شطبة منوحتى إبرة، في كيس الليمفاوية الظهرية، والذي يقع ما يقرب من 1 سم بعيدا عن خط الوسط من تغيير الألوان حقق على طول الساقين الضفدع.
    2. متجر الضفادع معبي في الماء (زائد 20 مم كلوريد الصوديوم، انظر SIVE آخرون 33) عند 18 درجة مئوية لمدة 5-10 أيام. لأنظمة خزان المياه الراكدة، وكثافة الحيوانات ما يقرب من 4 لتر من الماء لكل الضفدع الإناث. ملاحظة: الحد الأدنى للالوقت اللازم لفتيلة نافذة المفعول هو 5 أيام، وآثار فتيلة يزول بعد 10 يوما.
    3. إعداد التعديل قارعو الأجراس (MMR) حل 0.5X مارك لمن MMR الأسهم 20x و. يتكون 20x وMMR من 2 M كلوريد الصوديوم، و 40 ملي كلوريد البوتاسيوم وكلوريد الكالسيوم 40 ملم، 20 ملم كلوريد المغنيسيوم، و 100 ملي 4 - (2-هيدروكسي)-1-piperazineethanesulfonic حمض (HEPES)، ودرجة الحموضة 7.4.
    4. إعداد الدلاء لجميع الضفادع حقن (ضفدع واحد لكل 4 لتر دلو). ملاحظة: على الرغم من ضفدع واحد أو أكثر يمكن وضعها في نفس دلو لجمع البيض، وإذا كان واحد من الضفادعيضع البيض في الغالب ذات جودة رديئة، وسوف تكون هناك حاجة إلى قدر كبير من الجهد لفصل البيض نوعية رديئة من تلك التي هي مناسبة لصنع استخراج. وبالتالي، وتعظيم عدد من الضفادع في الدبابة نفسها لتقليل كمية من العازلة المستخدمة لنجمع البيض هو لا يستحق المخاطرة.
    5. ضخ 750 U الإنسان موجهة الغدد التناسلية المشيمية (HCG) في الكيس الظهري الليمفاوية من كل ضفدع باستخدام إبرة 27 G كما هو موضح في 1.1.1.
    6. وضع كل من الضفادع حقن HCG في دلاء فردية 4 L تحتوي على 0.5X MMR يتم تبريده الى 16 درجة مئوية.
    7. وضع حاويات مع الضفادع في حاضنة 16 درجة مئوية إلى جمع البيض O / N (15-16 ساعة). ملاحظة: الحفاظ على درجة حرارة مناسبة أمر حاسم بالنسبة الإجراء بأكمله، من جمع البيض لإعداد استخراج البيض.
  2. Dejellying بيض
    ملاحظة: يتم تغطية البيض مع معطف هلام التي يجب إزالتها قبل اتخاذ استخراج. احتمال تحلل عفوية من البيض يزيد عن الوقت بين:ن وضع البيض واستخراج الزيادات التحضير. وبالتالي، من المهم المضي قدما من خلال الخطوات التالية بأسرع ما يمكن.
    1. إعداد 4 L من 1X MMR، و 50 مل من 0.1X MMR، و 400 مل من 2٪ السيستين، ودرجة الحموضة 7.7، المحرز في الماء المقطر. الحفاظ على كل الحلول عند 16 درجة مئوية.
    2. لطرد البيض إضافية، الضغط بلطف أسفل الظهر والبطن من الضفادع.
    3. إزالة الضفادع والجزء الأكبر من معدل وفيات الأمهات، وترك البيض في حوالي 1-200 مل من معدل وفيات الأمهات في كل دلو.
    4. إزالة الأنقاض مع ماصة نقل، وتقييم جودة البيض: يتم وضع علامة البيض جودة عالية عموما فصل واضح بين نصف الكرة الحيوان المصطبغة بحزن ونصف الكرة نباتية ملونة خفيفة وتحتوي على أعلى النقيض من الظلام إلى النور. تجاهل مع ماصة نقل أي البيض التي تظهر مفتول العضلات، مرقش، أو هي lysed (أبيض ومنتفخ) لأنها سوف تقلل من الجودة الشاملة للاستخراج. إذا> 10٪ من البيض هي من نوعية رديئة، كامليجب التخلص من دفعة واحدة.
    5. الجمع بين البيض في كوب 500 مل كوب واسكب بقدر MMR ممكن مع الحفاظ على البيض المغمورة.
    6. شطف البيض بنسبة يحوم طيف مع ضعف حجم بيضة MMR. كرر مرتين، وإزالة أي حطام أو البيض نوعية رديئة واضح.
    7. إضافة حوالي 100 مل من 2٪ السيستين إلى الدورق الزجاجي، دوامة بلطف لمزج، والسماح لتسوية البيض لمدة 5 دقائق عند 16 درجة مئوية. تخلصي من السيستين. ملاحظة: يتم وضع علامة Dejellying بظهور تدريجي للهلام المعاطف تطفو فوق البيض والتعبئة والتغليف أكثر إحكاما من البيض كما أنها الآن تحتل حجم أصغر من دون معطف هلام.
    8. إضافة 100 مل من 2٪ أخرى السيستين، دوامة بلطف، انتظر 5 دقائق، ثم صب ببطء بعيدا عن والسيستين. كرر حتى أصبحت البيض ضغط بإحكام (عادة عن طريق علاج السيستين الثالث). ملاحظة: إذا ترك البيض فترة طويلة جدا في السيستين، فهي عرضة للتحلل. وبالمثل، البيض dejellied هشة وعرضة للتحلل الميكانيكية إذا كانتوملتف بقوة جدا أو إذا تعرضوا للهواء. مرة واحدة تم dejellied البيض، من المهم المضي قدما بسرعة إلى الخطوات الطرد المركزي.
    9. تخلصي السيستين، وشطف بعيدا معطف هلام وغيرها من الحطام عن طريق غسل بلطف البيض في 1X MMR. تخلصي عازلة بعناية على طول الجانب من الكأس. كرر مرتين أو حتى حل MMR لم يعد غائم. بينما الشطف مع 1X MMR مواصلة إزالة البيض سيئة باستخدام ماصة نقل.
    10. إجراء الشطف النهائي لطيف مع 30 مل 0.1X MMR، وبلطف صب قبالة أكبر قدر من العازلة ممكن. مرة أخرى، وإزالة أي الاسوياء واضح.
  3. التعبئة وسحق البيض بواسطة الطرد المركزي
    ملاحظة: يستخدم مستخلص موضح أدناه أن لتدهور β-catenin هو البديل من استخراج عامل تثبيط الخلايا (الطورية II-القبض). وعلى النقيض من سرعة منخفضة وعالية السرعة تستخدم لاستخراج دراسات دورة الخلية، واستخراج سرعة متوسطة يعمل بشكل أفضل لتدهور β-catenin. أنااستخراج nterphase يعزز بالمثل قوية تدهور β-catenin على الرغم من هو أكثر عمالة كثيفة للاستعداد.
    1. إضافة Leupeptin، Pepstatin، أبروتينين خليط (LPA، مثبط البروتياز) في 10 ميكروغرام / مل (المخفف من 10 ملغ / مل في محلول المخزون DMSO) ومثبط حركة الخلايا D في 20 ميكروغرام / مل (المخفف من 10 ملغ / مل محلول المخزون في DMSO) في 20 مل المتبقية من 0.1X MMR.
    2. إضافة 0. س MMR تحتوي LPA ومثبط حركة الخلايا D إلى البيض غسلها، دوامة بلطف، واحتضان لمدة 5 دقائق عند 16 درجة مئوية.
    3. نقل البيض إلى 16 درجة مئوية قبل المبردة 50 مل أنابيب الطرد المركزي، والسماح للبيض ليستقر، وإزالة العازلة المتبقية من أعلى. لمنع التعرض للهواء، سحب كمية صغيرة من العازلة في ماصة نقل قبل سحب البويضات لنقل. مواصلة نقل البيض إضافية في أنابيب الطرد المركزي وإزالة العازلة المتبقية من الجزء العلوي من أنبوب حتى ملء البيض أنبوب الطرد المركزي إلى الأعلى، والتي سوف تعظيم العائد مناستخراج.
    4. لحزم البيض، وأنابيب تدور أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 60 ثانية في 4 درجات مئوية باستخدام الدوار زاوية ثابتة. إزالة العازلة المتبقية من الجزء العلوي من أنابيب الطرد المركزي.
    5. لسحق تدور، وتدور في أنابيب 15،000 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
  4. جمع طبقة السيتوبلازم من استخراج
    ملاحظة: الطريقة الموضحة أدناه يختلف عن الأسلوب الكلاسيكي من ثقب جانب أنبوب الطرد المركزي من أجل جمع طبقة حشوية. وقد تم تكييف هذا البروتوكول لتبسيط وخاصة للاستخدام مع أنابيب الطرد المركزي، والتي هي قابلة لإعادة الاستخدام. لم يتم العثور على اختلافات ملحوظة في حركية تدهور β-catenin مع أي من الطريقتين. في هذا المقتطف نقطة يجب أن تبقى باردة أثناء جميع مراحل العملية، ويجب أن يتم تنفيذ جميع الخطوات في 4 درجات مئوية.
    1. مسح ثقب في طبقة الدهون باستخدام ماصة P1000 طرف.
    2. جمع طبقة حشوية (بين طبقة مصطبغة داكنة ولىطبقة الدهون GHT) باستخدام ماصة P1000 جديدة في تلميح نظيفة أنابيب الطرد المركزي قبل المبردة (الشكل 1). لاستخراج عالية الجودة التي تحط بقوة β-catenin، تقليل كمية طبقة المصطبغة والدهون التي يتم سحبها مع طبقة حشوية.
    3. تدور استخراج طبقة حشوية في 15،000 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية، ومرة ​​أخرى جمع طبقة حشوية. تكرار تدور واستخراج 1X. ملاحظة: استخراج يجب أن يكون "القشة الملونة." إذا كان هناك تلوث كبير مع طبقات الدهون المصطبغة وعند هذه النقطة، يمكن للمرء أن تكرار تدور واحد مزيد من الوقت، على الرغم من أن يدور المفرط سيقلل من قدرة استخراج أن تتحلل β-catenin.
    4. إضافة LPA ومثبط حركة الخلايا D لاستخراج بتركيزات النهائي من 10 ميكروغرام / مل لكل منهما. ملاحظة: استخدام الأسلوب هو موضح ينتج ما مجموعه تركيز ثابت تقريبا من البروتين حوالي 50 ملغ / مل (52.41 ± 5.40 ملغ / مل، ن = 3 محضرات منفصلة) في مثل القيطمز مقتطفات.
    5. (اختياري) لفحوصات الترجمة، إضافة توج مرنا (0.1 ملغ / مل)، RNAsin (1.5 U / مل)، والطاقة مزيج تجديد (2.2.1)، واحتضان رد فعل على RT لمدة 2 ساعة (لمزيد من المعلومات انظر ساليك وآخرون آل 2 و SIVE وآخرون 33). استخدام مستخلص ترجمتها على الفور لفحوصات تدهور β-catenin أو المفاجئة للتجمد في النيتروجين السائل لاستخدامها لاحقا. ملاحظة: أعدت طازجة استخراج لديه قدرة عالية على ترجمة أضاف خارجيا مرنا، ولكن للأسف، يتم فقدان هذه القدرة مرة واحدة يتم تجميد استخراج. توج مرنا يمكن تحضير بسهولة باستخدام مجموعات متاحة تجاريا.
    6. استخراج الأداة الإضافية تجميد في النيتروجين السائل. ملاحظة: يتم تخزين مقتطفات صغيرة في (200 ميكرولتر) مأخوذة عن استخدام مرة واحدة لأنها تفقد بسرعة قدرتها على تتحلل β-catenin إذا أعيد تجميدها مرة أخرى. للتخزين على المدى الطويل، ويمكن تخزينها في استخراج النيتروجين السائل. للتخزين على المدى القصير، ويمكن تخزين استخراج في -80 درجة مئوية، على الرغم من قدرة سو استخراج أن تتحلل β-catenin يمكن الحد بشكل كبير مع تخزين طويلة في -80 ° C (أطول من شهر 2).

2. إعداد مستخلص للβ-catenin تدهور الفحص

  1. استنزاف من القيطم استخراج
    ملاحظة: والميزة الرئيسية لاستخراج القيطم هو القدرة على تستنزف بسهولة مكونات طريقا وإضافة إلى الوراء بالضبط كمية محددة من البروتين من أجل تحديد الآثار تعتمد على الجرعة الخاصة به.
    1. استخدام الطازجة القيطم استخراج البيض أو ذوبان الجليد بسرعة استخراج المجمدة ومكان على الجليد. أداء جميع التلاعب في البرد.
    2. إضافة إلى استخراج 1/10 من حجم الأجسام المضادة مكعبات او الخرز تقارب (على سبيل المثال، 20 مل حبات مكعبات لاستخراج 200 مل). من أجل تقليل التخفيف من استخراج، سحب قدر السائل من الخرز ممكن قبل بالإضافة للاستخراج باستخدام هلام نصائح التحميل مع طويلة، نصائح مدبب.
    3. تدوير استخراج-مزيج حبة في 4 درجات مئوية لمدة 1 ساعة.
    4. تدور مزيج استخراج حبة في 12،600 XG في microfuge في 4 درجة مئوية لمدة 30 ثانية. بدلا من ذلك، إذا تم استخدام الخرز المغناطيسي، وتطبيق المجال المغناطيسي لجمع الخرز.
    5. نقل المنضب استخراج إلى أنبوب microfuge جديدة على الجليد. يجب الحرص على عدم نقل أي الخرز مع استخراج.
    6. تأكيد كفاءة نضوب بواسطة immunoblotting كلا استخراج المنضب والخرز.
    7. إعداد مستخلص لβ-catenin تدهور الفحص كما هو موضح في 2.2.
  2. تحسين القيطم استخراج لβ-catenin تدهور
    ملاحظة: تدهور β-catenin في القيطم استخراج البيض هو عملية تعتمد على الطاقة التي تستنزف بسرعة مخازن ATP الذاتية. بالتالي، لا بد من وضع نظام تجديد الطاقة للحفاظ على قوة تدهور β-catenin.
    1. إعداد مزيج 20x وتجديد الطاقة (ER)، ويتألف من 150 ملي فوسفات الكرياتين، 20 ملي ATP، 600 ميكروغرام / مل فسفوكيناز الكرياتين،و 20 ملي MgCl 2. وينبغي aliquoted ER وتخزينها في -80 درجة مئوية. تجنب تكرار دورات تجميد / الذوبان باستخدام مأخوذة المجمدة صغيرة.
    2. ذوبان الجليد بسرعة القيطم استخراج البيض من قبل فرك أنبوب المجمدة بين يديه. وضع أنبوب على الجليد قبل كل من مستخلص قد ذاب.
    3. إضافة 10 ميكرولتر من مزيج تجديد الطاقة (20x وER) في قسامة (200 ميكرولتر) من القيطم استخراج البيض. مزيج دقيق من قبل بسرعة عبها الأنبوب ونبض vortexing ل. نبض تدور ووضع على الفور على الجليد.
    4. (اختياري) دوران β-catenin يمكن تعزيز قليلا في القيطم استخراج البيض بإضافة اليوبيكويتين (1.25 ملغ / مل النهائي). ويمكن أيضا سيكلوهيكسيميد (النهائية 0.1 ملغ / مل) أن تضاف إلى تقليل ترجمة النصوص الذاتية.
    5. قسامة وحدات التخزين المناسبة لتدهور الفحص في أنابيب microfuge قبل المبردة على الجليد. لرديولبلد المقايسات تدهور β-catenin، سحب 2-5 استخراج مل لكل نقطة زمنية. </ لى>

3. رديولبلد β-catenin تدهور في مقايسة القيطم استخراج البيض

ملاحظة: يجب أن يتم تنفيذ جميع الخطوات على الجليد ما لم يرد خلاف ذلك.

  1. إعداد رديولبلد β-catenin
    1. إعداد طازجة في المختبر توليفها [35 S] البروتين ميثيونين رديولبلد باستخدام مجموعات متاحة تجاريا. يتم بسهولة وكفاءة إنتاجها توليد 35 S المسمى (نصف عمر 87 يوما) البروتينات باستخدام المتاحة تجاريا في المختبر، إلى جانب مجموعات النسخ الترجمة: ملاحظة. من المهم أن البروتين ترجمتها هو المسمى بما فيه الكفاية بحيث التغييرات في دوران البروتين يمكن تصور بسهولة.
    2. لتأكيد radiolabeling ناجحة، نفذ SDS-PAGE/autoradiography مع 0.5 ميكرولتر من البروتين ترجمتها. قياس كثافة رديولبلد الفرقة β-catenin باستخدام يماغيج، ImageQuant، أو بديلا الكمي الحديثة اضافة بالصور البرمجياتأنا. ملاحظة: يجب أن يكون رديولبلد β-catenin الفرقة البروتين واضحة للعيان على الفيلم في غضون ساعات قليلة (4-6 ساعة).
    3. الأداة الإضافية تجميد البروتين رديولبلد في النيتروجين السائل لتخزين حتى الاستخدام. ملاحظة: التخزين لفترات طويلة (> 2 أشهر) ومتعددة تجميد / الذوبان (أكبر من 2) يمكن أن تؤثر بشدة على قدرة رديولبلد β-catenin أن تتحلل بقوة في القيطم استخراج البيض. عادة، واستقرار البروتينات رديولبلد ينخفض ​​بشكل ملحوظ بعد شهر 1 من التخزين في -80 درجة مئوية؛ وبالتالي، طازجة نسبيا رديولبلد β-catenin يعطي أفضل النتائج في هذه المقايسات تدهور.
  2. أداء β-catenin تدهور الفحص
    1. إضافة 1-3 ميكرولتر (اعتمادا على قوة الإشارة الفرقة رديولبلد) في المختبر ترجمة-β-catenin (وغيرها من البروتينات، والجزيئات الصغيرة، الخ. التي يجري اختبارها) في 20 ميكرولتر من مزيج القيطم رد فعل على الجليد. مزيج دقيق من قبل وجه السرعهذ عبها الأنبوب ونبضة قصيرة من vortexing ل؛ هذا هو خطوة هامة كما القيطم استخراج البيض هو لزج جدا، وسوف تؤثر على خلط غير مكتملة اتساق النتائج. نبض تدور ومكان على الجليد.
    2. بدء تدهور رد فعل β-catenin عن طريق تحويل أنابيب لRT.
    3. في نقطة زمنية معينة، وإزالة 1-5 مل من العينة وخلط فورا مع SDS عينة العازلة (حجم 5X) لوقف رد الفعل. للتأكد من إنهاء رد فعل تدهور تماما، أنبوب نفض الغبار عدة مرات ودوامة بقوة.
    4. أداء SDS-PAGE/autoradiography. تشغيل 1 مل حكمه (~ 50 ملغ من البروتين) من استخراج كل مرة لنقطة / حارة. يجب أن يتضح تدهور β-catenin في القيطم استخراج البيض من الانخفاض تعتمد على الوقت في شدة رديولبلد β-catenin الفرقة الشكل 2. القياس الكمي النتائج باستخدام يماغيج، ImageQuant، أو غيرها من برامج التصوير المفضل إذا لزم الأمر.
    5. (الأمثلاونال) نقع هلام SDS-بولكرلميد في تحديد الحل (حامض الخليك 10٪ و 30٪ الميثانول في الماء المقطر) قبل التجفيف لخفض النشاط الإشعاعي الخلفية وزيادة جودة الصورة.

4. β-catenin luciferase المراسل تدهور الفحص في القيطم استخراج البيض

تنفيذ جميع الخطوات على الجليد ما لم يرد خلاف ذلك.

  1. إعداد β-catenin-luciferase المراسل
    1. توليف غير رديولبلد، الموسومة luciferase المراسل β-catenin باستخدام جانب نظام النسخ الترجمة كاملة مع مزيج من الأحماض الأمينية.
    2. تأكيد إنتاج الموسومة luciferase المراسل β-catenin عن طريق قياس luciferase النشاط 0،5-1 ميكرولتر من رد الفعل. تقييم التلألؤ الخلفية عن طريق قياس التلألؤ من مزيج رد فعل غير مترجمة. ملاحظة: هي مجموعات تجارية متعددة متاحة لقياس luciferase النشاط. التلألؤ طويلة الأجل، ومع ذلك، يعمل بشكل جيد لا سيما بالنسبة لتدهور أساذ.
  2. أداء β-catenin-luciferase المراسل تدهور الفحص
    1. ذوبان الجليد وإعداد القيطم استخراج البيض كما في 2.2.
    2. إضافة في المختبر المترجمة β-catenin-luciferase المراسل الانصهار (من 4.1) في إعداد القيطم مزيج التفاعل (من 2.2) على الجليد وتخلط جيدا كما هو الحال في 3.2.1. ملاحظة: نشاط luciferase المراسل β-catenin التي يتم إضافتها إلى استخراج عادة بين 20 - 50،000 وحدة التلألؤ النسبي (RLU) / مل من مستخلص (على أساس القياسات التي تم الحصول عليها من 4.1.2). يجب أن تكون إشارة البدء حوالي 100،000 RLU (2-5 مل من المختبر ترجمة-β-catenin luciferase المراسل الانصهار في).
    3. تحويل لاستخراج RT لبدء رد فعل تدهور.
    4. إزالة قسامة من رد فعل في الوقت المشار إليه والمفاجئة التجميد في النيتروجين السائل. ملاحظة: عادة ما يتم إزالة عينات للتحليل ثلاث نسخ عن كل نقطة زمنية. ويمكن تخزين استخراج المجمدة في -80 ° C الاتحاد الوطني للعمالايل انهم مستعدون لتحليلها.
    5. عينات ذوبان الجليد، ونقل العينات إلى اللون الأبيض القياسية لوحات 96 جيدا على الجليد، وعملية luciferase النشاط.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويرد التخطيطي للتدهور β-catenin في القيطم استخراج البيض في الشكل 2A. وقد حضنت 35 S-β-وصفت catenin في القيطم استخراج البيض، وأزيلت مأخوذة (1 مل ​​استخراج ما يعادلها) في الأوقات المناسبة، وتعرض عينات ل SDS-PAGE تليها تصوير الإشعاع الذاتي. وتوسط تدهور β-catenin بواسطة مكونات من مسار WNT من قبل النظام اليوبيكويتين-proteasome و2، وتحول دون تدهور [35 S]-β-رديولبلد catenin في استخراج القيطم بإضافة المانع proteasome وMG132 الشكل 2B. تدهور β-catenin بواسطة مكونات من مسار WNT تعتمد على الفسفرة من خلال GSK3 34. تدهور تعتمد على GSK3 يمكن البرهنة بسهولة بطرق متعددة باستخدام القيطم استخراج البيض: 1)-β catenin (SA) متحولة (مواقع GSK3 الفسفرة تحور إلى alanines) واستقرت في كرهالقيح البيض استخراج نسبة إلى البرية من نوع البروتين β-catenin الشكل 2B. 2) مثبطات جزيء صغير من GSK3 (LiCl) تمنع بالمثل تدهور β-catenin (الشكل 2C). 3) وأخيرا، ونضوب GSK3 من القيطم استخراج البيض يمنع تدهور β-catenin؛ تدهور يمكن انقاذ بإضافة الخارجية GSK3 أرقام 2D-E.

يوفر رديولبلد β-catenin تدهور فحص تقييم البصرية بالمعلومات وخصوصا من الوضع في التدهور (أي تدهور اليوبيكويتين بوساطة مقابل الانقسام أفكارك). تصوير الإشعاع الذاتي، ومع ذلك، هو العمل المكثف، وبالنسبة للجزء الأكبر، محدودة للتحليل الإنتاجية العالية من المسارات (على سبيل المثال، الكشف عن جهري جزيء صغير من مسار WNT). تدهور فحص β-catenin-luciferase المراسل هو أكثر بسهولة وبسرعة قابلة للقياس الكمي وكمية من التألق المنبعث هو يتناسب طرديا مع صباحاount من البروتين β-catenin-luciferase المراسل. هذه الميزة يجعل مقايسة luciferase المراسل بسيطة وقابلة للتكيف بسهولة لفحوصات عالية الإنتاجية.

فمن المهم لتحديد أن الانصهار luciferase المراسل له خصائص مماثلة كما ان من البروتين nonfusion. وهذا يمكن أن تحدد تجريبيا عن طريق دمج البروتين luciferase المراسل إلى N-محطة، محطة C-، أو داخليا. اندماج luciferase المراسل إلى N-أو C-محطة من β-catenin لا يؤثر قدرتها على تنشيط الجينات المستهدفة WNT ذات ثقافة خلايا الثدييات أو معدل دوران في القيطم استخراج البيض 2، 19، 20.

ويرد ممثل β-catenin-luciferase المراسل تدهور في مقايسة القيطم استخراج البيض في الشكل 3A التي تم تقييم تدهور β-catenin-luciferase المراسل بواسطة SDS-PAGE/autoradiography من البروتين وluciferase المراسل النشاط رديولبلد من الانصهار. معدل degradatioن من β-catenin-luciferase المراسل مشابهة للمعلم البروتين β-catenin. تنظيم تدهور للانصهار β-catenin-luciferase المراسل هو أساسا مطابقة لهذا البروتين كما nonfusion إضافة LiCl أو استنزاف GSK3 أدى إلى تثبيط β-catenin luciferase المراسل دوران. كما هو مبين في أرقام 3B-C، والتغييرات في إشارة المشعة من البروتين β-catenin-luciferase المراسل يوازي تغيرات في النشاط الأنزيمي luciferase المراسل مع مرور الوقت. وهي القضية التي تنشأ من استخدام β-catenin-luciferase المراسل (وخاصة البروتين الانصهار ولدت من نظام النسخ الترجمة في المختبر) هو إشارة luciferase المراسل الخلفية الناجمة عن استخدام مواقع بداية متعدية الداخلية أو إنهاء متعدية المبكرة الشكل 3D. يمكن أحيانا التغلب على هذه المشكلة عن طريق الاستفادة المثلى من تركيز الحمض النووي المستخدمة في رد فعل IVT. لم نكن، ومع ذلك، نلاحظ انخفاضا في الخلفية luciferase النشاط عندما كنا تباينتتركيز الحمض النووي البلازميد لدينا خاصة بناء β-catenin-luciferase المراسل. فمن المحتمل أننا سوف تحتاج إلى إعادة هندسة البروتين الانصهار عبر الطفرات من أجل مزيد من تقليل المواقع بداية متعدية الداخلية و / أو إنهاء متعدية المبكرة للβ-catenin-luciferase المراسل البروتين الانصهار. لأن البروتين luciferase المراسل مستقرة إلى حد ما على مدار الساعة للتفاعل تدهور في القيطم البيض استخراج الشكل 3A، ولكن هذا إشارة الخلفية يمكن طرح ببساطة إذا كانت نسبة البروتين luciferase المراسل اقتطاع إلى كامل طول β-catenin الانصهار هو معروف .

إحدى نقاط القوة للمقايسة luciferase المراسل هو القدرة على توسيع نطاق إلى تنسيق متعددة جيدا أن يسمح لأداء الفرز الفائق الإنتاجية للجهري من تدهور β-catenin. في الشكل 4، يظهر تحليل الشطرنج ممثل باستخدام المانع من تدهور β-catenin، MG132، الذي يثبط proteasome و. نتيجة التجربة الشطرنج يشير إلى أن الاختبار هو موحدة وقابلة للتكرار في شكل 96 جيدا ويوضح مدى ملاءمتها لالفرز الفائق الإنتاجية.

الشكل 1
الشكل 1. تمثيل التخطيطي للإعداد المركزة القيطم استخراج البيض. يتم جمع البيض من حقن HCG القيطم المورق الإناث، ضغط مع السرعة المنخفضة (400 x ج) زيادة ونقصان، وسحقت وفصل مع متوسطة السرعة (15،000 XG ) زيادة ونقصان. الحرص على حقن تحت الجلد في الكيس الظهري الليمفاوية، وإزالة البيض سيئة بعناية، وفصل بعناية استخراج حشوية عالية الجودة من أقل جودة استخراج أكثر قتامة كما ورد في النص.

igure 2 "FO: محتوى العرض =" 5IN "FO: SRC =" / files/ftp_upload/51425/51425fig2highres.jpg "سرك =" / files/ftp_upload/51425/51425fig2.jpg "/>
الشكل 2. β-catenin يحط بقوة عندما حضنت في القيطم استخراج البيض. A) والتخطيطي لفحص التدهور. B) [35 S] المسمى β-catenin عن رد فعل IVT أعد يحط بقوة عندما حضنت في القيطم استخراج البيض. إضافة MG132 (200 ميكرومتر) لاستخراج البيض القيطم يمنع تدهور β-catenin. طفرة لalanines من phosphosites GSK3 داخل β-catenin (β-catenin SA) أو إضافة LiCl (25 ملم) C) يمنع تدهور β-catenin. D) الموقع GSK3 ملزمة من Axin (الأحماض الأمينية 506-560) يستنزف بكفاءة GSK3 من القيطم استخراج البيض. E)-المنضب GSK3 القيطم استخراج البيض يمنع تدهور β-catenin ويمكن انقاذهم من قبل بالإضافة سو GSK3 المؤتلف (0.1 ملغ / مل). إضافة LiCl (25 ملم) كتل قدرة GSK3 المؤتلف لإنقاذ تدهور β-catenin في المنضب GSK3 استخراج. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

الرقم 3
الرقم 3. يحط الموسومة luciferase المراسل β-catenin عندما حضنت في القيطم استخراج البيض. يحط A) رديولبلد β-catenin-luciferase المراسل بمعدل مماثلة لتلك التي لازال البروتين β-catenin. كما هو الحال مع البروتين من النوع البري، إضافة LiCl (25 ملم) يمنع β-catenin luciferase المراسل تدهور. luciferase المراسل وحده لا يتحول بشكل ملحوظ في أكثر من القيطم استخراج البيض. التغييرات في luciferase النشاط من β-catenin-إبليسبورصة عمان الانصهار موازية التغييرات في مستويات البروتين. B) إضافة LiCl (25 ملم) أو استنزاف GSK3 C) يمنع β-catenin luciferase المراسل دوران وفقا لتقييم قياس luciferase النشاط. D) Immunoblotting لفي المختبر ترجمة β-catenin- luciferase المراسل (باستخدام الأجسام المضادة لمكافحة luciferase المراسل) كشفت كميات كبيرة من البروتين luciferase المراسل الحر في بعض محضرات أن يساهم المرجح أن الخلفية أعلى بالمقارنة مع تدهور فحص رديولبلد. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

الرقم 4
الشكل 4. للتنظيم تدهور β-catenin-luciferase المراسل في استخراج القيطم يمكن تكييفها لشكل الإنتاجية العالية. تحليل الشطرنج ممثل لβ-catenin-luciferase المراسل باستخدام MG132 (450 ميكرومتر) مثل مثبط للتدهور β-catenin. الأعمدة المظللة تشير الآبار MG132 المعاملة، وأخف وزنا أعمدة تمثل السيارة الآبار (DMSO) المعاملة. الكمي وZ عامل نتيجة حسابية في النتيجة من 0.3 مما يشير إلى أن الفحص مقبولة لاستخدامها المحتمل في الفرز الفائق الإنتاجية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

القيطم استخراج البيض هو نظام البيوكيميائية قوية للتحقيق في دوران β-catenin. تركيز β-catenin في القيطم استخراج البيض هو ~ 25 نانومتر 2. تحت الظروف المثلى، واستخراج البيض قادر على المهينة β-catenin بمعدل 50-100 نانومتر / ساعة ونصف القصوى، في 200 نانومتر 24. وهناك العديد من الخطوات الحاسمة لإعادة الناجح لتدهور β-catenin باستخدام القيطم استخراج البيض. وتشمل هذه 1) توليد عالية الجودة القيطم استخراج البيض والطريقة التي يتم من خلالها إعداد استخراج البيض، 2) توليد نوعية رديولبلد β-β-catenin وcatenin-luciferase المراسل بروتين، 3) تحسين ظروف التفاعل لدعم تدهور β-catenin، و 4 ) تجهيز السليم للوقت رد الفعل نقطة.

A إعداد ذات جودة عالية من القيطم استخراج البيض الذي يتحلل β-catenin بقوة يعتمد على كل من نوعية الالبيض الإلكترونية وكيف يتم التعامل مع البيض قبل الخطوة سحق وكذلك كيف يتم طرد استخراج لاحقا للحصول على استخراج النهائي. كما ورد في البروتوكول، فمن المهم التأكد من أن البيض عالية الجودة فقط (يتضح من تناقض حاد بين نصف الكرة الحيوان الظلام ونصف الكرة نباتية ضوء) تستخدم، أن تتم إزالة البيض نوعية رديئة (نفث مفتول العضلات، مرقش، أو أبيض) في جميع أنحاء هذه العملية، التي يتم الاحتفاظ البيض في درجة حرارة معتدلة (16 درجة مئوية) في جميع أنحاء الداخلي، والتي يتم تنفيذ الإجراء في أسرع وقت ممكن. فمن المهم عدم التضحية بالنوعية من أجل استخراج كمية. بالإضافة إلى ذلك، كما ذكرنا سابقا، والبيض من الضفادع التي تبيض نوعية رديئة (> 10٪) يجب التخلص تماما.

استخراج المذكورة أعلاه هو تعديل من الانقسام الاختزالي II-CSF القبض استخراج 11. إعداد القيطم استخراج البيض لتدهور β-catenin (استخراج سرعة متوسطة) فرقالمتطلبات البيئية من مقتطفات الكلاسيكية التي أعدت لدراسة دورة الخلية 30-32، والتي هي السرعة المنخفضة أو العالية السرعة مقتطفات 35. التكيف القيطم استخراج البيض لتدهور الأمثل للبروتينات أخرى قد تتطلب تغيير سرعة الطرد المركزي وعدد من يدور. استخراج منخفضة السرعة يحتوي على عضيات سليمة والمكونات الخلوية الكبيرة الأخرى. وبالتالي، سوف يدور أعلى سرعة تغيير تكوين استخراج ويحتمل أن تكون إزالة مكونات المثبطة و / أو الأساسية التي من شأنها أن تؤثر على تدهور البروتين من الفائدة. هو الأمثل لإعداد وسيطة استخراج سرعة الموصوفة هنا لتدهور β-catenin بواسطة مكونات من مسار WNT. يمكن الغزل استخراج أكبر من 4X يقلل كثيرا من قدرة استخراج أن تتحلل β-catenin (على الرغم من أنه له تأثير ضئيل على تدهور عنصر WNT آخر، Axin). β-catenin هو عرضة للالتحلل البروتيني بوساطة كاسباس في السرعة المنخفضة تدور استخراج ولا NOTICتتحلل eably في السرعة العالية تدور استخراج. وبالتالي، فمن المرجح أن مستخلصات مختلفة السرعة ستكون الأمثل لتدهور مكونات مسارات الإشارات الأخرى.

جيل 35 S-β-β-catenin وcatenin-luciferase المراسل يمكن تنفيذها باستخدام عدد من مجموعات المتاحة تجاريا. إنتاج البروتين باستخدام نظم إلى جانب النسخ الترجمة تعتمد بشكل كبير على نوعية البلازميد: نقي للغاية ميدي الاستعدادات من البلازميدات تعمل على نحو أفضل وأكثر موثوقية مقارنة الحمض النووي مصغرة الاستعدادات. لradiolabeling β-catenin، التي تم الحصول عليها حديثا [35 S] ميثيونين أو translabel ([35 S] ميثيونين زائد [35 S] السيستين) هو المفضل. نلاحظ أن الميثيونين والسيستين حد سواء لديهم ميل لأكسدة مع التخزين لفترات طويلة مما يقلل إدماجها في β-catenin في النسخ الترجمة رد فعل في المختبر جانب. بسبب التخزين لفترات طويلة ومتكررة تجميد ذوبان الجليديمكن أن تمنع تدهور دورات، يتم إعداد كميات صغيرة من رديولبلد β-catenin في وقت وتستخدم بعد فترة وجيزة.

كمية البروتين ترجمتها وعدد methionines في البروتين تحديد قوة الإشارة رديولبلد. لβ-catenin، ينبغي أن يكون هناك أي مشاكل في الحصول على إشارات المشعة قوية لفحوصات تدهور. لبروتينات مع عدد قليل methionines و / أو التي لا تترجم جيدا، وميثيونين و[35 S] [35 S] السيستين مزيج يمكن استخدامها بدلا من [35 S] ميثيونين و / أو إضافة علامة حاتمة (MYC) الذي يحتوي على عدة methionines. على الرغم من النجاح مع مختلف البلازميدات التعبير التي تحتوي على المروجين فج المناسب (T7، T3، وSP6) ويمكن الحصول عليها في المختبر ردود الفعل النسخ، الترجمة، استنادا البلازميد pCS2-يعطي عموما أفضل النتائج. بالإضافة إلى ذلك، إشارة من البروتين يمكن في بعض الأحيان أن تترجم زيادة كبيرة عن طريق حذف الذاتية 5'UTR. أخيرا، لإجراء التجارب على نطاق واسع (على سبيل المثال، وفحص عالية الإنتاجية)، كمية كبيرة من المؤتلف β-catenin-luciferase المراسل قد تكون مطلوبة. β-catenin-luciferase المراسل من / نظام الفيروسة العصوية Sf9 يحط مع حركية مماثلة كما في البرية من نوع β-catenin في استخراج الأجنة القيطم و2. بدلا من ذلك، والغلة العالية في نظام التعبير المختبر استخدمت (مثل القمح القائم الجرثومية) بنجاح لالفرز الفائق الإنتاجية 19، 20.

من أجل قياس موثوق تدهور β-catenin في نظام استخراج، فمن المهم أن إشارة الأولية إما من رديولبلد β-catenin أو luciferase المراسل β-catenin الانصهار هو قوي بما فيه الكفاية. وبالتالي، قدرا من التحسين من قبل المجرب على حجم مقايسة تدهور، وعدد من النقاط الزمنية المطلوبة، وكفاءة في المختبر رد فعل الترجمة وايليرة لبنانية تكون مطلوبة. عند تجميع رد فعل تدهور، وهناك عدة خطوات يمكن للمرء أن تتخذ لتعزيز فرص الحصول على تدهور قوية. أولا، يجب إذابة كل الكواشف بسرعة ووضعها على الجليد قبل الذوبان الكامل. لأن تدهور β-catenin هو غاية تعتمد الطاقة، فمن المهم أن ER هو جديد نسبيا. ثانيا، القيطم استخراج البيض هو لزجة، وأنه من الأهمية بمكان أن يتم خلط رد فعل جيدا بعد إضافة الانصهار β-catenin/β-catenin-luciferase رديولبلد، ER، والبروتين، جهري جزيء صغير، الخ ثالثا، قبل احتضان رد الفعل خلط لمدة 20-30 دقيقة على الجليد يعطي نتائج أكثر استنساخه عند اختبار آثار جهري جزيء صغير.

القدرة على استنزاف البروتينات من القيطم استخراج البيض يمثل أداة قوية لتقييم وظيفة البروتين والآثار التي تعتمد على تركيزهم. كمثال على ذلك، علينا أن نبرهن على المستنفدة GSK3 من اكسnopus استخراج كتل البيض تدهور β-catenin، مما يدل على الدور الهام للGSK3 في دوران β-catenin. سوف تحتاج إلى أن تحدد تجريبيا لمختلف البروتينات ظروف نضوب مختلفة. على سبيل المثال، سوف البروتينات وفيرة تتطلب زيادة في كمية من الأجسام المضادة أو تقارب الخرز يجند استخدامها لتحقيق استنفاد كامل. وهناك نقطة انطلاق جيدة لاستخدام الخرز معبأة في 1/10 من حجم استخراج من أجل تقليل استخراج التخفيف. بالإضافة إلى قوة ملزمة ليجند الضد / تقارب للبروتين الهدف، نوع من الخرز (على سبيل المثال، sepharose و، الاغاروز، أو المغناطيسي) المستخدمة قد تؤثر على كفاءة استنزاف البروتين من البيض القيطم استخراج 36. أخيرا، سيكون من المثالي لتحليل مدى نضوب (عادة عن طريق immunoblotting). بمجرد الانتهاء من رد الفعل β-catenin، والطريقة التي يتم من خلالها معالجة العينات يمكن أن تؤثر بشكل كبير على نتائج التجربة. تركيزالقيطم البيض استخراج محضرات إعدادها بالطريقة الموصوفة هي 52.41 ملغ / مل ± 5.40 ملغ / مل، وأنه من المهم ألا تفرط في قدرة هلام SDS-PAGE؛ هذه ليست مشكلة مع مقايسة luciferase المراسل-β-catenin. وهكذا، على كل نقطة زمنية، أي أكثر من 1 مل يعادل استخراج ينبغي تحميلها في كل حارة من هلام SDS-PAGE. لمزيد من تحسين نوعية النتائج، فإن الخطوة التثبيت هلام (اختياري) خفض النشاط الإشعاعي الخلفية وزيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء. للمقايسة luciferase المراسل، انخفاضا من إشارة الأولي من 100،000 RLU في القيطم استخراج البيض يعكس بأمانة تغيير في مستويات البروتين من β-catenin-luciferase المراسل البروتين الانصهار.

يمثل القيطم البيض استخراج النظام نظام جذابة لدراسة تنظيم تدهور β-catenin. يسمح النظام لاستخراج مراقبة دقيقة من تركيز البروتينات الفردية عن طريق استنزاف وreconstitu نشوئها. القدرة على رصد آثارها على حركية دوران β-catenin مع مرور الوقت يسمح لفهم أفضل لآلية البيوكيميائية من هذه الخطوة الحاسمة في WNT نقل الإشارة. وقد وفرت هذه التلاعبات نظرة عميقة في التفاعلات الجزيئية المعقدة بين مكونات مسار WNT وكانت حاسمة لتطوير النموذج الرياضي الأول من مسار WNT 24. التحذير واحد هو أن تركيزات مكونات مسار WNT في القيطم استخراج البيض ولست] خلايا الثدييات وقد وجد أن تختلف، وربما يعكس الاختلافات في الطريقة التي يتم بها تنظيم مسار WNT خلال مرحلة التطور الجنيني مقابل الوضع الكبار 37. القدرة على القيام بها، على أساس المقايسات luciferase المراسل كلا المشعة والأنزيمية باستخدام القيطم استخراج البيض يوفر أضاف الأدوات النوعية والنوعية التكميلية قوية لدراسة تنظيم البيوكيميائية من تدهور β-catenin.

ر "> وبالإضافة إلى رصد دوران β-catenin، تدهور منظم WNT السلبية، Axin، يمكن رصدها في القيطم استخراج البيض إما بروتين رديولبلد أو الانصهار لluciferase المراسل. عن طريق البديل من luciferase المراسل، Renilla، تنصهر ل Axin، تم تكييفها سابقا لتدهور مقايسة luciferase المراسل إلى تنسيق الإنتاجية العالية إلى الشاشة في وقت واحد لاثنين من البروتينات جهري من مسار WNT، β-catenin وAxin 19، 20. حددت هذه الشاشة البيوكيميائية وافقت ادارة الاغذية والعقاقير المخدرات، بيرفينيوم أن زيادة و انخفض معدل تدهور β-catenin وAxin، على التوالي، في القيطم استخراج البيض 19. تم التحقق من صحة بيرفينيوم في وقت لاحق في الخلايا البشرية المستزرعة ونموذج في الكائنات المختلفة (على سبيل المثال، القيطم وC. ايليجانس) كمانع جزيء صغير من WNT الكنسي المسار. وباختصار، فإن القيطم البيض استخراج النظام هو تنوعا البيوكيميائية ثا النظامر يمكن استغلالها في العديد من الطرق لدراسة آلية إشارات Wnt فضلا عن تحديد جهري جزيء صغير من مسار WNT. طريقة البيوكيميائية الموصوفة هنا يمكن تطبيقها على مسارات الإشارات الأخرى التي تدهور البروتين قد تلعب دورا حاسما.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Acknowledgments

نشكر لوري لي لقراءة نقدية للمخطوطة. معتمد من قبل TWC دكتوراه مسبقا زمالة جمعية القلب الأمريكية (12PRE6590007). ويدعم MRB من منحة تدريب المعهد الوطني للسرطان (T32 CA119925). ويدعم SSH من قبل المعاهد الوطنية للصحة (R01DK078640). ويدعم EL من قبل المعاهد الوطنية للصحة (R01GM081635 وR01GM103926).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) ProSpec hor-272-A Reconstituted with distilled water before use. 
Human chorionic gonadotropin Sigma CG10-10VL
Potassium chloride Fisher BP366-1
Sodium chloride Research Products International S23020-5000.0
Magnesium chloride Fisher BP214-500
Calcium chloride Acros Organics AC42352-5000
HEPES Fisher BP310-1
Cysteine Acros Organics AC17360-1000
Leupeptin Sigma L2884-10MG
Aprotinin Sigma A1153-10MG
Pepstatin Sigma P4265-5MG
Cytochalasin B Sigma C8273-10MG
3 ml syringe: Luer Lock tip Becton Dickinson 309657
27 G needle Becton Dickinson 305109
96 well solid white polystyrene microplate, round bottomed Corning 3605
Steady-Glo luciferase assay system Promega E2520 Store long-term at -80 °C, can store for up to 1 month at -20 °C
TNT Sp6 coupled reticulocyte lysate system Promega L4600
TNT Sp6 high-yield wheat germ protein expression system Promega L3260 Generally higher yield than reticulocyte lysate 
EasyTag Express protein labeling mix [S35] Perkin Elmer NEG772007MC
Creatine phosphate Sigma 27920-5G
ATP Sigma A2383-5G
Creatine phosphokinase Sigma C3755-35KU
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D8418-50ML
Dual-Glo luciferase assay system Promega E2920 Same storage conditions as Steady-Glo
50 ml Centrifuge tubes Fisher Scientific 0556214D
Sorvall SS-34 fixed angle rotor Thermo Scientific 28020
115 V 50/60 Hz Minicentrifuge Fisher Scientific 05-090-128
mMessage mMachine Sp6 kit Ambion AM1340
Anti-firefly luciferase antibody Abcam ab16466
Anti-GSK3 antibody BD Transduction Laboratories 610201
FLUOStar Optima BMG Labtech
Sorvall RC-6 Plus centrifuge Thermo Scientific
16 °C Incubator Percival Scientific

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Glotzer, M., Murray, A. W., Kirschner, M. W. Cyclin is degraded by the ubiquitin pathway. Nature. 349, 132-138 (1991).
  2. Salic, A., Lee, E., Mayer, L., Kirschner, M. W. Control of beta-catenin stability: reconstitution of the cytoplasmic steps of the wnt pathway in Xenopus egg extracts. Molecular Cell. 5, 523-532 (2000).
  3. Murray, A. W. Cell cycle extracts. Methods in cell biology. 36, 581-605 (1991).
  4. Dabauvalle, M. C., Scheer, U. Assembly of nuclear pore complexes in Xenopus egg extract. Biology of the cell / under the auspices of the European Cell Biology Organization. 72, 25-29 (1991).
  5. Tutter, A. V., Walter, J. C. Chromosomal DNA replication in a soluble cell-free system derived from Xenopus eggs. Methods Mol Biol. 322, 121-137 (2006).
  6. Theriot, J. A., Rosenblatt, J., Portnoy, D. A., Goldschmidt-Clermont, P. J., Mitchison, T. J. Involvement of profilin in the actin-based motility of L. monocytogenes in cells and in cell-free extracts. Cell. 76, 505-517 (1994).
  7. Maresca, T. J., Heald, R. Methods for studying spindle assembly and chromosome condensation in Xenopus egg extracts. Methods Mol Biol. 322, 459-474 (2006).
  8. Shennan, K. I. Xenopus egg extracts: a model system to study proprotein convertases. Methods Mol Biol. 322, 199-212 (2006).
  9. Kornbluth, S., Yang, J., Powers, M. Analysis of the cell cycle using Xenopus egg extracts. Current protocols in cell biology / editorial board, Juan S. Bonifacino ... [et al.]. 11, (2006).
  10. Chan, R. C., Forbes, D. I. In vitro study of nuclear assembly and nuclear import using Xenopus egg extracts. Methods Mol Biol. 322, 289-300 (2006).
  11. Masui, Y., Markert, C. L. Cytoplasmic control of nuclear behavior during meiotic maturation of frog oocytes. The Journal of experimental zoology. 177, 129-145 (1971).
  12. Forbes, D. J., Kirschner, M. W., Newport, J. W. Spontaneous formation of nucleus-like structures around bacteriophage DNA microinjected into Xenopus eggs. Cell. 34, 13-23 (1983).
  13. Lohka, M. J., Masui, Y. Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components. Science. 220, 719-721 (1983).
  14. Newport, J. W., Kirschner, M. W. Regulation of the cell cycle during early Xenopus development. Cell. 37, 731-742 (1984).
  15. Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312, 237-242 (1984).
  16. Blow, J. J., Laskey, R. A. Initiation of DNA replication in nuclei and purified DNA by a cell-free extract of Xenopus eggs. Cell. 47, 577-587 (1986).
  17. Verma, R., et al. Ubistatins inhibit proteasome-dependent degradation by binding the ubiquitin chain. Science. 306, 117-120 (2004).
  18. Yu, H., King, R. W., Peters, J. M., Kirschner, M. W. Identification of a novel ubiquitin-conjugating enzyme involved in mitotic cyclin degradation. Curr Biol. 6, 455-466 (1996).
  19. Thorne, C. A., et al. Small-molecule inhibition of Wnt signaling through activation of casein kinase 1alpha. Nature Chemical Biology. 6, 829-836 (2010).
  20. Thorne, C. A., et al. A biochemical screen for identification of small-molecule regulators of the Wnt pathway using Xenopus egg extracts. Journal of Biomolecular Screening. 16, 995-1006 (2011).
  21. Hinkson, I. V., Elias, J. E. The dynamic state of protein turnover: It's about time. Trends in Cell Biology. 21, 293-303 (2011).
  22. Kinzler, K. W., Vogelstein, B. Lessons from Hereditary Colorectal Cancer. Cell. 87, 159-170 (1996).
  23. Lee, E., Salic, A., Kirschner, M. W. Physiological regulation of [beta]-catenin stability by Tcf3 and CK1epsilon. J Cell Biol. 154, 983-993 (2001).
  24. Lee, E., Salic, A., Krüger, R., Heinrich, R., Kirschner, M. W. The roles of APC and Axin derived from experimental and theoretical analysis of the Wnt pathway. PLoS Biology. 1, (2003).
  25. Seeling, J. M., et al. Regulation of beta-catenin signaling by the B56 subunit of protein phosphatase 2A. Science. 283, 2089-2091 (1999).
  26. Guger, K. A., Gumbiner, B. M. beta-Catenin has Wnt-like activity and mimics the Nieuwkoop signaling center in Xenopus dorsal-ventral patterning. Dev Biol. 172, 115-125 (1995).
  27. Cselenyi, C. S., et al. LRP6 transduces a canonical Wnt signal independently of Axin degradation by inhibiting GSK3's phosphorylation of β-catenin. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 8032-8037 (2008).
  28. Jernigan, K. K., et al. Gbetagamma activates GSK3 to promote LRP6-mediated beta-catenin transcriptional activity. Science Signaling. 3, (2010).
  29. Major, M. B., et al. Wilms tumor suppressor WTX negatively regulates WNT/beta-catenin signaling. Science. 316, 1043-1046 (2007).
  30. Cross, M. K., Powers, M. Obtaining eggs from Xenopus laevis females. J Vis Exp. , (2008).
  31. Cross, M. K., Powers, M. Preparation and fractionation of Xenopus laevis egg extracts. J Vis Exp. , (2008).
  32. Willis, J., DeStephanis, D., Patel, Y., Gowda, V., Yan, S. Study of the DNA damage checkpoint using Xenopus egg extracts. J Vis Exp. , (2012).
  33. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus Laevis : A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
  34. Rubinfeld, B., et al. Binding of GSK3β to the APC-β-Catenin Complex and Regulation of Complex Assembly. Science. 272, 1023-1026 (1996).
  35. Salic, A., King, R. W. Identifying small molecule inhibitors of the ubiquitin-proteasome pathway in Xenopus egg extracts. Methods in Enzymology. 399, 567-585 (2005).
  36. Trinkle-Mulcahy, L., et al. Identifying specific protein interaction partners using quantitative mass spectrometry and bead proteomes. J Cell Biol. 183, 223-239 (2008).
  37. Tan, C. W., et al. Wnt signalling pathway parameters for mammalian cells. PLoS One. 7, (2012).

Tags

علم الأحياء الجزيئية، العدد 88،
إعادة تشكيل β-catenin تدهور في<em&gt; القيطم</em&gt; مستخلصات البيض
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, T. W., Broadus, M. R.,More

Chen, T. W., Broadus, M. R., Huppert, S. S., Lee, E. Reconstitution Of β-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract. J. Vis. Exp. (88), e51425, doi:10.3791/51425 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter