Summary
Es wird ein Verfahren zur Analyse von Protein-Abbau unter Verwendung radioaktiv markiert und die Luciferase-Fusionsproteine in Xenopus-Ei-Extrakt und deren Anpassung für Hochdurchsatz-Screening für Kleinmolekül-Modulatoren der Proteinabbaus beschrieben.
Abstract
Xenopus laevis-Ei-Extrakt ist eine gut charakterisierte, robustes System zur Untersuchung der Biochemie der verschiedenen zellulären Prozessen. Xenopus-Ei-Extrakt verwendet wurde, um den Proteinumsatz in vielen zellulären Kontexten, einschließlich des Zellzyklus und der Signalübertragungswege 1-3 studieren. Hierin wird ein Verfahren zur Isolierung von Xenopus-Ei-Extrakt, das optimiert wurde, um die Verschlechterung der kritischen Wnt-Komponente, β-Catenin fördert beschrieben. Zwei verschiedene Verfahren werden beschrieben, um β-Catenin Proteinabbau in Xenopus-Ei-Extrakt zu beurteilen. Ein Verfahren ist visuell aussage ([35 S]-radioaktiv markierte Proteine), während das andere leichter für Hochdurchsatz-Assays (Firefly-Luciferase-markierte Fusionsproteine) skaliert. Die beschriebenen Techniken können dazu verwendet werden, ein, sind aber nicht darauf beschränkt, zu beurteilen β-Catenin-Protein zu identifizieren und Umsatz molekularen Komponenten beiträgt, den Umsatz. Zusätzlich wird die Fähigkeit, um große Mengen von homogenen Xenopus-Ei-Extrakt in Kombination mit der quantitativen und einfache Auslesung der Luciferase-markierte Proteine zu reinigen, ermöglicht dieses System leicht für Hochdurchsatz-Screening auf Modulatoren von β-Catenin Abbau angepasst werden.
Introduction
Xenopus laevis-Ei-Extrakt wurde ausgiebig verwendet, um viele Zell biologischen Prozessen einschließlich Zytoskeletts, Kernanordnung und Import, Apoptose, Ubiquitin-Stoffwechsel, Zellzyklus-Progression, Signaltransduktion und Proteinumsatz 1-17 studieren. Die Xenopus-Ei-Extrakt-System ist offen für die biochemische Analyse einer Legion von zellulären Prozessen, weil Ei-Extrakt stellt im Wesentlichen unverdünnt Zytoplasma, die alle wesentlichen Komponenten zytoplasmatischen notwendig, diese Prozesse auszuführen und ermöglichen Untersuchung enthält. Große Mengen von Ei-Extrakt kann auf einmal zur biochemischen Manipulationen, die große Mengen von Material (z. B. Proteinreinigung oder Hochdurchsatz-Screening) 18-20 erfordern, hergestellt werden. Ein weiterer Vorteil ist, dass die Konzentration von spezifischen Proteinen in Xenopus-Ei-Extrakt kann präzise durch Zugabe von rekombinantem Protein und / oder der Immunodepletion ENDOG eingestellt werdenenous Proteine im Gegensatz zur Transfektion von Plasmid-DNA, wobei die Expression des Proteins von Interesse ist schwierig zu steuern. Darüber hinaus kann der Mangel an verfügbaren rekombinanten Proteinen durch die Zugabe von Transkripten, die das Protein von Interesse kodiert, überwunden werden, unter Ausnutzung der hohen Kapazität der frisch hergestellten Xenopus-Ei-Extrakt zur exogen zuge mRNA zu übersetzen.
Die Regulation der Proteinabbau ist entscheidend für die Steuerung vieler zelluläre Wege und Prozesse 21. Xenopus-Ei-Extrakt wurde ausgiebig verwendet, um den Proteinabbau zu untersuchen, wie das System erlaubt mehrere Möglichkeiten, um den Proteinumsatz ohne verwirrende Einflüsse der Transkription und Translation kontrollieren. Der Wnt-Signalweg ist eine hoch konservierte Signalweg, der eine entscheidende Rolle in der Entwicklung und Krankheit spielt. Der Umsatz von β-Catenin, der Haupt Effektor des Wnt-Signalwegs, ist stark reguliert, und eine erhöhte Steady-State-level von β-Catenin ist entscheidend für die Aktivierung der Wnt-Zielgene. Die Bedeutung der β-Catenin-Abbau wird durch die Tatsache, dass Mutationen im Wnt-Signalweg, die β-Catenin-Abbau hemmen, gefunden in ~ 90% der sporadischen Fälle von Darmkrebs 22 hervorgehoben. β-Catenin-Abbau durch Komponenten des Wnt-Signalwegs getreu in Xenopus-Ei-Extrakt rekapituliert, um den Mechanismus des Umsatzes zu studieren sowie neuartiger niedermolekularer Modulatoren von seiner Abbau 2, 19, 20, 23-29 zu identifizieren.
Verfahren zur Herstellung von Xenopus-Ei-Extrakt zur Untersuchung der Zellzyklus sind in früheren Veröffentlichungen JoVE 30-32 beschrieben. Das derzeitige Protokoll beschreibt eine Modifikation dieser Verfahren und ist für den Abbau von optimierten [35 S]-radioaktiv markierten β-Catenin und die Luciferase-markierten β-Catenin inXenopus-Ei-Extrakt. Das radioaktiv markierte Abbau-Assay ermöglicht die direkte Visualisierung von Protein-Ebene über Autoradiographie. [35 S]-Methionin in das Protein von Interesse unter Verwendung eines in vitro-Translationsreaktion, die dann direkt auf eine Abbaureaktion zugegeben werden kann, eingebaut. Darüber hinaus ist das radioaktiv markierte Proteinumsatz-Assay erfordern einen Antikörper gegen das Protein von Interesse oder ein Epitop-Tag, das die Proteinstabilität beeinflussen. Da selbst kleine Veränderungen in der Proteinniveaus, wie in Änderungen der Intensität des radioaktiv markierten Proteinbande reflektiert, werden leicht durch Autoradiographie sichtbar gemacht, die [35 S]-radioaktiv markierte Abbauassay stellt ein sehr nützliches Verfahren zur Visualisierung des Proteinumsatzes 2.
Fusion von β-Catenin an Leuchtkäfer-Luciferase (im folgenden einfach als "Luciferase" genannt) ermöglicht eine genaue und einfache quantitative Messung der Proteinspiegel, umum die kinetischen Eigenschaften der β-Catenin-Umsatz 19, 20 zu bestimmen. Ein wesentlicher Vorteil der Luciferase-Assay ist, dass es eine starke quantitative System, in dem bis skaliert wird. Das folgende Protokoll bietet einfache Methoden zur Bestimmung von β-Catenin-Abbau und eine robuste, effiziente und effektive Methode für die Hochdurchsatz-Screening von neuen β-Catenin-Modulatoren.
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Protocol
1. Vorbereitung der Xenopus-Ei-Extrakt
HINWEIS: Jeder Frosch ergibt etwa 1 ml der verwendbaren Ei-Extrakt. Extrakte aus 10 Frösche werden typischerweise zu einer Zeit hergestellt wird, und das Volumen der unten beschriebenen Puffer zur Durchführung einer 10 Frosches Xenopus-Ei-Extrakt prep. Das Puffervolumen kann somit für größere oder kleinere Zubereitungen von Ei-Extrakt eingestellt werden. Preps auf diese Weise erzeugte Proteinkonzentrationen konsequent ergeben ≥ 50 mg / ml. Die Erfassung Eier und Verarbeitung zu extrahieren ist am effizientesten, wenn sie von zwei Personen durchgeführt. (Für die Grundhaltung Frosch Techniken siehe Sive et al. 33).
- Ei-Sammlung
- Auffrischen der Frösche, spritzen jeden weiblichen Frosch mit 100 U Pregnant Mare Serum Gonadotropin (PMSG) von einem frisch zubereiteten 250 U / ml Lager. Verwenden Sie ein 3 ml Tuberkulin-Spritze mit einer 27 G-Nadel subkutan zu injizieren, mit der Schrägedie Nadel nach oben in die Rücken Lymphsack, die etwa 1 cm von der Mittellinie von der gekerbten Verfärbungen entlang der Länge der Schenkel des Strahls befindet.
- Shop grundiert Frösche im Wasser (plus 20 mM NaCl, siehe Sive et al. 33) bei 18 ° C für 5-10 Tage. Für stehende Wassertank-Systemen ist die Tierdichte etwa 4 l Wasser pro Weibchen Frosch. HINWEIS: Die Mindestzeit für die Grundierung wirksam werden benötigt 5 Tage, und die Auswirkungen der Grundierung tragen off nach 10 Tagen.
- Bereiten 0.5x Marc Geändert Ringers (MMR)-Lösung aus einer 20x MMR Lager. 20x MMR besteht aus 2 M Natriumchlorid, 40 mM Kaliumchlorid, 40 mM Calciumchlorid, 20 mM Magnesiumchlorid und 100 mM 4 - (2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure (HEPES), pH 7,4.
- Richten Sie Eimer für alle injiziert Frösche (ein Frosch pro 4 l Eimer). HINWEIS: Obwohl mehr als ein Frosch kann in der gleichen Eimer für Eiersammlung gebracht werden, wenn einer der Fröschelegt überwiegend schlechte Qualität Eier, wird ein erheblicher Aufwand erforderlich, um die schlechte Qualität Eier von denen, die für die Herstellung Extrakt sind zu trennen. Somit maximiert die Anzahl von Fröschen im gleichen Behälter, die Menge an Puffer zum Ei zu minimieren Collect ist das Risiko nicht wert.
- Inject 750 U Humanes Choriongonadotropin (HCG) in die dorsale Lymphsack jeder Frosch mit einer 27 G-Nadel, wie in 1.1.1 beschrieben.
- Legen Sie jede der HCG injiziert Frösche in einzelne 4 L Eimer enthält 0,5 x MMR abgekühlt auf 16 ° C
- Legen Sie die Behälter mit den Fröschen in einem 16 ° C-Inkubator, um Eier zu sammeln O / N (15-16 h). HINWEIS: Die Aufrechterhaltung der richtigen Temperatur ist entscheidend für das gesamte Verfahren, von der Erhebung der Vorbereitung Eier Ei-Extrakt.
- Dejellying Eier
HINWEIS: Die Eier werden mit einer Gallerthülle, die vor der Herstellung Extrakt entfernt werden müssen, abgedeckt. Die Wahrscheinlichkeit der spontanen Lyse der Eier als die Zeit zwische erhöhtn Eiablage und extrahieren Vorbereitung steigt. Somit ist es wichtig, durch die folgenden Schritte so schnell wie möglich ablaufen.- Herstellung von 4 l 1x MMR, 50 ml 0,1 x MMR, und 400 ml 2% Cystein, pH 7,7, in destilliertem Wasser hergestellt. Pflegen Sie alle Lösungen bei 16 ° C
- Um weitere Eier zu vertreiben, drücken Sie leicht den unteren Rücken und Bauch des Frosches.
- Entfernen Sie die Frösche und den Großteil der MMR, um die Eier in etwa 1-200 ml MMR in jedem Eimer zu verlassen.
- Entfernen Sie Schmutz mit einer Transferpipette und beurteilen die Qualität der Eier: hochwertige Eier werden in der Regel durch eine klare Trennung zwischen der dunkel pigmentierten Tier Hemisphäre und der leicht gefärbt pflanzlichen Hemisphäre markiert und haben die höchste Dunkel-Lichtkontrast. Entsorgen mit einer Transferpipette alle Eier, die sehnig, fleckige oder lysiert (weiß und geschwollen) erscheinen, wie sie die Qualität des Extraktes zu verringern. Wenn> 10% der Eier sind von schlechter Qualität, die gesamteBatch sollte verworfen werden.
- Kombinieren Sie Eier in einen 500-ml-Becherglas und gießen Sie so viel wie möglich MMR während Eier getaucht.
- Eier Spülen unter leichtem Schwenken mit dem doppelten Volumen der MMR-Ei. Zweimal wiederholen, und entfernen Sie Schmutz oder offensichtlich schlechte Qualität Eier.
- In ca. 100 ml 2% Cystein zu dem Becherglas, vorsichtig schwenken zu mischen und ermöglichen Eier für 5 min bei 16 ° C absetzen Gießen Sie die Cystein. HINWEIS: Dejellying wird durch die allmähliche Auftreten von Gelee Mäntel schweben über die Eier und der kompakteren Verpackung der Eier gekennzeichnet, wie sie jetzt ein kleineres Volumen einnimmt, ohne die Gallerthülle.
- In weiteren 100 ml 2% Cystein, schwenken, warten Sie 5 Minuten, und dann langsam abgießen Cystein. Wiederholen, bis Eier haben sich zu stark verdichtet (in der Regel von der dritten Cystein-Behandlung). Hinweis: Wenn Eier zu lange in Cystein übrig sind, anfällig für die Lyse sind sie. Ebenso sind dejellied Eier zerbrechlich und anfällig für mechanische Lyse, wenn siesind zu kräftig gewirbelt, oder wenn sie der Luft ausgesetzt sind. Nachdem die Eier wurden dejellied, ist es wichtig, schnell auf die Zentrifugation fortfahren.
- Abgießen Cystein und wegspülen das Gelee Mantel und andere Verunreinigungen durch leichtes Waschen Eier in 1x MMR. Gießen Sie Puffer sorgfältig an der Seite des Bechers. Zweimal wiederholen oder bis MMR-Lösung nicht mehr trüb. Während Spülen mit 1x MMR weiterhin die schlechte Eier zu entfernen mit einer Transferpipette.
- Eine abschließende schonendes Spülen mit 30 ml 0,1 x MMR, und vorsichtig abgießen, wie viel von dem Puffer wie möglich. Wieder, entfernen Sie alle natürlich schlecht Eier.
- Verpackung und Crushing Eier durch Zentrifugation
HINWEIS: Die unten beschriebenen Extrakt wird für β-Catenin-Abbau ist eine Variante des Zytostatikums Faktor-Extrakt (Metaphase II festgenommen). Im Gegensatz zu der Niedriggeschwindigkeits-und Hochgeschwindigkeits-Extrakt für die Zellzyklusstudien verwendet, Zwischengeschwindigkeit Extrakt besten für β-Catenin-Abbau. Ichnterphase Extrakt fördert ähnlich robust β-Catenin-Abbau ist zwar arbeitsintensiver, sich vorzubereiten.- In Leupeptin, Pepstatin, Aprotinin-Mischung (LPA, einem Protease-Inhibitor) bei 10 pg / ml und Cytochalasin D (aus einer 10 mg / ml Stammlösung in DMSO) bei 20 pg / ml (aus einer 10 mg / ml Stammlösung verdünnt in DMSO) in die verbleibenden 20 ml 0,1 x MMR.
- 0 hinzufügen. X MMR enthalten LPA und Cytochalasin D zu den gewaschenen Eier, vorsichtig schwenken und Inkubation für 5 min bei 16 ° C
- Übertragen Eier in 16 ° C vorgekühlte 50 ml Zentrifugenröhrchen, damit die Eier zu regeln, und entfernen Restpuffer von oben. Um an der Luft zu verhindern, in die Transferpipette zurückzutreten eine kleine Menge Puffer vor dem Abziehen Eier für die Übertragung. Weiterhin zusätzliche Eier in die Zentrifugenröhrchen übertragen und entfernen Restpuffer von der Spitze der Röhre, bis die Eier füllen die Zentrifugenröhrchen nach oben, was die Ausbeute zu maximieren wird vonextrahieren.
- Um die Eier, Spin Zentrifugenröhrchen bei 400 g für 60 Sekunden bei 4 ° C Packung mit einem Festwinkelrotor. Entfernen Restpuffer von der Spitze der Zentrifugenröhrchen.
- Für die Zerkleinerung Spin, Spin Röhrchen bei 15.000 × g für 5 min bei 4 ° C.
- Sammeln Cytoplasmic Schicht von Extract
HINWEIS: Die unten beschriebene Methode unterscheidet sich von der klassischen Methode der Punktion der Seite der Zentrifugenröhrchen, um die Zytoplasma-Schicht zu sammeln. Dieses Protokoll wurde zur Vereinfachung und für die Verwendung mit bestimmten Zentrifugenröhrchen, die wiederverwendbar sind, angepasst. Keine merkliche Unterschiede in der Kinetik der β-Catenin-Abbau sind entweder Verfahren gefunden. An diesem Punkt Extrakt sollte während des gesamten Prozesses kalt gehalten werden, und alle Schritte bei 4 ° C durchgeführt werden- Deaktivieren Sie ein Loch in die Lipidschicht mit Hilfe von P1000 Pipettenspitze.
- Sammeln Sie die Zytoplasma-Schicht (zwischen dem dunklen Pigmentschicht und der light Lipidschicht) mit einer neuen P1000 Pipettenspitze in saubere vorgekühlte Zentrifugenröhrchen (Abbildung 1). Für hochwertige Extrakt, robust abbaut β-Catenin, minimieren die Menge von pigmentierten und Lipidschicht, die mit der zytoplasmatischen Schicht abgezogen wird.
- Spin extrahiert zytoplasmatische Schicht bei 15.000 × g für 10 min bei 4 ° C und Sammeln der cytoplasmatischen Schicht wieder. Wiederholen Sie den Spin-und Extraktions 1X. HINWEIS: Der Extrakt sollte "strohfarben." Wenn es wesentliche Kontamination mit den pigmentierten und Lipidschichten an diesem Punkt kann man den Spin noch einmal zu wiederholen, obwohl übermäßige Spins wird die Kapazität des Extraktes auf β-Catenin abgebaut verringern.
- Hinzufügen LPA und Cytochalasin D, um den Extrakt in Endkonzentrationen von 10 ug / ml. HINWEIS: Mit dem beschriebenen Verfahren ergibt eine ziemlich konsequente Gesamtproteinkonzentration von ca. 50 mg / ml (52,41 ± 5,40 mg / ml, n = 3 separate Preps) in Xenopus zBg-Extrakten.
- (Optional) Für Übersetzungs Assays, fügen bedeckten mRNA (0,1 mg / ml), RNAsin (1,5 U / ml), und die Regeneration Energie-Mix (2.2.1) und Inkubation der Reaktion bei RT für 2 Stunden (für weitere Informationen siehe salischen et al. 33) al. 2 und Sive et. Verwenden Sie übersetzte Auszug sofort für β-Catenin-Abbau-Assays oder Snap-freeze in flüssigem Stickstoff für die spätere Verwendung. HINWEIS: Frisch hergestellte Extrakt hat eine hohe Fähigkeit, exogen zuge mRNA übersetzen, aber leider ist diese Fähigkeit verloren, sobald der Extrakt wird eingefroren. Capped-mRNA kann leicht unter Verwendung kommerziell erhältlichen Kits werden.
- Snap-Extrakt Einfrieren in flüssigem Stickstoff. HINWEIS: Extrakte werden in kleinen (200 ul) Aliquots für den einmaligen Gebrauch gespeichert werden, da sie schnell ihre Fähigkeit, β-Catenin, wenn wieder eingefroren verschlechtern. Für langfristige Lagerung kann Extrakt in flüssigem Stickstoff gelagert werden. Für Kurzzeitspeicher kann Extrakt bei -80 ° C gelagert werden, obwohl die Kapazität of-Extrakt zu β-Catenin abbauen können dramatisch mit längerer Lagerung reduziert werden bei -80 ° C (länger als 2 Monate).
2. Vorbereitung Extract für β-Catenin-Abbau-Assay
- Depletion von Xenopus-Extrakt
HINWEIS: Ein wesentlicher Vorteil des Xenopus-Extrakt ist die Fähigkeit, ohne weiteres verbrauchen Komponenten eines Weges und eine bestimmte Menge eines Proteins genau wieder hinzuzufügen, um die Dosis-abhängigen Effekte zu bestimmen.- Verwenden Sie frisch zubereitete Xenopus-Ei-Extrakt oder schnell auftauen gefrorenen Extrakt und auf Eis. Führen Sie alle Manipulationen in der Kälte.
- Add-Extrakt auf 1/10 des Volumens des pelle Antikörper oder Affinitätskügelchen (z. B. 20 ml Kügelchen pelletiert und 200 ml Extrakt). Zur Verdünnung des Extraktes zu minimieren, ziehen so viel Flüssigkeit aus den Perlen wie möglich vor der Zugabe des Extraktes mit Gel-Ladespitzen mit langen, sich verjüngenden Spitzen.
- Drehen Extrakt-Beadgemisch bei 4 ° C für 1 Stunde.
- Spin-Extrakt Beadgemisch bei 12.600 × g in Mikrozentrifuge bei 4 ° C für 30 sek. Alternativ, wenn Magnetkügelchen verwendet werden, gelten Magnetfeld, um Perlen zu sammeln.
- Überweisung erschöpft Extrakt zu einem frischen Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis. Seien Sie vorsichtig, keine Perlen mit dem Extrakt zu übertragen.
- Effizienz der Erschöpfung Bestätigen durch Immunoblotting sowohl abgereichertem Extrakt und Perlen.
- Bereiten Extrakt für β-Catenin-Abbau-Assay, wie in 2.2 beschrieben.
- Optimierung Xenopus Extrakt für β-Catenin-Abbau
HINWEIS: β-Catenin-Abbau in Xenopus-Ei-Extrakt ein energieabhängiger Prozess, schnell erschöpft das endogene ATP speichert. Folglich wird ein Energierückgewinnungssystem erforderlich, um robuste β-Catenin-Abbau zu erhalten.- Bereiten Sie eine 20x Energie-Rückgewinnung (ER)-Mix, bestehend aus 150 mM Kreatinphosphat, 20 mM ATP, 600 ug / ml Creatinphosphokinase,und 20 mM MgCl 2. ER sollte aliquotiert und bei -80 ° C gelagert werden Vermeiden Sie wiederholte Einfrieren / Auftauen von eingefrorenen Aliquots mit kleinen.
- Tauen schnell Xenopus-Ei-Extrakt durch Reiben der gefrorenen Röhre zwischen den Händen. Das Röhrchen auf Eis unmittelbar bevor der gesamte Extrakt wurde geschmolzen.
- Werden 10 ul Energierückmischung (20x ER) in einem Aliquot (200 ul) von Xenopus-Ei-Extrakt. Gründlich mischen durch schnippen schnell den Schlauch und Impuls Verwirbelung. Pulse-Spin und sofort auf Eis legen.
- (Optional) Der Umsatz von β-Catenin kann etwas in Xenopus-Ei-Extrakt durch Zugabe von Ubiquitin (1,25 mg / ml final) verbessert werden. Cycloheximid (0,1 mg / ml Endkonzentration) zugesetzt werden, um die Translation endogener Transkripte zu minimieren.
- Aliquot die entsprechenden Volumina für den Abbau-Assay in vorgekühlte Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis. Für radioaktiv markiertem β-Catenin-Abbau-Assays, zurückzutreten 2-5 ml für jeden Zeitpunkt zu extrahieren. </ Li>
3. Radioaktiv markierte β-Catenin-Abbau-Assay in Xenopus-Ei-Extrakt
HINWEIS: Alle Schritte sollten auf Eis durchgeführt, sofern nicht anders angegeben.
- Vorbereiten Radioaktiv markierte β-Catenin
- Vorbereitung frisch in vitro synthetisierten [35 S]-Methionin radioaktiv markiertes Protein unter Verwendung von kommerziell erhältlichen Kits. HINWEIS: Generieren 35 S-markierten (Halbwertszeit 87 Tage) Proteine leicht und effizient unter Verwendung von im Handel erhältlichen in vitro gekoppelten Transkriptions-Translations-Kits hergestellt. Es ist wichtig, dass das translatierte Protein ausreichend markiert, so daß Veränderungen in den Proteinumsatz leicht sichtbar gemacht werden kann.
- Um erfolgreich zu radioaktiven Markierung bestätigen, führen SDS-PAGE/autoradiography mit 0,5 ul des übersetzten Protein. Quantifizierung der Intensität der radioaktiv markiertem β-Catenin-Band mit ImageJ, Imagequant oder eine alternative quantitative Software progrbin. HINWEIS: Die radioaktiv markierten β-Catenin-Protein-Bande sollte in wenigen Stunden (4-6 Std.) auf dem Film deutlich sichtbar sein.
- Schnapp Einfrieren der radioaktiv markierten Protein in flüssigen Stickstoff für die Lagerung bis zur Verwendung. Hinweis: Längere Lagerung (> 2 Monate) und mehrfaches Einfrieren / Auftauen (größer als 2) erheblich beeinträchtigen kann die Kapazität des radioaktiv markierten β-Catenin zu robust in Xenopus-Ei-Extrakt abzubauen. Typischerweise wird die Stabilität der radiomarkierten Proteine sinkt signifikant nach 1 Monat Lagerung bei -80 ° C; somit relativ frisch zubereitet radioaktiv markiertem β-Catenin liefert die besten Ergebnisse in dieser Abbau-Assays.
- Darstellende β-Catenin-Abbau-Assay
- In 1-3 ul (abhängig von der Stärke des radioaktiv markierten Bandsignal) von in-vitro-übersetzte β-Catenin (und andere Proteine, kleine Moleküle usw., die getestet werden) in 20 ul Xenopus-Reaktionsmischung auf Eis. Gründlich mischen quickly Dazu den Schlauch und einen kurzen Impuls von Wirbeln; dies ist ein wichtiger Schritt, da Xenopus-Ei-Extrakt ist sehr viskos, und unvollständiges Mischen wird die Konsistenz der Ergebnisse zu beeinträchtigen. Pulse Spin und auf Eis stellen.
- Starten Sie den β-Catenin-Abbaureaktion durch Verschieben der Rohre auf RT.
- Zum festgelegten Zeitpunkt, entfernen Sie 1-5 ml der Probe und sofort mischen mit SDS-Probenpuffer (5x Volumen), um die Reaktion zu stoppen. Um sicherzustellen, dass die Abbaureaktion ist vollständig beendet, Röhrchen klopfen mehrmals und kräftig vortexen.
- Führen SDS-PAGE/autoradiography. Führen Sie 1 ml-Äquivalente (~ 50 mg Protein) des Extraktes für jeden Zeitpunkt / Spur. Abbau von β-Catenin in Xenopus-Ei-Extrakt sollte durch die zeitabhängige Abnahme der Intensität der radioaktiv markierten β-Catenin-Band Abbildung 2 nachgewiesen werden. Quantifizierung Ergebnisse mit ImageJ, Imagequant oder anderen bevorzugten Bildbearbeitungssoftware, wenn nötig.
- (Optional) Tränken SDS-Polyacrylamid-Gel in Fixierlösung (10% Essigsäure und 30% Methanol in destilliertem Wasser) vor dem Trocknen, um Hintergrundradioaktivität zu verringern und die Qualität des Bildes.
4. Β-Catenin-Luciferase-Assay-Abbau in Xenopus-Ei-Extrakt
Führen Sie alle Schritte auf Eis, es sei denn anders angegeben.
- Vorbereiten β-Catenin-Luciferase-
- Synthetisieren, nicht-radioaktiv markierten, Luciferase-markierten β-Catenin mit der Transkriptions-Translations-System gekoppelt mit vollständigen Aminosäuremischung.
- Herstellung des Luciferase-markierten β-Catenin durch Messung der Luciferase-Aktivität von 0,5 bis 1 &mgr; l der Reaktion zu bestätigen. Bewerten Hintergrund Lumineszenz durch Messung der Lumineszenz von einem nicht übersetzten Reaktionsmischung. HINWEIS: Mehrere kommerzielle Kits sind für die Messung Luciferase-Aktivität zur Verfügung. Langlebige Lumineszenz, jedoch funktioniert besonders gut für den Abbau assay.
- Darstellende β-Catenin-Luciferase-Assay-Abbau
- Auftauen und bereiten Xenopus-Ei-Extrakt, wie in 2.2.
- In in vitro-übersetzte β-Catenin-Luciferase-Fusions (ab 4.1) in vorbereitete Xenopus-Reaktionsgemisch (2,2) auf Eis und gut mischen, wie in 3.2.1. HINWEIS: Die Aktivität der β-Catenin-Luciferase, die zu dem Extrakt zugegeben wird, ist typischerweise zwischen 20 - 50.000 relativen Lumineszenz-Einheiten (RLU) / ml des Extrakts (basierend auf Messungen 4.1.2) erhalten. Startschuss sollte ungefähr 100.000 RLU (2-5 ml der in vitro-übersetzte β-Catenin-Luciferase-Fusions) sein.
- Verschieben Sie den Extrakt auf RT , um die Abbaureaktion zu starten.
- Entfernen Sie einen aliquoten Teil der Reaktion in der angegebenen Zeit und Snap-in flüssigem Stickstoff einfrieren. HINWEIS: Dreifachproben werden typischerweise zur Analyse entfernt für jeden Zeitpunkt. Gefrorene Extrakt kann bei -80 ° C gelagert werden, until sie bereit sind, analysiert werden.
- Tauwetter Eis-Proben, Proben Übertragung auf Standard-Weiß 96-Well-Platten auf Eis, und ein Verfahren zur Luciferase-Aktivität.
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Representative Results
Eine schematische Darstellung des β-Catenin-Abbau in Xenopus-Ei-Extrakt ist in 2A gezeigt. 35 S-markierten β-Catenin wurde in Xenopus-Ei-Extrakt inkubiert wurden Aliquots (1 ml Extrakt Äquivalent) zu den entsprechenden Zeiten entnommen und die Proben wurden einer SDS-PAGE, gefolgt von Autoradiographie. β-Catenin Abbau von Komponenten des Wnt-Signalwegs durch das Ubiquitin-Proteasom-System 2 vermittelt wird, und den Abbau von [35 S]-radioaktiv markierten β-Catenin in Xenopus-Extrakt wird durch Zugabe der Proteasom-Inhibitor MG132 2B gehemmt. Abbau von β-Catenin durch Komponenten des Wnt-Signalwegs ist abhängig von ihrer Phosphorylierung durch GSK3 34. GSK3-abhängigen Abbau kann ohne weiteres auf verschiedene Weise unter Verwendung von Xenopus-Ei-Extrakt nachgewiesen werden: 1) die β-Catenin (SA)-Mutante (GSK3 Phosphorylierungsstellen mutiert Alanine) in Xeno stabilisiertenEiter Ei-Extrakt im Vergleich zu Wildtyp-β-Catenin-Protein 2B. 2) Niedermolekulare Inhibitoren von GSK3 (LiCl) in ähnlicher Weise hemmen Abbau von β-Catenin (Abbildung 2C). 3) Schließlich Erschöpfung der GSK3 aus Xenopus-Ei-Extrakt hemmt Abbau von β-Catenin; Abbau kann durch die Zugabe von exogenen GSK3 gerettet Fig. 2D-E.
Das radioaktiv markierte β-Catenin-Abbau-Assay bietet eine besonders informative visuelle Beurteilung des Modus der Abbau (dh Ubiquitin-vermittelten Abbau gegenüber apoptotischen Spaltung). Autoradiographie ist jedoch arbeitsintensiv, und in den meisten Fällen, für die Hochdurchsatzanalyse der Bahn begrenzt (z. B. Screening auf niedermolekulare des Wnt-Signalwegs). Die β-Catenin-Luciferase-Abbau-Test ist einfacher und schneller als quantifizierbare Menge der Lumineszenz emittiert wird, ist direkt proportional zu der Uhrount von β-Catenin-Luciferase-Proteins. Diese Eigenschaft macht die Luciferase-Assay einfach und ohne weiteres für den Hochdurchsatz-Assays.
Es ist wichtig festzustellen, dass die Luciferase-Fusions hat ähnliche Eigenschaften wie die der Nicht-Fusions-Protein. Dies kann empirisch durch Verschmelzen des Luciferase-Proteins an den N-Terminus, C-Terminus oder intern bestimmt werden. Fusion der Luciferase an das N-oder C-Terminus von β-Catenin keine Auswirkung auf ihre Fähigkeit, Wnt-Zielgene in Xenopus-Ei-Extrakt 2, 19, 20 inkulturiert Säugerzellen oder ihrer Umsatzrate zu aktivieren.
Eine repräsentative β-Catenin-Luciferase-Assay-Abbau in Xenopus-Ei-Extrakt ist in Fig. 3A gezeigt, in dem Abbau von β-Catenin-Luciferase wurde durch SDS-PAGE/autoradiography des radioaktiv markierten Protein und Luziferase-Aktivität des Fusions bewertet. Die Rate der degradation der β-Catenin-Luciferase ist ähnlich der unmarkierte β-Catenin-Protein. Die Regelung des Abbaus für die β-Catenin-Luciferase-Fusion ist im wesentlichen identisch mit dem Nicht-Fusions-Protein, wie die Zugabe von LiCl oder Abreicherung von GSK3 führte zu einer Hemmung der β-Catenin-Luciferase-Umsatz. Wie in den Figuren 3B-C gezeigt ist, Änderungen des radioaktiven Signals der β-Catenin-Protein Luciferase parallel zu den Veränderungen in Luciferase enzymatischer Aktivität über die Zeit. Ein Problem, das von der Nutzung β-Catenin-Luciferase-(insbesondere aus dem in vitro Transkriptions-Translations-System erzeugten Fusionsprotein) entsteht, ist der Hintergrund Luciferase-Signal durch die Verwendung von internen Translationsstartstellen oder vorzeitige Beendigung translationale Abbildung 3D verursacht. Dieses Problem kann manchmal durch die Optimierung der DNA-Konzentration in der IVT-Reaktion verwendet überwunden werden. Wir haben jedoch nicht zu beobachten einen Rückgang im Hintergrund Luciferase-Aktivität, wenn wir variiertdie Plasmid-DNA-Konzentration für unsere besondere β-Catenin-Luciferase-Konstrukt. Es ist wahrscheinlich, dass wir brauchen, um das Fusionsprotein über Mutagenese, um weiter zu minimieren interne Translationsstartstellen und / oder vorzeitige Beendigung des Translations β-Catenin-Luciferase-Fusionsprotein überarbeiten. Da die Luciferase-Protein über den Zeitverlauf der Abbaureaktion in Xenopus-Ei-Extrakt 3A relativ stabil, aber diese Hintergrundsignal kann einfach abgezogen, wenn das Verhältnis des Kegel Luciferase-Protein der vollen Länge β-Catenin-Fusions bekannt ist .
Eine Stärke des Luciferase-Assay ist die Fähigkeit, auf einer Multi-Well-Format, das zur Durchführung von Hochdurchsatz-Screening auf Modulatoren von β-Catenin-Abbau ermöglicht skalieren. In Fig. 4 ist eine repräsentative Schachbrettanalyse unter Verwendung eines Inhibitors der β-Catenin-Abbau, MG132, der verhindert gezeigte Proteasom. Das Ergebnis des Schachbrettexperiment zeigt, daß der Assay ist einheitlich und reproduzierbar in einer 96-Well-Format und zeigt die Eignung für High-Throughput-Screening.
Abbildung 1. Eine schematische Darstellung der Herstellung von konzentriertem Xenopus-Ei-Extrakt. Eier werden von HCG-injizierten Xenopus laevis Weibchen gesammelt, verdichtet mit einem Low-Speed (400 × g) Spin, und zerkleinert und mit einem mittel-Geschwindigkeit (15.000 xg getrennt ) Spin. Achten Sie darauf, subkutan in die dorsale Lymphsack injizieren, entfernen Sie die faulen Eiern sorgfältig und vorsichtig die hochwertige Zytoplasma-Extrakt aus der unteren Qualität dunkler Extrakt wie im Text erwähnt.
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2. Β-Catenin verschlechtert robust, wenn sie in Xenopus-Ei-Extrakt. A) inkubiert schematisch eine Abbautest. B) [35 S]-markierten β-Catenin mit einem IVT-Reaktion hergestellt robust verschlechtert, wenn sie in Xenopus-Ei-Extrakt inkubiert. Zugabe von MG132 (200 uM), um Xenopus-Ei-Extrakt hemmt die β-Catenin-Abbau. Mutation Alanine der GSK3 PhosphoSites in β-Catenin (β-Catenin SA) oder die Zugabe von LiCl (25 mM) C) hemmt, β-Catenin-Abbau. D) Die GSK3-Bindungsstelle des Axin (Aminosäuren 506-560) effizient verbraucht GSK3 aus Xenopus-Ei-Extrakt. E) GSK3-verarmten Xenopus-Ei-Extrakt hemmt die β-Catenin-Abbau und kann durch Zugabe o gerettet werdenf rekombinanten GSK3 (0,1 mg / ml). Die Zugabe von LiCl (25 mM) blockiert die Fähigkeit von rekombinanten GSK3 an β-Catenin-Abbau in GSK3-verarmten Extrakt zu retten. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
Abbildung 3. Luciferase-markierten β-Catenin abbaut, wenn in Xenopus-Ei-Extrakt inkubiert. A) Radioaktiv markierte β-Catenin-Luciferase abbaut mit einer Rate ähnlich der unmarkierte β-Catenin-Protein. Wie mit dem Wildtyp-Protein, die Zugabe von LiCl (25 mM) hemmt die β-Catenin-Luciferase-Abbau. Luciferase allein nicht merklich umdrehen in Xenopus-Ei-Extrakt. Änderungen der Luciferase-Aktivität der β-Catenin-Luciferase Fusions parallel zu den Veränderungen in der Proteinspiegel. b) Zugabe von LiCl (25 mM) oder Abreicherung von GSK3 C) hemmt, β-Catenin-Luciferase-Umsatz durch Messung der Luciferase-Aktivität. beurteilt D) Immunoblotting in vitro translatierten β-Catenin- Luciferase (unter Verwendung eines Anti-Luciferase-Antikörper) ergab signifikante Mengen an freien Luciferase-Protein in bestimmten Preps, die wahrscheinlich trägt zur höheren Hintergrund im Vergleich zu den radioaktiv markierten Abbau-Assay. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
Abbildung 4. Geregelter Abbau von β-Catenin-Luciferase in Xenopus-Extrakt kann angepasst werdenein Hochdurchsatzformat. Eine repräsentative Schachbrettanalyse für β-Catenin-Luciferase mit MG132 (450 &mgr; M) als ein Inhibitor der β-Catenin-Abbau. Schattige Spalten geben MG132-behandelten Vertiefungen, Spalten und leichter darstellen Vehikel (DMSO) behandelten Brunnen. Quantifizierung und Z-Faktor-Berechnungsergebnis in einer Kerbe von 0,3 angibt, eine annehmbare Assay zur möglichen Verwendung in Hochdurchsatz-Screening.
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Discussion
Xenopus-Ei-Extrakt ist ein robustes System für die Untersuchung von biochemischen β-Catenin-Umsatzes. Die Konzentration von β-Catenin in Xenopus-Ei-Extrakt 25 ~ 2 nM. Unter optimalen Bedingungen ist die Ei-Extrakt, der zum Abbau β-Catenin mit einer Geschwindigkeit von 50-100 Nm / h und ist halb-maximal bei 200 nM 24. Es gibt mehrere wichtige Schritte für eine erfolgreiche Wiederherstellung der β-Catenin-Abbau unter Verwendung von Xenopus-Ei-Extrakt. Dazu gehören 1) die Erstellung hochwertiger Xenopus-Ei-Extrakt und die Art und Weise, durch die Ei-Extrakt hergestellt wird, 2) Erzeugen Qualität radioaktiv markiertem β-Catenin und β-Catenin-Luciferase-Protein, 3) Optimierung der Reaktionsbedingungen zu β-Catenin-Abbau zu unterstützen, und 4 ) ordnungsgemäße Verarbeitung von Reaktionszeitpunkten.
Eine qualitativ hochwertige Herstellung von Xenopus-Ei-Extrakt, in dem β-Catenin ist robust abgebaut hängt sowohl von der Qualität der the Eier und die Eier vor dem Zerkleinerungsschritt sowie, wie der Extrakt wird anschließend zentrifugiert, um den endgültigen Extrakt zu erhalten behandelt. Wie im Protokoll erwähnt, ist es wichtig sicherzustellen, dass nur qualitativ hochwertige Eier (von scharfen Kontrast zwischen der dunklen Hemisphäre und Tier Licht pflanzliche Hemisphäre belegt) eingesetzt werden, dass schlechte Qualität Eier (sehnig, gesprenkelt, oder weiße Windbeutel) sind in ganz entfernt der Prozess, dass die Eier in einer kühlen Temperatur (16 ° C) während des gesamten Verfahrens beibehalten wird, und dass das Verfahren so schnell wie möglich durchgeführt. Es ist wichtig, nicht die Qualität für die Extraktmenge zu opfern. Zusätzlich ist, wie bereits erwähnt, Eier von einem Frosch, der schlechten Qualität Eier (> 10%) legt sollte ganz verworfen werden.
Die oben beschriebene Extrakt ist eine Modifikation der Meiose II-CSF Extrakt 11 verhaftet. Die Herstellung von Xenopus-Ei-Extrakt für β-Catenin-Abbau (Zwischendrehzahl-Extrakt) difften von klassischen Extrakte zur Untersuchung von Zell-Zyklus 30-32 vorbereitet, die Low-Speed-oder High-Speed-Extrakte sind 35. Anpassung Xenopus-Ei-Extrakt für optimale Abbau anderer Proteine können verlangen Änderung der Zentrifugation Geschwindigkeit und Anzahl von Spins. Low-Speed-Extrakt enthält intakte Organellen und andere große zelluläre Komponenten. Somit wird eine höhere Geschwindigkeit dreht die Zusammensetzung des Extrakts zu verändern und möglicherweise entfernen hemmende und / oder wesentliche Komponenten, die den Abbau des Proteins von Interesse beeinflusst wird. Die Herstellung der Zwischengeschwindigkeit Extrakt beschrieben wird für den Abbau von β-Catenin durch Komponenten des Wnt-Signalwegs optimiert. Spinnen der Extrakt mehr als 4X kann die Kapazität des Extraktes auf β-Catenin verschlechtern deutlich verringert (obwohl sie eine minimale Wirkung auf den Abbau von anderen Wnt-Komponente, Axin hat). β-Catenin ist anfällig für Caspase-vermittelten Proteolyse in Low-Speed-Spin-Extrakt und nicht noticeably degradieren in High-Speed-Spin-Extrakt. Somit ist es wahrscheinlich, dass unterschiedliche Drehzahl-Extrakte werden optimal für den Abbau der Komponenten des anderen Signalwege sein.
Die Erzeugung von 35 S-β-Catenin und β-Catenin-Luciferase kann unter Verwendung einer Anzahl von im Handel erhältlichen Kits werden. Protein-Produktion mit Transkriptions-Translations-gekoppelte Systeme ist stark abhängig von der Qualität der Plasmid: hochreines Midi-Präparationen von Plasmiden funktionieren besser und sind zuverlässiger im Vergleich zu DNA-Mini-Präparationen. Zur radioaktiven Markierung von β-Catenin, frisch erhalten [35 S] Methionin oder Translabel ([35 S]-Methionin und [35 S]-Cystein) ist bevorzugt. Beachten Sie, daß Methionin und Cystein beide haben eine Tendenz, mit einer längeren Lagerung abnimmt, wodurch ihr Einbau in die β-Catenin in den in vitro Transkriptions-Translations-gekoppelten Reaktion zu oxidieren. Aufgrund längerer Lagerung und wiederholtes Einfrieren und AuftauenZyklen Abbau hemmen, werden kleine Mengen des radioaktiv markierten β-Catenin in einer Zeit hergestellt und kurz danach eingesetzt.
Die Menge an Protein translatiert und die Zahl der Methioninreste im Protein bestimmen die Stärke des radiomarkierten Signal. Für β-Catenin, sollte es keine Probleme Erhalt stark radioaktiven Signale für den Abbau Assays. Für Proteine mit wenigen Methionin und / oder diese nicht gut zu übersetzen, zu einem [35 S]-Methionin und [35 S] Cystein-Mix statt [35 S]-Methionin-und / oder Mehr ein Epitop-Tag (Myc), die mehrere enthält werden Methionin. Obwohl erfolgreich mit verschiedenen Expressionsplasmiden, die die geeigneten Phagen-Promotoren (T7, T3 und SP6) können für die in vitro Transkriptions-Translations-Reaktionen erhalten werden, pCS2-basiertes Plasmid in der Regel die besten Ergebnisse. Darüber hinaus wird das Signal des translatierten Proteins manchmal dramatisch durch Löschen des endogenen 5 erhöht werden'UTR. Schließlich ist für Großversuche (zB Hochdurchsatz-Screening), kann eine große Menge der rekombinanten β-Catenin-Luciferase erforderlich. β-Catenin-Luciferase aus dem Sf9 / Baculovirus-System nimmt mit ähnlichen Kinetik wie der Wildtyp-β-Catenin in Xenopus-Embryonen-Extrakt und 2. Alternativ kann ein hoher Ausbeute in vitro-Expressionssystem (z. B. Weizenkeim-Basis) wurde erfolgreich für Hochdurchsatz-Screening 19, 20 verwendet.
Um zuverlässig zu messen den Abbau von β-Catenin in den Extrakt-Systems ist es wichtig, dass das Anfangssignal entweder von dem radioaktiv markierten β-Catenin und dem Luciferase-β-Catenin-Fusions ausreichend robust ist. Somit eine gewisse Menge von Optimierungs vom Experimentator von der Größe des Abbaus Assay wird die Anzahl der Zeitpunkte benötigt, und die Effizienz der in vitro-Translationsreaktion will erforderlich. Bei der Montage der Abbaureaktion, gibt es mehrere Schritte, die man ergreifen kann, um die Chancen auf eine robuste Abbau zu verbessern. Erstens sollten alle Reagenzien schnell aufgetaut und vor der vollständigen Auftauen auf Eis gelegt werden. Da der Abbau von β-Catenin ist sehr energieabhängig ist, ist es wichtig, dass die ER relativ frisch. Zweitens ist Xenopus-Ei-Extrakt viskosen, und es ist wichtig, daß die Reaktion sorgfältig gemischt nach Zugabe des radioaktiv markierten Fusions β-catenin/β-catenin-luciferase, ER, Protein, kleines Molekül Modulatoren usw. Drittens vorge Inkubieren des Reaktions mischen für 20-30 Minuten auf Eis gibt mehr reproduzierbare Ergebnisse bei der Prüfung von Auswirkungen des niedermolekulare.
Die Fähigkeit, Proteine aus Xenopus-Ei-Extrakt Abbau stellt ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Proteinfunktion und ihre Konzentration abhängige Effekte zu beurteilen. Als Beispiel zeigen wir, dass abbau GSK3 von Xenopus Eiextrakt blockiert den Abbau von β-Catenin, was die wichtige Rolle von GSK3 in β-Catenin-Umsatz. Verschiedene Verarmungsbedingungen müssen empirisch für verschiedene Proteine bestimmt werden. So wird beispielsweise vorkommenden Proteine eine Erhöhung der Menge an Antikörper oder Affinitätsliganden Perlen verwendet werden, um vollständige Verarmung erreichen müssen. Ein guter Ausgangspunkt ist, verpackt Perlen bei 1/10 des Volumens des Extraktes, um Extraktverdünnungs minimieren. Zusätzlich zu der Stärke der Bindung des Antikörpers / Affinitätsliganden an das Zielprotein, der Art von Kügelchen (zB Sepharose, Agarose oder magnetisch) verwendet werden können, beeinflussen die Effizienz der Proteinabbau aus Xenopus-Ei-Extrakt 36. Schließlich wäre es ideal, um das Ausmaß der Erschöpfung (typischerweise durch Immunoblotting) analysieren. Sobald die β-Catenin-Reaktion abgeschlossen ist, kann die Art, in der die Proben verarbeitet großen Einfluss auf die Ergebnisse des Experiments. Die KonzentrationXenopus-Ei-Extrakt Preps in der beschriebenen Weise hergestellt wird, ist 52,41 mg / ml ± 5,40 mg / ml, und es ist wichtig, die Kapazität des SDS-PAGE-Gel überlasten; dies ist kein Problem mit dem Luciferase-β-Catenin-Assay. So kann zu jedem Zeitpunkt nicht mehr als 1 ml, entsprechend der Extrakt sollte in jeder Bahn eines SDS-PAGE-Gel geladen. Zur weiteren Verbesserung der Qualität der Ergebnisse wird das Gel Fixierungsschritt (optional) Hintergrund-Radioaktivität zu verringern und das Signal-zu-Rausch-Verhältnis. Für den Luciferase-Assay, eine Verringerung von einem Ausgangssignal von 100.000 RLU in Xenopus-Ei-Extrakt getreu widerspiegelt die Veränderung der Proteinspiegel des β-Catenin-Luciferase-Fusionsprotein.
Das Xenopus-Ei-Extrakt System ein attraktives System zur Regulierung der β-Catenin-Abbau zu untersuchen. Der Extrakt System ermöglicht die genaue Steuerung der Konzentration einzelner Proteine mittels Verarmungs und Rekonstitution tion. Die Fähigkeit, ihre Auswirkungen auf die Kinetik der β-Catenin-Umsatz über die Zeit überwachen können für ein besseres Verständnis der biochemischen Mechanismus dieser entscheidende Schritt in Wnt-Signaltransduktion. Solche Manipulationen haben tiefen Einblick in die komplexen molekularen Wechselwirkungen zwischen den Komponenten des Wnt-Signalwegs zur Verfügung gestellt und waren entscheidend für die Entwicklung des ersten mathematischen Modell der Wnt-Signalweg 24. Ein Nachteil ist, dass die Konzentrationen der Wnt-Signalweg-Komponenten in Xenopus-Ei-Extrakt und Säugetier Zelllysate gefunden zu unterscheiden, was möglicherweise auf Unterschiede in der Art der Wnt-Signalweg ist während der Embryogenese gegenüber dem erwachsenen Situation 37 geregelt. Die Fähigkeit, sowohl radioaktiv und enzymatische, Luciferase-basierte Assays mit Xenopus-Ei-Extrakt durchzuführen bietet zusätzliche leistungsstarke ergänzende qualitative und qualitative Instrumente für die Untersuchung der biochemischen Regulation der β-Catenin-Abbau.
t "> Neben der Überwachung des Umsatzes von β-Catenin, kann eine Verschlechterung der negativen Wnt Regler, Axin, in Xenopus-Ei-Extrakt entweder als radiomarkierte Protein oder Fusions auf Luciferase überwacht. Verwendung einer Variante von Luciferase, Renilla, ankondensiert Axin, wurde zuvor für die Luciferase-Assay-Abbau in einem Hochdurchsatz-Format gleichzeitig Bildschirm für Modulatoren von zwei Wnt-Proteine, β-Catenin und Axin 19, 20 angepasst. Diese biochemischen Screen identifiziert die von der FDA zugelassene Medikament, pyrvinium, die erhöht und verringert die Abbaugeschwindigkeit von β-Catenin und Axin jeweils in Xenopus-Ei-Extrakt 19. Pyrvinium wurde anschließend in kultivierten menschlichen Zellen und in verschiedenen Modellorganismen (z. B. Xenopus und C. elegans) als ein niedermolekularer Inhibitor des Wnt validiert Weges. Zusammenfassend ist die Xenopus-Ei-Extrakt ein vielseitiges System biochemischen Systems that kann in einer Vielzahl von Möglichkeiten, um den Mechanismus der Wnt-Signal sowie zur Identifizierung von Kleinmolekül-Modulatoren des Wnt-Signalwegs studieren nutzt werden. Die hierin beschriebenen biochemischen Verfahren auf andere Signalwege in dem Proteinabbau kann eine kritische Rolle spielen, eingesetzt werden.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.
Acknowledgments
Wir danken Laurie Lee für das kritische Lesen des Manuskripts. TWC wird von einem American Heart Association Promotionsstipendium (12PRE6590007) unterstützt. MRB wird von einem National Cancer Institute Ausbildungsförderung (T32 CA119925) unterstützt. SSH ist National Institutes of Health (R01DK078640) unterstützt. EL wird von den National Institutes of Health (R01GM081635 und R01GM103926) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) | ProSpec | hor-272-A | Reconstituted with distilled water before use. |
| Human chorionic gonadotropin | Sigma | CG10-10VL | |
| Potassium chloride | Fisher | BP366-1 | |
| Sodium chloride | Research Products International | S23020-5000.0 | |
| Magnesium chloride | Fisher | BP214-500 | |
| Calcium chloride | Acros Organics | AC42352-5000 | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Cysteine | Acros Organics | AC17360-1000 | |
| Leupeptin | Sigma | L2884-10MG | |
| Aprotinin | Sigma | A1153-10MG | |
| Pepstatin | Sigma | P4265-5MG | |
| Cytochalasin B | Sigma | C8273-10MG | |
| 3 ml syringe: Luer Lock tip | Becton Dickinson | 309657 | |
| 27 G needle | Becton Dickinson | 305109 | |
| 96 well solid white polystyrene microplate, round bottomed | Corning | 3605 | |
| Steady-Glo luciferase assay system | Promega | E2520 | Store long-term at -80 °C, can store for up to 1 month at -20 °C |
| TNT Sp6 coupled reticulocyte lysate system | Promega | L4600 | |
| TNT Sp6 high-yield wheat germ protein expression system | Promega | L3260 | Generally higher yield than reticulocyte lysate |
| EasyTag Express protein labeling mix [S35] | Perkin Elmer | NEG772007MC | |
| Creatine phosphate | Sigma | 27920-5G | |
| ATP | Sigma | A2383-5G | |
| Creatine phosphokinase | Sigma | C3755-35KU | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418-50ML | |
| Dual-Glo luciferase assay system | Promega | E2920 | Same storage conditions as Steady-Glo |
| 50 ml Centrifuge tubes | Fisher Scientific | 0556214D | |
| Sorvall SS-34 fixed angle rotor | Thermo Scientific | 28020 | |
| 115 V 50/60 Hz Minicentrifuge | Fisher Scientific | 05-090-128 | |
| mMessage mMachine Sp6 kit | Ambion | AM1340 | |
| Anti-firefly luciferase antibody | Abcam | ab16466 | |
| Anti-GSK3 antibody | BD Transduction Laboratories | 610201 | |
| FLUOStar Optima | BMG Labtech | ||
| Sorvall RC-6 Plus centrifuge | Thermo Scientific | ||
| 16 °C Incubator | Percival Scientific |
References
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