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Biology

Reconstitution de β-caténine dégradation dans Published: June 17, 2014 doi: 10.3791/51425
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1,3
1Department of Cell and Developmental Biology and Program in Developmental Biology, Vanderbilt University Medical Center, 2Division of Gastroenterology, Hepatology & Nutrition and Division of Developmental Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 3Vanderbilt Ingram Cancer Center, Vanderbilt University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Un procédé est décrit pour l'analyse de la dégradation des protéines en utilisant des protéines radiomarquées et la luciférase-fusion dans Xenopus extrait d'oeufs et de son adaptation pour le criblage à haut débit pour les petites molécules modulateurs de la dégradation des protéines.

Abstract

Xenopus extrait d'oeufs de laevis est un système robuste et bien caractérisés pour étudier la biochimie de divers processus cellulaires. Xenopus extrait d'œuf a été utilisé pour étudier le renouvellement des protéines dans de nombreux contextes cellulaires, y compris le cycle cellulaire et la transduction du signal des voies 1-3. Le présent mémoire, on décrit un procédé pour isoler l'extrait d'oeuf de Xénope qui a été optimisé pour favoriser la dégradation de la protéine de la voie Wnt critique, β-caténine. Deux méthodes différentes sont décrites pour évaluer β-caténine la dégradation des protéines dans Xenopus extrait d'oeufs. Une méthode est visuellement informatif ([35 S] radiomarqué protéines), tandis que l'autre est plus facilement mis à l'échelle pour les essais à haut débit (luciole protéines de fusion luciférase marqués). Les techniques décrites peuvent être utilisés, mais ne sont pas limités à, d'évaluer β-caténine renouvellement des protéines et identifier les composants moléculaires qui contribuent à son chiffre d'affaires. En outre, la capalité de purifier de grands volumes de homogène extrait d'oeufs de Xénope combinée à la lecture facile et quantitative des protéines de la luciférase à marquage de ce système permet d'être facilement adaptée pour le criblage à haut débit pour des modulateurs de la dégradation de β-caténine.

Introduction

Xenopus laevis extrait d'oeufs a été largement utilisée pour étudier de nombreux processus biologiques cellulaires, y compris la dynamique du cytosquelette, l'assemblage nucléaire et l'importation, l'apoptose, le métabolisme de l'ubiquitine, la progression du cycle cellulaire, la transduction du signal, et le renouvellement des protéines 1-17. Le système d'extraction d'oeufs de Xenopus se prête à l'analyse biochimique d'une légion de processus cellulaires parce extrait d'oeufs représente essentiellement cytoplasme non dilué qui contient tous les composants cytoplasmiques essentielles nécessaires à l'exécution de ces processus et de permettre l'enquête. De grandes quantités d'extrait d'œufs peuvent être préparés en même temps pour des manipulations biochimiques qui nécessitent de grandes quantités de matière (par exemple, la purification des protéines ou criblage à haut débit) 18-20. Un autre avantage est que la concentration de protéines spécifiques dans des œufs de Xenopus extrait peut être ajustée avec précision par l'addition de protéine et / ou recombinant immunodéplétion de EndoGprotéines tones, par opposition à la transfection d'ADN plasmidique, où l'expression de la protéine d'intérêt est difficile à contrôler. En outre, le manque de protéines recombinantes disponibles peut être surmonté par l'addition de transcrits codant pour la protéine d'intérêt, en profitant de grande capacité de l'extrait d'oeufs de Xénope fraîchement préparée de traduire l'ARNm ajoutées de manière exogène.

La régulation de la dégradation des protéines est essentielle pour le contrôle de plusieurs voies cellulaires et traite 21. Xenopus extrait d'oeufs a été largement utilisée pour étudier la dégradation des protéines que le système permet de multiples façons de surveiller le renouvellement des protéines sans facteurs de confusion de la transcription et de la traduction. La voie de signalisation Wnt est une voie de signalisation hautement conservée qui joue un rôle critique dans le développement et la maladie. Le chiffre d'affaires de β-caténine, le principal effecteur de la voie Wnt, est très réglementée, et une augmentation de l'état d'équilibre liveau de β-caténine est essentiel pour l'activation des gènes cibles de Wnt. L'importance de la dégradation de β-caténine est mis en évidence par le fait que des mutations dans la voie Wnt qui inhibent la dégradation de β-caténine trouvent dans ~ 90% des cas sporadiques de cancer colorectal 22. dégradation β-caténine par des composants de la voie Wnt peut être fidèlement récapitulé dans Xenopus extrait d'oeufs pour étudier le mécanisme de son chiffre d'affaires ainsi que pour identifier de nouveaux modulateurs à petites molécules de sa dégradation 2, 19, 20, 23-29.

Des procédés pour la préparation d'extrait d'oeufs de Xenopus pour l'étude du cycle cellulaire ont été décrits dans des publications antérieures JoVE 30-32. Le protocole actuel décrit une modification de ces méthodes, et est optimisé pour la dégradation de la [35S]-radiomarqué β-caténine et de la luciférase-marqué β-caténine dansExtrait d'oeufs de Xénope. Le dosage radio-marqué de dégradation permet la visualisation directe du taux de protéines par l'intermédiaire d'une autoradiographie. [35 S] méthionine est incorporé dans la protéine d'intérêt en utilisant une réaction de traduction in vitro qui peut alors être directement ajouté à une réaction de dégradation. En outre, le dosage de la rotation de la protéine radiomarquée ne nécessite pas un anticorps dirigé contre la protéine d'intérêt ou un marqueur d'épitope, ce qui peut influencer la stabilité de la protéine. Parce que même de petits changements dans les niveaux de protéines, dont témoignent des modifications de l'intensité de la bande de protéine radiomarquée, sont facilement visualisés par autoradiographie, la [35 S] radiomarqué essai de dégradation représente une méthode très utile pour la visualisation du chiffre d'affaires de la protéine 2.

Fusion de β-caténine de la luciférase de luciole (ci-après dénommé simplement "luciférase") permet des mesures quantitatives précises et faciles des niveaux de protéines, afinpour déterminer les propriétés cinétiques de la β-caténine roulement 19, 20. Un avantage majeur du dosage de la luciférase est qu'elle fournit un système quantitatif solide qui est facilement mis à l'échelle vers le haut. Le protocole suivant fournit des méthodes simples pour doser la dégradation β-caténine et une méthode robuste, efficace, et efficace pour le criblage à haut débit de nouveaux modulateurs β-caténine.

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Protocol

1. Préparation de l'extrait d'oeufs de Xenopus

REMARQUE: Chaque grenouille donne environ 1 ml d'extrait d'oeufs utilisable. Des extraits de 10 grenouilles sont typiquement préparés en une seule fois, et le volume de tampon décrite ci-dessous est destiné à effectuer une 10 grenouille Xenopus extrait d'oeufs prep. Le volume du tampon peut être ajusté en conséquence pour des préparations plus ou moins grandes de l'extrait d'œuf. Preps générés de cette manière fournissent constamment des concentrations de protéine de ≥ 50 mg / ml. Le processus de collecte des œufs et leur transformation en extrait est plus efficace lorsqu'elle est effectuée par deux personnes. (Pour les techniques de base de grenouille d'élevage, voir Sive et al. 33).

  1. Collection d'oeufs
    1. Pour amorcer les grenouilles, injectent chaque grenouille femelle avec 100 U de sérum de jument gravide gonadotrophine (PMSG) à partir d'un fraîchement 250 U / ml actions. Utiliser une seringue à tuberculine de 3 ml avec une aiguille 27 G pour injecter en sous-cutané, avec le biseau d'l'aiguille vers le haut, dans la lymphe sac dorsal, qui est situé à une distance d'environ 1 cm de la ligne médiane à partir des décolorations entaillées le long de la longueur des jambes de la grenouille.
    2. Magasin grenouilles apprêtées dans de l'eau (plus 20 mM de NaCl, voir Sive et al. 33) à 18 ° C pendant 5-10 jours. Pour les systèmes de stockage de l'eau stagnante, la densité des animaux est d'environ 4 L d'eau par grenouille femelle. NOTE: Le temps minimum requis pour l'amorçage prennent effet est de 5 jours, et les effets de l'amorçage usure au bout de 10 jours.
    3. Préparer modification Ringers (ROR) la solution de 0.5x Marc d'un MMR magasin 20x. 20x MMR est composée de chlorure de sodium 2 M, 40 mM de chlorure de potassium, 40 mM de chlorure de calcium, chlorure de magnésium 20 mM, et 100 mM de 4 - (2-hydroxyéthyl)-1-piperazineethanesulfonic acide (HEPES), pH 7,4.
    4. Mettre en place des seaux pour toutes les grenouilles injectées (un de grenouille par 4 L seau). REMARQUE: Bien que plus d'une grenouille peut être placé dans le même compartiment pour la collecte des œufs, si l'un des grenouillespond des œufs de qualité en majorité très pauvres, un effort important sera nécessaire pour séparer les pauvres des œufs de qualité de ceux qui sont appropriés pour la fabrication de l'extrait. Ainsi, en maximisant le nombre de grenouilles dans le même réservoir pour minimiser la quantité de tampon utilisé pour collecter oeuf ne vaut pas le risque.
    5. Injecter 750 U gonadotrophine chorionique humaine (HCG) dans le sac dorsal de la lymphe de chaque grenouille utilisant une aiguille 27 G comme indiqué au point 1.1.1.
    6. Placez chacun des grenouilles HCG-injecté dans différents seaux 4 L contenant 0,5 x ROR refroidie à 16 ° C.
    7. Placer les récipients avec les grenouilles dans un incubateur à 16 ° C pour recueillir les oeufs O / N (15-16 h). NOTE: Le maintien de la température adéquate est essentielle pour l'ensemble de la procédure, de la collecte des œufs à la préparation de l'extrait d'oeufs.
  2. Dejellying oeufs
    REMARQUE: Les oeufs sont recouverts d'une couche de gelée qui doit être enlevé avant d'extrait. La probabilité d'une lyse spontanée des oeufs augmente à mesure que le temps entrn ponte et extraire préparation augmente. Ainsi, il est important de procéder par les étapes suivantes le plus rapidement possible.
    1. Préparer 4 litres de 1x MMR, 50 ml de 0,1 x MMR, et 400 ml de 2% de cysteine, pH 7,7, réalisé dans de l'eau distillée. Maintenir toutes les solutions à 16 ° C.
    2. Pour expulser les oeufs supplémentaires, presser doucement le bas du dos et de l'abdomen de la grenouille.
    3. Retirez les grenouilles et la majeure partie de la MMR, de laisser les œufs dans environ 1-200 ml du vaccin ROR dans chaque seau.
    4. Enlever les débris avec une pipette de transfert, et d'évaluer la qualité des œufs: œufs de haute qualité sont généralement marquée par une séparation claire entre l'hémisphère animal pigmentation foncée et l'hémisphère végétatif légèrement coloré et avoir le contraste noir-lumière plus haut. Jeter avec une pipette de transfert des œufs qui apparaissent filandreuse, tacheté, ou lysées (blanc et gonflé) car ils diminuent la qualité globale de l'extrait. Si> 10% des œufs sont de mauvaise qualité, l'ensemblelot doit être jetée.
    5. Mélanger les œufs dans un bécher de 500 ml en verre et versez autant MMR possible tout en gardant les œufs immergés.
    6. Rincer les œufs par remuant doucement avec deux fois le volume de l'œuf du vaccin ROR. Répéter deux fois, et enlever tous les débris ou des œufs de qualité évidemment pauvres.
    7. Ajouter environ 100 ml de 2% cystéine dans le bécher de verre, agiter doucement pour mélanger, et permettent de régler les oeufs pendant 5 minutes à 16 ° C. Verser la cystéine. REMARQUE: Dejellying est marquée par l'apparition progressive de couches de gelée flottant au-dessus les œufs et l'emballage plus compact des œufs qu'elles occupent maintenant un plus petit volume sans la couche de gelée.
    8. Ajouter 100 ml de 2% cystéine, agiter doucement, attendre 5 min, puis versez lentement la cystéine. Répétez jusqu'à ce que les œufs sont devenus fortement compactés (généralement par le troisième traitement de la cystéine). Remarque: si des oeufs sont laissés trop longtemps dans la cystéine, elles sont sujettes à une lyse. De même, les œufs dejellied sont fragiles et sujettes à la lyse mécanique si ellestourbillonné sont trop vigoureusement ou si elles sont exposées à l'air. Une fois que les œufs ont été dejellied, il est important de procéder rapidement à des étapes de centrifugation.
    9. Verser la cystéine, et rincer la couche de gelée et autres débris en lavant délicatement les œufs en 1x ROR. Verser soigneusement tampon le long de la côté du bécher. Répéter deux fois ou jusqu'à ce que la solution MMR est plus trouble. Lors du rinçage avec 1x MMR continuent à enlever les mauvaises oeufs à l'aide d'une pipette de transfert.
    10. Effectuer un rinçage doux finale avec 30 ml 0,1 x ROR, et doucement videz autant de la mémoire tampon que possible. Encore une fois, enlever toute évidence œufs pourris.
  3. Emballage et Concassage oeufs par centrifugation
    NOTE: L'extrait décrit ci-dessous qui est utilisée pour la dégradation de β-caténine est une variante de l'extrait de facteur cytostatique (en métaphase II-arrêté). A la différence de l'extrait à basse vitesse et à haute vitesse utilisée pour l'étude du cycle cellulaire, l'extrait de vitesse intermédiaire qui fonctionne le mieux pour la dégradation de β-caténine. Jeextrait nterphase favorise aussi robuste dégradation β-caténine est bien plus de travail pour se préparer.
    1. Ajouter Leupeptine, Pepstatine, mélange aprotinine (LPA, un inhibiteur de protéase) à 10 pg / ml (dilué à partir d'un ml de solution à 10 mg / dans du DMSO) et la cytochalasine D à 20 pg / ml (dilué à partir d'un / ml solution stock de 10 mg dans le DMSO) dans les 20 ml restants de 0,1 x ROR.
    2. Ajouter 0. X ROR contenant LPA et cytochalasine D pour les œufs lavés, agiter doucement et incuber pendant 5 minutes à 16 ° C.
    3. Transfert des œufs en 16 ° C pré-réfrigérés tubes de 50 ml à centrifuger, permettez aux oeufs de s'installer, et éliminer le tampon résiduel par le haut. Pour éviter l'exposition à l'air, retirer une petite quantité de mémoire tampon dans la pipette de transfert avant de retirer les oeufs pour le transfert. Continuer à transférer des oeufs ajoutés dans les tubes à centrifuger et éliminer le tampon résiduel à partir de la partie supérieure du tube jusqu'à ce que les oeufs de remplir le tube de centrifugation de la partie supérieure, ce qui maximisera le rendement deextraire.
    4. Pour emballer les oeufs, tubes rotation de centrifugation à 400 g pendant 60 secondes à 4 ° C en utilisant un rotor à angle fixe. Éliminer le tampon résiduel à partir de la partie supérieure des tubes de centrifugation.
    5. Pour le spin écrasement, tourner les tubes à 15 000 g pendant 5 min à 4 ° C.
  4. Collecte couche cytoplasmique de l'extrait
    Remarque: La méthode décrite ci-dessous est différente de la méthode classique de la perforation de la paroi du tube de la centrifugeuse afin de recueillir la couche cytoplasmique. Ce protocole a été adapté pour la simplification et à utiliser avec notamment des tubes de centrifugation, qui sont réutilisables. Pas de différences notables dans la cinétique de dégradation β-caténine sont trouvés avec les deux méthodes. À cet extrait du point devraient être conservés au froid pendant tout le processus, et toutes les mesures doivent être effectuées à 4 ° C.
    1. Effacer un trou dans la couche lipidique en utilisant P1000 pointe de la pipette.
    2. Recueillir la phase cytoplasmique (entre la couche pigmentée et la light couche lipidique) en utilisant une nouvelle pointe de pipette P1000 dans des tubes à centrifuger pré-réfrigérés propres (Figure 1). Pour extrait de haute qualité qui se dégrade robuste β-caténine, réduire la quantité de couche pigmentée et des lipides qui est retirée de la couche cytoplasmique.
    3. Spin extrait cytoplasmique couche à 15 000 xg pendant 10 min à 4 ° C et recueille à nouveau la couche cytoplasmique. Répétez le spin et l'extraction 1X. NOTE: L'extrait doit être «couleur paille." En cas de contamination importante des couches pigmentées et de lipides à ce point, on peut répéter le spin une fois de plus, bien que les spins excessives vont diminuer la capacité de l'extrait de dégrader β-caténine.
    4. Ajouter LPA et la cytochalasine D de l'extrait à des concentrations finales de 10 ug / ml chacun. NOTE: En utilisant la méthode décrite donne une concentration relativement constante de protéines totales d'environ 50 mg / ml (52,41 ± 5,40 mg / ml, n = 3 préparations distinctes) dans Xenopus par exempleextraits de g.
    5. (Facultatif) Pour les essais de traduction, ajouter plafonné ARNm (0,1 mg / ml), RNAsin (1,5 U / ml), et l'énergie de régénération mélange (2.2.1) et incuber la réaction à la température ambiante pendant 2 heures (pour de plus amples informations, voir salique et . al 2 et Sive et al. 33). Utilisez extrait traduit immédiatement pour β-caténine essais de dégradation ou de snap-gel dans de l'azote liquide pour une utilisation ultérieure. REMARQUE: extrait fraîchement préparé a une grande capacité à traduire ajouté de manière exogène ARNm, mais malheureusement, cette capacité est perdue une fois l'extrait est gelé. Plafonné de l'ARNm peut être facilement préparé en utilisant des kits disponibles dans le commerce.
    6. Extrait Snap-gel dans de l'azote liquide. REMARQUE: Les extraits sont stockés dans les petites (200 pi) aliquotes à usage unique, car ils perdent rapidement leur capacité à dégrader le β-caténine si recongelé. Pour le stockage à long terme, l'extrait peut être stocké dans l'azote liquide. Pour le stockage à court terme, l'extrait peut être conservé à -80 ° C, bien que la capacité oExtrait du f pour dégrader β-caténine peut être considérablement réduit par un stockage prolongé à -80 ° C (pendant plus de 2 mois).

2. Préparation Extrait de β-caténine dégradation Assay

  1. Épuisement de Xenopus Extrait
    REMARQUE: Un avantage majeur de l'extrait de Xenopus est la capacité d'épuiser rapidement les composants d'une voie et d'ajouter précisément dos une quantité définie d'une protéine afin de déterminer ses effets dose-dépendants.
    1. Utilisez fraîchement préparé extrait d'oeufs de Xenopus ou décongeler rapidement extrait et le lieu congelés sur glace. Effectuez toutes les manipulations dans le froid.
    2. Ajouter l'extrait à 1/10 du volume d'anticorps granulés ou des billes d'affinité (par exemple, 20 ml de perles sédimentées à 200 ml extrait d'). Afin de minimiser la dilution de l'extrait, retirer autant de liquide des billes que possible avant l'addition de l'extrait à l'aide des conseils gel de chargement avec de longs bouts coniques.
    3. Tournez-extraitbourrelet mélange à 4 ° C pendant 1 heure.
    4. Spin-extrait perle mélange à 12 600 xg à centrifuger à 4 ° C pendant 30 secondes. Par ailleurs, si des billes magnétiques sont utilisés, appliquer un champ magnétique à recueillir des perles.
    5. Transfert épuisé extrait dans un tube de centrifugeuse frais sur la glace. Veillez à ne pas transférer des perles avec l'extrait.
    6. Confirmer l'efficacité de l'épuisement par immuno fois extrait et perles appauvri.
    7. Préparer un extrait pour le dosage de la dégradation de β-caténine comme décrit dans 2.2.
  2. Optimisation Xenopus Extrait de β-caténine dégradation
    REMARQUE: dégradation β-caténine dans Xenopus extrait d'oeuf est un processus dépendant de l'énergie qui épuise rapidement les réserves d'ATP endogènes. Par conséquent, un système de régénération de l'énergie est nécessaire pour maintenir la dégradation robuste β-caténine.
    1. Préparer un 20x régénération de l'énergie (ER) mélange constitué de 150 mM de phosphate de créatine, ATP 20 mM, 600 ug / ml de créatine phosphokinase,et 20 mM de MgCl2. ER doit être aliquote et stocké à -80 ° C. Éviter les cycles de gel / dégel en utilisant de petites aliquotes congelées.
    2. Décongeler rapidement les Xenopus extrait d'oeufs en frottant le tube congelé entre les mains. Placer le tube sur la glace juste avant tout de l'extrait a fondu.
    3. Ajouter 10 ul de régénération d'énergie mélange (20x ER) dans une aliquote (200 pi) de Xenopus extrait d'oeufs. Mélanger soigneusement en feuilletant rapidement le tube et le pouls vortex. Pulse-spin et placer immédiatement sur la glace.
    4. (Facultatif) Le chiffre d'affaires de β-caténine peut être légèrement améliorée dans Xenopus extrait d'oeufs par addition d'ubiquitine (1,25 mg / ml final). Cycloheximide (0,1 mg / ml final) peut également être ajouté pour réduire au minimum la traduction de transcrits endogènes.
    5. Aliquoter les volumes appropriés pour l'essai de dégradation dans des tubes à centrifuger pré-réfrigérés sur glace. Pour radiomarqués essais de dégradation β-caténine, retirer 2-5 ml d'extrait pour chaque point de temps. </ Li>

3. Radiolabeled β-caténine dégradation essai chez Xenopus extrait d'oeufs

NOTE: Toutes les étapes doivent être effectuées sur la glace, sauf indication contraire.

  1. Préparation Radiolabeled β-caténine
    1. Préparer fraîchement synthétisé in vitro [35 S] méthionine-protéine radiomarquée en utilisant des kits disponibles dans le commerce. NOTE: Génération 35 S-étiquetés (demi-vie 87 jours) des protéines sont facilement et efficacement produites à l'aide disponibles dans le commerce in vitro couplé kits de transcription-traduction. Il est important que la protéine traduite est suffisamment marqué de telle sorte que les changements dans le renouvellement des protéines peuvent être facilement visualisés.
    2. Pour confirmer le radiomarquage avec succès, effectuer SDS-PAGE/autoradiography avec 0,5 pi de la protéine traduite. Quantifier l'intensité de la bande β-caténine radiomarqué en utilisant ImageJ, ImageQuant, ou un progr logiciel quantitative alternatifam. NOTE: La β-caténine bande de protéine radiomarquée doit être clairement visible sur le film en quelques heures (4-6 h).
    3. Snap-geler la protéine radiomarquée dans l'azote liquide pour le stockage jusqu'à l'utilisation. Remarque: le stockage prolongé (> 2 mois) et multiples de congélation / décongélation (supérieur à 2) peut sérieusement affecter la capacité de la β-caténine radiomarqué à dégrader robuste dans Xenopus extrait d'oeufs. En général, la stabilité des protéines radiomarquées diminue de façon importante après 1 mois de stockage à -80 ° C; ainsi, β-caténine radiomarqué relativement fraîchement préparées donne de meilleurs résultats dans ces essais de dégradation.
  2. Exécution β-caténine dégradation Assay
    1. Ajouter 1-3 pl (en fonction de la force du signal en bande de radiomarquée) de β-caténine dans traduit in vitro (et d'autres protéines, de petites molécules, etc qui sont testées) dans 20 ul de Xenopus mélange réactionnel sur de la glace. Mélanger soigneusement par quickly feuilletant le tube et une courte impulsion de vortex; il s'agit d'une étape importante car Xenopus extrait d'oeufs est très visqueux, et un mélange incomplet affectera la cohérence des résultats. Pulse rotation et placer sur la glace.
    2. Lancer la β-caténine dégradation réaction en déplaçant les tubes à la température ambiante.
    3. Au point de temps désigné, retirer 5.1 ml de l'échantillon et mélanger immédiatement avec un tampon d'échantillon SDS (volume de 5x) pour arrêter la réaction. Pour vous assurer que la réaction de dégradation est complètement terminée, le tube de film à plusieurs reprises et vortex vigoureusement.
    4. Effectuer SDS-PAGE/autoradiography. Exécutez 1 ml équivalents (~ 50 mg de protéine) de l'extrait pour chaque point de temps / voie. Dégradation de β-caténine dans Xenopus extrait d'oeufs doit être attestée par la baisse en fonction du temps de l'intensité du radiomarqué β-caténine bande Figure 2. Quantifier les résultats en utilisant ImageJ, ImageQuant, ou un autre logiciel d'imagerie préféré si nécessaire.
    5. (Optional) Soak gel de SDS-polyacrylamide en solution de fixation (acide acétique à 10% et 30% de methanol dans de l'eau distillée) avant le séchage pour réduire la radioactivité de fond et d'accroître la qualité de l'image.

4. Β-caténine-luciférase dégradation de dosage dans l'extrait d'oeufs de Xenopus

Effectuez toutes les étapes sur la glace, sauf indication contraire.

  1. Préparation β-caténine-luciférase
    1. Synthétiser non radiomarqué, β-caténine-étiqueté de la luciférase en utilisant le système de transcription-traduction couplée avec mélange complet d'acides aminés.
    2. Confirmer la production de la luciférase-β-caténine marqué par la mesure de l'activité luciférase de 0,5 à 1 ul de la réaction. Évaluer la luminescence de fond en mesurant la luminescence d'un mélange de réaction non traduite. REMARQUE: des kits commerciaux multiples sont disponibles pour mesurer l'activité de la luciférase. Luminescence de longue durée, cependant, fonctionne particulièrement bien pour l'assa de dégradationy.
  2. Exécution β-caténine-luciférase dégradation Assay
    1. Décongeler et préparer Xenopus extrait d'oeufs que dans 2.2.
    2. Ajouter dans traduit in vitro β-caténine-luciférase fusion (de 4,1) en mélange préparé de réaction Xenopus (de 2,2) sur la glace et bien mélanger comme dans 3.2.1. NOTE: L'activité de la luciférase de β-caténine qui est ajouté à l'extrait est typiquement comprise entre 20 - 50 000 unités relatives de luminescence (RLU) / ml d'extrait (sur la base de mesures obtenues à partir de 4.1.2). Signal de départ devrait être d'environ 100 000 AVC (2-5 ml de la traduit in vitro β-caténine-luciférase fusion en).
    3. Maj l'extrait de RT pour démarrer la réaction de dégradation.
    4. Retirer une aliquote de la réaction à l'heure indiquée et enclenchez-gel dans de l'azote liquide. REMARQUE: Les échantillons en trois exemplaires sont typiquement prélevés pour analyse, pour chaque point de temps. Extrait congelé peut être conservé à -80 ° C until ils sont prêts à être analysés.
    5. échantillons de fonte de la glace, des échantillons de transfert aux plaques à 96 puits blanches standard sur la glace, et le processus de l'activité de la luciférase.

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Representative Results

Un schéma de dégradation de β-caténine chez Xenopus extrait d'œuf est représenté sur la figure 2A. 35S marqué β-caténine a été incubé dans Xenopus extrait de l'oeuf, des fractions aliquotes (1 ml d'extrait équivalent) ont été prélevés à des moments appropriés, et des échantillons ont été soumis à SDS-PAGE suivie d'une autoradiographie. la dégradation de β-caténine par des composants de la voie Wnt est médiée par le système ubiquitine-protéasome 2, et la dégradation de β-caténine [35 S]-radiomarquée dans l'extrait de Xenopus est inhibée par l'addition de l'inhibiteur de protéasome MG132 Figure 2B. La dégradation de la β-caténine par des composants de la voie Wnt est dépendante de sa phosphorylation par GSK3 34. dégradation de la GSK3-dépendante peut être aisément démontrée dans plusieurs façons en utilisant l'extrait de l'oeuf de Xénope: 1) La β-caténine (SA) mutant (les sites de phosphorylation de GSK3 mutés en alanines) est stabilisé dans Xenopus oeuf extrait par rapport à la protéine sauvage β-caténine figure 2B. 2) des inhibiteurs à petites molécules de la GSK3 (LiCl) inhibent la dégradation de la même façon β-caténine (Figure 2C). 3) Finalement, l'épuisement de la GSK3 à partir de l'extrait de l'oeuf de Xénope inhibe la dégradation de la β-caténine; dégradation peut être sauvé par addition exogène GSK3 Figures 2D-E.

Le dosage de la β-caténine dégradation radiomarqué fournit une évaluation visuelle particulièrement instructif de son mode de dégradation (par exemple de la dégradation ubiquitine contre le clivage par apoptose). L'autoradiographie, cependant, beaucoup de travail, et, pour la plupart, limitée pour l'analyse à haut débit de la voie (par exemple, le dépistage des modulateurs à petites molécules de la voie Wnt). Le dosage de dégradation β-caténine-luciférase est plus facilement et plus rapidement quantifiable comme la quantité de luminescence émise est directement proportionnelle à l'amontant de la protéine β-caténine-luciférase. Cette caractéristique rend le dosage de la luciférase simple et facilement adaptable pour tests à haut débit.

Il est important de déterminer que la fusion de la luciférase a des propriétés similaires à celle de la protéine non fusionnée. Ceci peut être déterminé de façon empirique par fusion de la protéine de luciférase à l'extrémité N-terminale, C-terminale, ou interne. Fusion de la luciférase à l'extrémité N-ou C-terminale de la β-caténine n'affecte pas sa capacité à activer les gènes cibles de Wnt inculturée cellules de mammifère ou de sa vitesse de rotation dans l'extrait de l'oeuf de Xénope 2, 19, 20.

Un β-caténine-luciférase dégradation dosage représentatif de Xenopus dans l'extrait d'œuf est représenté sur la figure 3A, dans lequel la dégradation de la β-caténine-luciférase a été évaluée par SDS-PAGE/autoradiography de la protéine et l'activité luciférase radiomarqué de la fusion. Le taux de degradation de la β-caténine-luciférase est similaire à la protéine β-caténine non marqué. La régulation de la dégradation de la β-caténine fusion-luciférase est essentiellement identique à la protéine non fusionnée que l'addition de LiCl ou de l'épuisement de la GSK3 conduit à l'inhibition de la β-caténine-luciférase roulement. Comme représenté sur les figures 3B-C, les variations de signal radioactif de la protéine β-caténine-luciférase est parallèle à la modification de l'activité enzymatique de la luciférase dans le temps. Un problème qui se pose de l'utilisation de β-caténine-luciférase (en particulier la protéine de fusion produite à partir du système de transcription-traduction in vitro) est le signal de la luciférase de fond causé par l'utilisation de sites d'initiation de la traduction interne ou la terminaison prématurée de la traduction Figure 3D. Ce problème peut parfois être surmonté par l'optimisation de la concentration d'ADN utilisée dans la réaction d'IVT. Nous n'avons pas, cependant, observe une diminution de l'activité de la luciférase de fond lorsque nous avons fait varierla concentration d'ADN plasmidique de notre concept particulier β-caténine-luciférase. Il est probable que nous aurons besoin de restructurer la protéine de fusion par mutagenèse afin de réduire davantage les sites de démarrage de la traduction interne et / ou la cessation prématurée de la traduction de la protéine de fusion β-caténine-luciférase. Étant donné que la protéine de luciférase est relativement stable au cours du temps de la réaction de dégradation dans Xenopus oeuf extrait figure 3A, cependant, ce signal de fond peut être simplement soustraite si le rapport de la protéine de luciférase tronqué à la longueur complète β-caténine fusion est connue .

A force de le dosage de la luciférase est la capacité à l'échelle dans un format multi-puits qui permet d'effectuer le criblage à haut débit pour des modulateurs de la dégradation de β-caténine. Sur la figure 4, une analyse de damier représentant est affiché en utilisant un inhibiteur de la dégradation de β-caténine, MG132, qui inhibe l' protéasome. Le résultat de l'expérience en damier indique que le test est uniforme et reproductible dans un format à 96 puits et démontre son aptitude à l'criblage à haut débit.

Figure 1
Figure 1. Représentation schématique de la préparation du concentré extrait d'oeufs de Xenopus. Oeufs sont collectés à partir de HCG-injecté Xenopus laevis femelles, compactés avec une faible vitesse (400 xg) de spin, et broyés et séparés par une vitesse moyenne (15 000 xg ) de spin. Prenez soin d'injecter en sous-cutané dans le sac dorsal de la lymphe, retirer délicatement les œufs pourris, et bien séparer l'extrait cytoplasmique de haute qualité de la moindre qualité extrait sombre comme indiqué dans le texte.

igure 2 "fo: contenu width =" 5 po "fo: src =" / files/ftp_upload/51425/51425fig2highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51425/51425fig2.jpg "/>
Β-caténine Figure 2. Β-caténine dégrade robuste quand il est incubé dans Xenopus extrait d'œuf. A) Un schématique d'un essai de dégradation. B) [35 S]-marqué préparé par une réaction d'IVT dégrade robuste quand il est incubé dans Xenopus extrait d'œuf. Ajout de MG132 (200 M) à Xenopus extrait d'oeufs inhibe la dégradation β-caténine. Mutation à des alanines phosphosites GSK3 sein β-caténine (β-caténine SA) ou l'ajout de LiCl (25 mM) C) inhibe la dégradation de β-caténine. D) Le site de liaison de GSK3 Axin (acides aminés 506-560) épuise efficacement GSK3 de Xenopus extrait d'oeufs. E) Xenopus extrait d'oeufs de GSK3 appauvri inhibe la dégradation β-caténine et peut être sauvé par addition of GSK3 recombinante (0,1 mg / ml). Ajout de LiCl (25 mm) bloque la capacité de GSK3 recombinant pour sauver la dégradation β-caténine dans l'extrait de GSK3 appauvri. Cliquez ici pour agrandir l'image.

Figure 3
Figure 3. Β-caténine de la luciférase marqués dégrade lorsqu'elle est incubée dans Xenopus extrait d'oeufs. A) Radiolabeled β-caténine-luciférase dégrade à une vitesse similaire à celle de la protéine β untagged-caténine. Comme avec la protéine de type sauvage, l'addition de LiCl (25 mM) inhibe la β-caténine-luciférase dégradation. Luciférase seul ne tourne pas sensiblement au cours de Xenopus extrait d'oeufs. Changements dans l'activité luciférase de la β-caténine-luciferase fusion parallèle l'évolution de son taux de protéines. B) Ajout de LiCl (25 mM) ou de l'épuisement de GSK3 C) inhibe β-caténine-luciférase chiffre d'affaires évaluée en mesurant l'activité de la luciférase. D) Immunoblotting pour traduite in vitro β-caténine- luciférase (en utilisant un anticorps anti-luciférase) a révélé des quantités importantes de protéine luciférase libre dans certaines préparations qui contribue probablement à l'arrière-plan plus élevé par rapport à l'analyse de la dégradation radiomarqué. Cliquez ici pour agrandir l'image.

Figure 4
Figure 4. Régulée dégradation de β-caténine-luciférase dans l'extrait de Xenopus peut être adapté pourun format à haut débit. Une analyse en damier représentant de β-caténine en utilisant la luciférase-MG132 (450 uM) en tant qu'inhibiteur de la dégradation de β-caténine. Colonnes grisées indiquent puits MG132-traités, et des colonnes légères représentent véhicule puits (DMSO) traités. Quantification et résultat du calcul facteur Z dans une note de 0,3 indiquant un dosage acceptable pour une utilisation potentielle dans le criblage à haut débit.

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Discussion

Xenopus extrait d'oeuf est un système biochimique robuste pour enquêter sur le chiffre d'affaires β-caténine. La concentration de β-caténine chez Xenopus extrait d'œuf est 25 ~ 2 nM. Dans des conditions optimales, l'extrait d'œuf est capable de dégrader les β-caténine à un débit de 50 à 100 nM / h et est semi-maximale à 24 200 nM. Il ya plusieurs étapes essentielles pour la reconstitution réussie de la dégradation de β-caténine utilisant Xenopus extrait d'oeufs. Ceux-ci comprennent 1) la génération d'une grande qualité extrait d'oeufs de Xénope et la manière par laquelle l'extrait d'oeuf est préparé, 2) générant la qualité radiomarqué β-caténine et de la protéine β-caténine-luciférase, 3) l'optimisation des conditions de réaction pour soutenir la dégradation de β-caténine et 4 ) traitement approprié des points de temps de réaction.

Une préparation de haute qualité de Xenopus extrait d'oeufs dans laquelle β-caténine est robuste dégradé dépend à la fois de la qualité des ee oeufs et la façon dont les oeufs sont traitées avant l'étape de broyage, ainsi comment l'extrait est ensuite centrifugé pour obtenir l'extrait final. Comme mentionné dans le protocole, il est important de s'assurer que les œufs de qualité ne élevés (matérialisés par contraste entre l'hémisphère animal noir et hémisphère végétatif lumière) sont utilisés, que les œufs de mauvaise qualité (bouffées filandreux, tachetées ou blanc) sont supprimés dans l'ensemble le processus, que les oeufs sont maintenus à une température fraîche (16 ° C) tout au long de la procédure, et que la procédure est effectuée le plus rapidement possible. Il est important de ne pas sacrifier la qualité pour la quantité d'extrait. De plus, tel que mentionné précédemment, les œufs de grenouille qui pond des œufs de mauvaise qualité (> 10%) devraient être entièrement éliminés.

L'extrait ci-dessus est une modification de la méiose II-arrêté extrait de CSF 11. La préparation de Xenopus extrait d'oeufs pour la dégradation β-caténine (extrait de vitesse intermédiaire) diffteurs à partir d'extraits classiques préparés pour l'étude du cycle cellulaire 30-32, qui sont à basse vitesse ou haute vitesse extrait 35. Adaptation Xenopus extrait d'oeufs pour dégradation optimale des autres protéines peut exiger la modification de la vitesse de centrifugation et le nombre de tours. Extrait à basse vitesse contient des organites intacts et d'autres grands composants cellulaires. Ainsi, les rotations à vitesse plus élevée vont modifier la composition de l'extrait et éventuellement éliminer les composants inhibiteurs et / ou essentiels qui affecteront la dégradation de la protéine d'intérêt. La préparation de l'extrait de vitesse intermédiaire décrit ici est optimisée pour la dégradation de la β-caténine par des composants de la voie Wnt. Spinning l'extrait supérieure à 4X peut réduire considérablement la capacité de l'extrait de dégrader β-caténine (même si elle a un effet minime sur la dégradation d'un autre composant Wnt, Axin). β-caténine est sensible à la protéolyse de la caspase-médiée dans l'extrait par centrifugation à basse vitesse et ne noticdégrader eably dans l'extrait de rotation à grande vitesse. Ainsi, il est probable que des extraits de vitesse différents seront optimales pour la dégradation des composants d'autres voies de signalisation.

La génération de 35 S-β-caténine et la β-caténine-luciférase peut être effectuée en utilisant un certain nombre de kits disponibles dans le commerce. La production de protéines à l'aide de transcription-traduction systèmes couplés est très dépendante de la qualité du plasmide: midi-préparations très pures de plasmides fonctionnent mieux et sont plus fiables par rapport à l'ADN des mini-préparations. Pour le radiomarquage de β-caténine, fraîchement obtenue [35 S] méthionine ou Translabel ([35S] methionine plus de [35S] cysteine) est préféré. On notera que la méthionine et la cystéine ont tous deux tendance à s'oxyder avec un stockage prolongé diminuant ainsi leur incorporation dans des β-caténine dans la transcription-traduction in vitro couplées réaction. Parce que le stockage prolongé et répété de gel-dégelcycles peuvent inhiber la dégradation, de petites quantités de la β-caténine radiomarqué sont préparés à la fois et utilisés peu de temps après.

La quantité de protéine traduite et le nombre de methionines à la protéine à déterminer la puissance du signal radio-marqué. Pour β-caténine, il devrait y avoir aucun problème à obtenir des signaux forts radioactifs pour des essais de dégradation. Pour les protéines avec quelques methionines et / ou qui ne se traduisent pas bien, une méthionine [35S] et [35 S] cystéine mélange peut être utilisé à la place de [35 S] méthionine et / ou ajouté une étiquette d'épitope (Myc) qui contient plusieurs methionines. Bien que le succès avec différents plasmides d'expression contenant les promoteurs de phage appropriées (T7, T3 et SP6) peuvent être obtenues in vitro pour des réactions de transcription-traduction, à base de plasmide pCS2 donne généralement de meilleurs résultats. En outre, le signal de la protéine traduite peut parfois être considérablement augmentée par la suppression du 5 endogène'UTR. Enfin, pour des expériences à grande échelle (par exemple, criblage à haut débit), une grande quantité de β-caténine-luciférase recombinante peut être nécessaire. β-caténine-luciférase à partir de la / système baculovirus Sf9 se dégrade avec des cinétiques similaires à celles du type sauvage β-caténine dans l'extrait et d'embryons de Xenopus 2. Alternativement, un haut rendement dans le système d'expression in vitro (par exemple les germes à base de blé) a été utilisée avec succès pour criblage à haut débit 19, 20.

Afin de mesurer de façon fiable la dégradation de la β-caténine dans le système d'extraction, il est important que le signal initial à partir de l'une ou l'autre β-caténine radiomarqué ou la luciférase β-caténine fusion est suffisamment robuste. Ainsi, une certaine quantité de l'optimisation par l'expérimentateur, de la taille de l'essai de dégradation, le nombre de points de temps nécessaire, et l'efficacité in vitro de la réaction de traduction will nécessaire. Lors du montage de la réaction de dégradation, il ya plusieurs étapes qui peuvent être prises pour améliorer les chances d'obtenir la dégradation robuste. Tout d'abord, tous les réactifs doivent être décongelés rapidement et placés sur de la glace avant leur dégel complet. Étant donné que la dégradation de la β-caténine est très dépendante de l'énergie, il est important que le ER est relativement fraîche. D'autre part, l'extrait de l'oeuf de Xénope est visqueux, et il est essentiel que la réaction est soigneusement mélangé après addition de fusion β-catenin/β-catenin-luciferase radiomarqué, ER, les protéines, les petites molécules modulateurs, etc En troisième lieu, la pré-incubation de la réaction mélanger pendant 20-30 min sur la glace donne des résultats plus reproductibles lors des tests des effets de modulateurs à petites molécules.

La capacité à épuiser les protéines de Xenopus extrait d'oeufs représente un outil puissant pour évaluer la fonction des protéines et de leurs effets dépendant de la concentration. A titre d'exemple, nous démontrons que l'appauvrissement de GSK3 de Xenopus extrait bloque oeuf la dégradation de β-caténine, indiquant le rôle important de la GSK3 dans le chiffre d'affaires β-caténine. Différentes conditions d'appauvrissement devront être déterminée empiriquement pour des protéines différentes. Par exemple, les protéines abondantes, il faudra une augmentation de la quantité d'anticorps ou de ligands d'affinité perles utilisées pour parvenir à la pleine épuisement. Un bon point de départ est d'utiliser des billes emballés à 1/10 du volume de l'extrait afin de minimiser extrait dilution. En plus de la force de liaison du ligand / anticorps d'affinité pour la protéine cible, le type de billes (par exemple, sépharose, l'agarose, ou magnétique) utilisé peut influer sur l'efficacité de l'appauvrissement de la protéine de Xenopus extrait d'oeufs 36. Enfin, il serait idéal pour analyser le degré d'épuisement (typiquement par immunoblot). Une fois la réaction β-caténine est terminée, la manière par laquelle les échantillons sont traités peut grandement affecter les résultats de l'expérience. La concentration de l'Xenopus oeuf préparations d'extraits préparés de la manière décrite est 52,41 mg / ml ± 5,40 mg / ml, et il est important de ne pas surcharger la capacité du gel SDS-PAGE; ce n'est pas un problème avec le dosage de la luciférase-β-caténine. Ainsi, pour chaque point dans le temps, pas plus de 1 ml, soit de l'extrait doivent être chargés dans chaque voie d'un gel de SDS-PAGE. Afin d'améliorer encore la qualité des résultats, l'étape de fixation de gel (facultatif) diminue la radioactivité de fond et d'accroître le rapport signal-sur-bruit. Pour le dosage de la luciférase, une diminution d'un signal initial de 100 000 RLU dans Xenopus extrait d'oeufs reflète fidèlement la variation dans les niveaux de la protéine de fusion β-caténine-luciférase protéines.

Le système d'extraction d'oeufs de Xenopus représente un système attrayant pour étudier la régulation de la dégradation de β-caténine. Le système d'extraction permet le contrôle précis de la concentration en protéines individuelles par l'intermédiaire d'épuisement et de reconstitution tion. La capacité de contrôler leurs effets sur la cinétique de rotation β-caténine dans le temps permet de mieux comprendre le mécanisme biochimique de cette étape cruciale dans la transduction du signal Wnt. Ces manipulations ont permis de mieux comprendre en profondeur les interactions moléculaires complexes entre les composants de la voie de signalisation Wnt et sont essentiels pour le développement du premier modèle mathématique de la voie Wnt 24. Un inconvénient est que les concentrations des composants de la voie Wnt dans Xenopus extrait d'oeufs et des lysats de cellules de mammifères se sont révélés différer, reflétant peut-être les différences dans la façon dont la voie Wnt est régulée pendant l'embryogenèse par rapport à la situation de l'adulte 37. La capacité d'effectuer des essais, sur la base de la luciférase, à la fois radioactifs et enzymatiques en utilisant Xenopus extrait d'oeufs fournit ajouté outils qualitatifs et qualitatifs complémentaires puissants pour étudier la régulation biochimique de la dégradation de β-caténine.

t "> En plus de surveiller le chiffre d'affaires de β-caténine, la dégradation du régulateur Wnt négatif, Axin, peut être surveillée chez Xenopus extrait d'oeufs soit comme une protéine radiomarquée ou la fusion de la luciférase. l'aide d'une variante de la luciférase, Renilla, fusionné à Axin, a déjà été adapté pour la luciférase dégradation essai dans un format à haut débit à écran simultanément pour des modulateurs de deux protéines de la voie Wnt, β-caténine et Axin 19, 20. Cet écran biochimique identifié le médicament approuvé par la FDA, pyrvinium qui a augmenté et diminution du taux de β-caténine et axine, la dégradation, respectivement, dans Xenopus extrait d'oeufs 19. pyrvinium a ensuite été validé dans des cellules humaines en culture et dans divers organismes modèles (par exemple, Xenopus et C. elegans) comme un inhibiteur de petite molécule de la voie Wnt canonique voie. En résumé, le système d'extraction d'oeufs de Xenopus est biochimique tha système polyvalentt peut être exploitée dans une multitude de façons d'étudier le mécanisme de signalisation Wnt ainsi que pour l'identification de modulateurs à petites molécules de la voie Wnt. Procédé biochimique décrit ici peut être appliqué à d'autres voies de signalisation dans laquelle la dégradation des protéines peut jouer un rôle essentiel.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.

Acknowledgments

Nous remercions Laurie Lee pour la lecture critique du manuscrit. TWC est soutenu par une bourse prédoctorale American Heart Association (12PRE6590007). MRB est soutenu par une subvention de formation de l'Institut national du cancer (T32 CA119925). SSH est soutenue par les Instituts nationaux de la santé (R01DK078640). EL est soutenue par les National Institutes of Health (R01GM081635 et R01GM103926).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) ProSpec hor-272-A Reconstituted with distilled water before use. 
Human chorionic gonadotropin Sigma CG10-10VL
Potassium chloride Fisher BP366-1
Sodium chloride Research Products International S23020-5000.0
Magnesium chloride Fisher BP214-500
Calcium chloride Acros Organics AC42352-5000
HEPES Fisher BP310-1
Cysteine Acros Organics AC17360-1000
Leupeptin Sigma L2884-10MG
Aprotinin Sigma A1153-10MG
Pepstatin Sigma P4265-5MG
Cytochalasin B Sigma C8273-10MG
3 ml syringe: Luer Lock tip Becton Dickinson 309657
27 G needle Becton Dickinson 305109
96 well solid white polystyrene microplate, round bottomed Corning 3605
Steady-Glo luciferase assay system Promega E2520 Store long-term at -80 °C, can store for up to 1 month at -20 °C
TNT Sp6 coupled reticulocyte lysate system Promega L4600
TNT Sp6 high-yield wheat germ protein expression system Promega L3260 Generally higher yield than reticulocyte lysate 
EasyTag Express protein labeling mix [S35] Perkin Elmer NEG772007MC
Creatine phosphate Sigma 27920-5G
ATP Sigma A2383-5G
Creatine phosphokinase Sigma C3755-35KU
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D8418-50ML
Dual-Glo luciferase assay system Promega E2920 Same storage conditions as Steady-Glo
50 ml Centrifuge tubes Fisher Scientific 0556214D
Sorvall SS-34 fixed angle rotor Thermo Scientific 28020
115 V 50/60 Hz Minicentrifuge Fisher Scientific 05-090-128
mMessage mMachine Sp6 kit Ambion AM1340
Anti-firefly luciferase antibody Abcam ab16466
Anti-GSK3 antibody BD Transduction Laboratories 610201
FLUOStar Optima BMG Labtech
Sorvall RC-6 Plus centrifuge Thermo Scientific
16 °C Incubator Percival Scientific

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Chen, T. W., Broadus, M. R., Huppert, S. S., Lee, E. Reconstitution Of β-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract. J. Vis. Exp. (88), e51425, doi:10.3791/51425 (2014).

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