Summary
Метод описан для анализа деградацию белков с использованием, меченные радиоактивным изотопом и люциферазы-слитые белки в Xenopus экстракта яичного и его адаптации для высокопроизводительного скрининга для малых молекул модуляторов деградации белков.
Abstract
Xenopus Laevis яйцо экстракт является хорошо характеризуется, надежная система для изучения биохимии различных клеточных процессов. Xenopus яйцо экстракт был использован для изучения белкового обмена во многих клеточных контекстах, в том числе клеточного цикла и путей передачи сигнала 1-3. В данном случае описан способ выделения Xenopus экстракт яйца, который был оптимизирован, стимулирующей деградацию критического компонента Wnt пути, β-катенина. Два описаны различные методы для оценки степени деградации белка β-катенина в Xenopus яичного экстракта. Один метод визуально информативным ([35 S]-меченного радиоактивным изотопом белки), а другой более легко масштабируется для высокой пропускной анализов (люциферазы светлячка-меченый слитых белков). Методики, описанные может быть использован, но не ограничиваются ими, оценивать оборот β-катенина белка и определить молекулярные компоненты, способствующие его оборота. Кроме того, Абилность для очистки больших объемов однородной Xenopus экстракта яичного сочетании с количественной и легкому считывания люциферазы с метками белков позволяет эта система, чтобы быть легко адаптированы для высокопроизводительного скрининга для модуляторов деградации β-катенина.
Introduction
Xenopus Laevis яйцо экстракт широко используется для изучения многих биологических процессов клеток, включая динамики цитоскелета, ядерной сборки и импорта, апоптоз, убиквитиновой метаболизма, клеточного цикла, передаче сигналов и оборота белка 1-17. Xenopus яйцо система экстракт поддается биохимическом анализе легионом клеточных процессов, потому что экстракт яйцо представляет по существу неразбавленного цитоплазму, содержащую все необходимые цитоплазматические компоненты, необходимые для выполнения этих процессов и позволяют расследование. Большие количества экстракта яичного могут быть получены в свое время для биохимических манипуляций, которые требуют большого количества материала (например, очистки белков или высокопроизводительного скрининга) 18-20. Другим преимуществом является то, что концентрация определенных белков в Xenopus яичного экстракта может быть точно регулировать добавлением рекомбинантного белка и / или immunodepletion из endogтиазом белки в отличие от трансфекции плазмидной ДНК, где экспрессия белка, представляющего интерес трудно контролировать. Кроме того, отсутствие доступных рекомбинантных белков могут быть преодолены путем добавления транскриптов, кодирующих белок, представляющий интерес, пользуясь большой емкости свежеприготовленного Xenopus яйцо сухих веществ перевести экзогенно добавленные мРНК.
Регулирование деградации белка имеет решающее значение для борьбы со многими клеточных путей и обрабатывает 21. Xenopus яйцо экстракт широко используется для изучения деградации белка, так как система позволяет несколько способов мониторинга белкового обмена, не смешивая влияния транскрипции и трансляции. Сигнальный путь Wnt является высоко консервативным сигнальный путь, который играет важнейшую роль в развитии и болезней. Оборот β-катенина, основной эффектор пути Wnt, является объектом жесткого регулирования, и увеличение установившегося состоянии ДEvel из β-катенина имеет решающее значение для активации Wnt генов-мишеней. Важность деградации β-катенина выделен тем, что мутации в пути Wnt, которые ингибируют деградацию β-катенина, найденного в ~ 90% всех спорадических случаев колоректального рака 22. Деградация β-катенин компонентами пути Wnt может быть точно воспроизводятся в Xenopus яйца экстракта изучить механизм его оборота, а также для идентификации новых низкомолекулярные модуляторы его деградации 2, 19, 20, 23-29.
Методы подготовки Xenopus яичного экстракта для изучения клеточного цикла были описаны в предыдущих Юпитера публикаций 30-32. Нынешний протокол описывает модификацию этих методов и оптимизирован для деградации [35 S]-радиоактивно β-катенин и люциферазы с метками β-катенин вXenopus яйцо экстракт. Радиоактивно деградация анализ позволяет для прямой визуализации уровня белка через авторадиографией. [35 S]-метионина включена в интересующего белка с использованием реакции перевода в пробирке, который затем может быть непосредственно добавлен к реакции деградации. Кроме того, анализ радиоактивно оборот белок не требует антитело против белка, представляющего интерес эпитопа или тег, который может влиять на стабильность белка. Потому что даже небольшие изменения в уровнях белков, как это отражено в изменениях в интенсивности с радиоактивной полосы белка, легко визуализируются авторадиографией, [35 S]-радиоактивно деградация анализ представляет собой очень полезный способ визуализации оборота белка 2.
Слияние β-катенина в люциферазы светляков (далее по тексту просто «люциферазы") позволяет точно и легковесных количественных измерений уровней белка, для того,для определения кинетических свойств β-катенина оборота 19, 20. Основным преимуществом люциферазы в том, что он обеспечивает прочную количественную систему, которая легко масштабируется вверх. Следующий протокол предоставляет простые способы анализа деградации β-катенина и устойчивой, эффективной и эффективный способ для высокопроизводительного скрининга новых β-катенина модуляторов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка Xenopus Egg Extract
ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый лягушка дает около 1 мл полезной экстракта яиц. Экстракты из 10 лягушки обычно получают за один раз, а объем буфера, описанного ниже, для выполнения 10 лягушки Xenopus экстракт яйцо преп. Объем буфера может быть соответствующим образом скорректированы для больших или меньших препаратов экстракта яиц. Preps, полученные таким образом последовательно дают концентрации белка ≥ 50 мг / мл. Процесс сбора яиц и их переработке в экстракте наиболее эффективен, когда проводится два человека. (Для основных методов лягушка животноводства см. Sive др.. 33).
- Яйцо Коллекция
- Для премьер-лягушки, придать каждой самки лягушки с 100 U беременных Маре сыворотки гонадотропин (PMSG) из свежеприготовленного 250 Ед / мл складе. Используйте 3 мл туберкулиновые шприцы с 27 G иглы для введения подкожно, со скосомигла вверх, в спинной лимфатический мешок, который находится примерно в 1 см от средней линии от зубчатых обесцвечивания по длине ног лягушки.
- Храните праймированные лягушки в воде (плюс 20 мМ NaCl, см. Sive др.. 33) при 18 ° С в течение 5-10 дней. Для стоя резервуаров от воды, плотность животных составляет около 4 л воды на женской лягушки. ПРИМЕЧАНИЕ: минимальное время, необходимое для грунтования вступили в силу 5 дней, и последствия грунтовки стираться через 10 дней.
- Подготовка Modified Звонки (MMR) решение 0.5x Марка, от MMR складе 20x. 20x MMR состоит из 2 М хлорид натрия, 40 мМ хлорида калия, 40 мМ хлорида кальция, 20 мМ хлорид магния, и 100 мМ 4 - (2-гидроксиэтил)-1-пиперазин-кислоту (HEPES), рН 7,4.
- Настройка ведра для всех вводимых лягушек (одна лягушка за 4 L ведро). ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на более чем один лягушка может быть размещен в том же ведро для сбора яиц, если один из лягушеклежит преимущественно низкого качества яиц, значительное количество усилий потребуется, чтобы отделить низкого качества яйца от тех, которые подходят для изготовления экстракта. Таким образом, максимальное количество лягушек в одном танке, чтобы свести к минимуму количество буфера, используемого для яйца собирать не стоит риска.
- Введите 750 U хорионический гонадотропин человека (ХГЧ) в спинной лимфатический мешок каждого лягушки с помощью иглы 27 G, как описано в 1.1.1.
- Поместите каждый из HCG впрыском лягушек на отдельные 4 L ведрах 0.5x MMR охлаждают до 16 ° С.
- Поместите контейнеры с лягушек в инкубаторе 16 ° C, чтобы собирать яйца O / N (15-16 ч). ПРИМЕЧАНИЕ: Поддержание нужной температуры имеет решающее значение для всей процедуры, от сбора яйца подготовке экстракт яйца.
- Dejellying яйца
Примечание: Яйца покрыты студенистой оболочки, которые должны быть удалены до подачи экстракта. Вероятность спонтанного лизиса яиц увеличивает как время betweeн откладки яиц и извлечь подготовки увеличивается. Таким образом, важно, чтобы пройти через следующие шаги как можно быстрее.- Подготовка 4 л 1x MMR, 50 мл 0,1 × MMR, и 400 мл 2%-цистеин, рН 7,7, выполненный в дистиллированной воде. Поддерживать все решения при 16 ° C.
- Чтобы изгнать дополнительные яйца, слегка сжать нижней части спины и живота лягушки.
- Удалите лягушек и большую часть MMR, чтобы оставить яйца в примерно 1-200 мл MMR в каждом сегменте.
- Удалите мусор с пипетки, и оценить качество яиц: высокое качество яйца, как правило, характеризуется четким разделением между мрачно пигментированных полушарии животных и слегка окрашенной вегетативного полушария и имеют самый высокий темный-свет контраст. Откажитесь с пипетки любые яйца, которые появляются тягучий, пестрый, или лизируют (белый и пухлыми), как они будут уменьшать общее качество экстракта. Если> 10% яиц имеют низкое качество, всяпартия должна быть отброшена.
- Комбинат яйца в стеклянный стакан 500 мл и вылейте столько MMR, насколько это возможно, сохраняя при этом яйца под водой.
- Промойте яйца, осторожно закрученной дважды объема яиц из MMR. Повторите дважды, и удалить любой мусор или явно низкого качества яиц.
- Добавить примерно в 100 мл 2% цистеина в стеклянный стакан, вихревой нежно смешать, и позволяют яйца урегулировать в течение 5 мин при 16 ° C. Слейте цистеин. ПРИМЕЧАНИЕ: Dejellying отмечен постепенном появлении желе пальто плавающих над яйцами и более компактной упаковки яиц, поскольку они в настоящее время занимают меньший объем без студенистой оболочки.
- Добавить еще 100 мл 2% цистеина, нежно вихревой, подождите 5 мин, а затем медленно вылейте цистеин. Повторите, пока яйца не стали плотно спрессован (обычно на третьей обработки цистеина). Примечание: Если яйца слишком долго в цистеина, они склонны к лизису. Точно так же, dejellied яйца являются хрупкими и склонными к механическим лизиса, если оникоторые кружились слишком энергично или если они подвергаются воздействию воздуха. Как только яйца были dejellied, важно, чтобы быстро перейти к стадиях центрифугирования.
- Вылейте цистеин, и смыть желе пальто и другой мусор, аккуратно мыть яйца в 1x MMR. Выливают буфер осторожно вдоль стороны стакана. Повторяйте дважды или до решения MMR уже не дождь. В то время как промывка 1x MMR продолжать удалить плохие яйца с использованием передачи пипетки.
- Выполните окончательное нежный промыть 30 мл 0,1 × MMR, и аккуратно слейте как можно больше буфера, как это возможно. Опять же, удалите все очевидно плохие яйца.
- Упаковка и Дробление яйца путем центрифугирования
Примечание: экстракт описано ниже, который используется для деградации β-катенина является вариантом цитостатического фактора экстракта (метафазы II-задержан). В отличие от низкой скорости и высокой скоростью экстракта, используемого для исследований клеточного цикла, экстракт промежуточного скорость лучше всего подходит для деградации β-катенина. Яnterphase экстракт же способствует надежной деградации β-катенина хотя более трудоемок, чтобы подготовиться.- Добавить лейпептина пепстатина апротинина смесь (LPA, ингибитор протеазы) при 10 мкг / мл (разбавленных с 10 мг / мл маточного раствора в ДМСО) и цитохалазином D при 20 мкг / мл (разбавленных с 10 мг / мл маточного раствора в ДМСО) в оставшиеся 20 мл 0,1 × MMR.
- Добавить 0. Х MMR содержащий МПУ и цитохалазином D к промытым яиц, вихревой нежно и инкубировать 5 мин при 16 ° C.
- Трансфер яйца на 16 ° C до охлажденных 50 мл центрифужные пробирки, позволяют яйца осесть и удаления остатков буфера сверху. Для предотвращения воздействия воздуха, снять небольшое количество буфера в пипетку до снятия яйца для передачи. Продолжить передавать дополнительные яйца в центрифужные пробирки и удалить остаточный буфер из верхней части трубки пока яйца заполнить центрифужную пробирку на вершину, которая будет максимизировать выходизвлечь.
- Чтобы упаковать яйца, спин центрифужные пробирки при 400 мкг в течение 60 сек при 4 ° С с использованием ротора фиксированный угол. Удаление остаточного буфера из верхней части центрифужных пробирок.
- Для дробления спина, спина пробирки при 15000 мкг в течение 5 мин при 4 ° C.
- Сбор цитоплазматических слой экстракта
Примечание: Метод, описанный ниже отличается от классического метода выкалывания сторону центрифужную пробирку для сбора цитоплазматический слой. Этот протокол был адаптирован для упрощения и для использования с конкретным центрифужных пробирок, которые повторно. Нет заметные различия в кинетике деградации β-катенина не будут найдены при любом способе. В этот момент выписки следует держать в холоде в течение в течение всего процесса, и все шаги должны быть выполнены при 4 ° С.- Очистите отверстие в липидного слоя с использованием P1000 пипетки.
- Сбор цитоплазматический слой (между темной пигментного слоя и Liнравом липидный слой), используя новый наконечник P1000 пипетки в чистые предварительно охлажденных центрифужные пробирки (рис. 1). Для экстракта высококачественного что ухудшает надежно β-катенин, свести к минимуму количество пигментированных и липидный слой, который снят с цитоплазматической слоя.
- Спин экстрагируют цитоплазматический слой при 15000 х г в течение 10 мин при 4 ° С и снова собрать цитоплазматический слой. Повторите отжима и экстрагирования 1X. ПРИМЕЧАНИЕ: Экстракт должен быть "соломенного цвета." Если есть значительное загрязнение с пигментными и липидных слоев в этот момент, можно повторить спина еще раз, хотя чрезмерное спины снизится способность экстракта разрушать β-катенин.
- Добавить LPA и цитохалазином D выписке в конечной концентрации 10 мкг / мл каждый. Примечание: С использованием метода, описанного дает довольно последовательную общую концентрацию белка примерно 50 мг / мл (52,41 ± 5,40 мг / мл, N = 3 отдельных Preps) в Xenopus например,г экстракты.
- (Дополнительно) Для перевода анализов, добавить увенчанный мРНК (0,1 мг / мл), Rnasin (1,5 ед / мл), и энергия микс регенерации (2.2.1) и инкубировать реакцию при комнатной температуре в течение 2 часов (для получения дополнительной информации см. Salic ET аль. 2 и Sive соавт. 33). Немедленно Используйте переведенный экстракт для β-катенина анализов деградации или оснастке замораживания в жидком азоте для последующего использования. ПРИМЕЧАНИЕ: Свежеприготовленный экстракт имеет высокую способность переводить экзогенно добавленную мРНК, но, к сожалению, эта способность теряется, как только экстракт заморожены. Сборную мРНК могут быть легко получены с использованием коммерчески доступных наборов.
- Экстракт мгновенного замораживания в жидком азоте. ПРИМЕЧАНИЕ: Экстракты хранятся в небольших (200 мкл) аликвоты для одноразового использования, потому что они быстро теряют способность разрушать β-катенин, если замораживать. Для длительного хранения, экстракт можно хранить в жидком азоте. Для кратковременного хранения, экстракт можно хранить при -80 ° С, хотя емкость оЭкстракт е деградировать β-катенин можно резко сократить с длительного хранения при температуре -80 ° С (более чем на 2 месяца).
2. Подготовка экстракт для β-катенина деградации Пробирной
- Истощение от Xenopus Extract
ПРИМЕЧАНИЕ: Основным преимуществом экстракта Xenopus является способность легко истощить компоненты пути и точно добавить обратно определенное количество белка, чтобы определить свои дозозависимых эффекты.- Используйте свежеприготовленные Xenopus яичный экстракт или быстро размораживайте экстракт и место на льду. Выполните все манипуляции в холоде.
- Добавить экстракт в 1/10 объема гранулированного аффинности антитела или шариков (например, 20 мл осаждали шариков 200 мл) экстракта. Чтобы свести к минимуму разбавление экстракта, снять столько жидкости из шариков, как это возможно перед добавлением экстракта с помощью гель советы загрузки с длинными коническими концами.
- Поверните экстракт-шарик смесь при 4 ° С в течение 1 часа.
- Спин экстракт-шарик смесь на 12 600 мкг в микроцентрифуге при 4 ° С в течение 30 сек. С другой стороны, если используются магнитные шарики, применять магнитное поле для сбора шариков.
- Передача обедненный экстракт свежего пробирке на льду. Будьте осторожны, чтобы не передавать любые бусы с экстрактом.
- Подтверждение эффективности истощения иммуноблоттингом как обедненный экстракта и бусы.
- Подготовка экстракт для β-катенина деградации анализа, как описано в п. 2.2.
- Оптимизация Xenopus Выписка для β-катенина деградации
ПРИМЕЧАНИЕ: деградация β-катенин в Xenopus яичного экстракта является энергетически зависимым процессом, который быстро истощает эндогенные АТФ магазинов. Следовательно, система регенерации энергии требуется для поддержания надежной деградации β-катенина.- Подготовьте 20x регенерации энергии (ER) смесь, состоящую из 150 мМ креатинфосфата, 20 мМ АТР, 600 мкг / мл креатинфосфокиназы,и 20 мМ MgCl 2. ER следует аликвоты и хранили при -80 ° С. Избегайте повторных циклов замораживания / оттаивания, используя небольшие замороженные аликвоты.
- Быстро разморозить Xenopus яичный экстракт, потерев замороженный трубку между руками. Поместите пробирку на льду перед все из экстракта растает.
- Добавить 10 мкл регенерации энергии смеси (20x ER) в аликвоты (200 мкл) Xenopus яичного экстракта. Тщательно перемешать, переместив палец вдоль трубки и импульса вихревание. Пульс-спин и сразу разместить на льду.
- (Опционально) Оборот β-катенина может быть слегка повышена в Xenopus яйца экстракта добавлением убиквитином (1,25 мг / мл конечного). Циклогексимид (0,1 мг / мл окончательный) также могут быть добавлены к минимуму перевод эндогенных транскриптов.
- Алиготе соответствующие объемы для деградации анализа в предварительно охлажденной микроцентрифужные пробирки на льду. Для меченных анализов деградации β-катенин, снять 2-5 мл извлечь для каждого момента времени. </ Li>
3. Radiolabeled β-катенин деградация анализ в Xenopus яичного экстракта
Примечание: Все шаги должны быть выполнены на льду если не указано иное.
- Подготовка радиоактивно меченные β-катенин
- Подготовка недавно в пробирке синтезированных [35 S] метионин радиоактивно белка с использованием коммерчески доступных наборов. Примечание: Генерирование 35 S-меченого (период полураспада 87 дней) белки легко и эффективно произведено с использованием коммерчески доступных пробирке связью наборы транскрипции-трансляции в. Важно, что в переводе белка достаточно помечены таким образом, что изменения в оборот белка можно легко визуализировать.
- Для подтверждения успешного радиоактивной, выполните SDS-PAGE/autoradiography с 0,5 мкл переведенного белка. Количественная оценка интенсивности меченного β-катенина полосы, с использованием ImageJ, ImageQuant, или альтернативный количественный программного обеспечения прогря. ПРИМЕЧАНИЕ: радиоактивно полоса белка β-катенин должен быть отчетливо виден на пленке в течение нескольких часов (4-6 ч).
- Snap-не заморозить меченого белка в жидком азоте для хранения до использования. Примечание: Длительное хранение (> 2 месяцев) и несколько замораживания / оттаивания (больше 2) может серьезно повлиять на способность меченного β-катенина ухудшить решительно в Xenopus яичного экстракта. Как правило, стабильность меченых белков значительно снижается после 1 месяца хранения при -80 ° С; Таким образом, относительно свежеприготовленный радиоактивно β-катенин дает лучшие результаты в этих деградации анализов.
- Выполнение β-катенина деградации Пробирной
- Добавить 1-3 мкл (в зависимости от силы сигнала радиоактивно полоса) в пробирке-переведенного β-катенина (и других белков, небольшие молекулы и т.д., которые проходят испытания) в 20 мкл реакционной смеси Xenopus на льду. Тщательно перемешать на quicklу щелкая трубки и короткий импульс встряхивания; это важный шаг, как Xenopus яйцо экстракт очень вязкой, и неполное перемешивание повлияет на согласованность результатов. Пульс спин и место на льду.
- Запустите β-катенина реакцию деградации путем сдвига труб до комнатной температуры.
- В назначенный момент времени, удалить 1-5 мл пробы и сразу же смешать с ДСН буфера для образцов (объем 5x), чтобы остановить реакцию. Чтобы убедиться, что реакция деградации полностью прекращается, Флик трубку несколько раз, и вихрь энергично.
- Выполните SDS-PAGE/autoradiography. Запуск 1 мл эквивалентов (~ 50 мг белка) экстракта для каждого момента времени / пер. Деградация β-катенина в Xenopus яичного экстракта следует свидетельствует нестационарной снижению интенсивности меченого β-катенина группы рисунке 2. Количественная результаты, используя ImageJ, ImageQuant, или другое программное обеспечение предпочтительным изображений, если необходимо.
- (Опортогональной) замочить в SDS-полиакриламидном геле в фиксирующем растворе (10% уксусной кислоты и 30%-ный метанол в дистиллированной воде) перед сушкой, чтобы уменьшить фон радиоактивности и повысить качество изображения.
4. Β-катенин-люциферазы Деградация Анализ в Xenopus Egg Extract
Выполните все шаги на льду если не указано иное.
- Подготовка β-катенина-люциферазу
- Обобщить не-меченого, люциферазы с метками β-катенин помощью транскрипции-трансляции связанную систему с полной смеси аминокислот.
- Подтверждение производство люциферазы с метками β-катенина путем измерения активности люциферазы от 0,5-1 мкл реакции. Оценка фонового свечения путем измерения люминесценции от нетранслируемом реакционной смеси. ПРИМЕЧАНИЕ: Несколько коммерческие наборы доступны для измерения активности люциферазы. Долгоживущих люминесценции, однако, особенно хорошо работает для деградации Ассау.
- Выполнение β-катенин-люциферазы деградации Пробирной
- Оттепель и подготовить Xenopus яичный экстракт, как в п. 2.2.
- Добавить в пробирке-переводится β-катенин-люциферазы слияние (от 4,1) в подготовленную Xenopus реакционной смеси (от 2.2) на льду и хорошо перемешать как в 3.2.1. Примечание: активность β-катенина люциферазы, который добавляется к экстракту, как правило, между 20 - 50000 относительные единицы люминесценции (RLU) / мл экстракта (на основе измерений, полученных от 4.1.2). Пусковой сигнал должен быть примерно 100 000 РОС (2-5 мл в пробирке-переведенного β-катенина-люциферазы синтеза).
- Сдвиг выписку до комнатной температуры Для начала реакции деградации.
- Удалить аликвоты реакции в указанное время и оснастки заморозить в жидком азоте. Примечание: трех образцов обычно удаляются для анализа для каждой временной точке. Замороженные экстракт можно хранить при -80 ° C ЕНТиль они готовы для анализа.
- Образцы оттепели лед, передает пробы в стандартных белых 96-луночных планшетах на льду, и процесс активности люциферазы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Схема деградации β-катенина в Xenopus яичного экстракта показано на фиг.2А. 35 S-меченого β-катенин инкубировали в Xenopus яичного экстракта аликвоты (1 мл экстракта эквивалент) были удалены в соответствующие моменты времени, и образцы подвергали SDS-PAGE с последующим авторадиографии. деградации β-катенина компонентами пути Wnt опосредуется системой убиквитин-протеасом 2, и деградация [35 S]-меченного β-катенина в экстракте Xenopus ингибируется добавлением ингибитора протеасом MG132 рис. 2В. Деградация β-катенина компонентами пути Wnt зависит от его фосфорилирования GSK3 34. GSK3-зависимую деградацию может быть легко продемонстрирована различными способами с использованием Xenopus яичный экстракт: 1) β-катенина (SA) мутант (GSK3 сайты фосфорилирования заменен на аланинов) стабилизируется в Xenoгной яйцо экстракт относительно дикого типа β-катенин белок рисунке 2B. 2) низкомолекулярные ингибиторы GSK3 (LiCl) аналогично ингибируют деградацию β-катенина (рис. 2С). 3) Наконец, истощение GSK3 от Xenopus яичного экстракта ингибирует деградацию β-катенина; Деградация может быть спасен путем добавления экзогенного GSK3 рисунках 2D-E.
Радиоактивно β-катенин деградация анализ обеспечивает особенно информативный визуальную оценку его режиме деградации (т.е. убиквитин-опосредованной деградации по сравнению с апоптотической расщепления). Авторадиография, однако, является трудоемким и, по большей части, ограничены для высокой пропускной анализа пути (например, скрининг на низкомолекулярных модуляторов пути Wnt). Деградация анализ β-катенин-люцифераза является более легко и быстро количественно как количество люминесценции прямо пропорциональна утрар а ф из β-катенин-люциферазы белка. Эта особенность делает люциферазы анализа простой и легко адаптируется для высокой пропускной анализов.
Важно определить, что люцифераза сплав имеет аналогичные свойства, как у белка nonfusion. Это может быть определено эмпирически путем слияния белка люциферазы к N-концу, с С-концом, или внутренне. Fusion люциферазы к N-или С-конца β-катенина не влияет на его способность активировать Wnt гены-мишени incultured клетки млекопитающих или его скорость оборота в Xenopus яичного экстракта 2, 19, 20.
Представитель β-катенин-люциферазы деградация анализ в Xenopus яичного экстракта показана на фиг.3А, в котором деградация β-катенина-люциферазы оценивали с помощью SDS-PAGE/autoradiography радиоактивно меченого белка и активности люциферазы слияния. Скорость degradatioп из β-катенина-люциферазы похожа на немеченого белка β-катенина. Регулирование деградации для β-катенин-люциферазы слияния, по сути идентичен nonfusion белка как добавлением LiCl или истощение GSK3 приводило к ингибированию β-катенина-люциферазы оборота. Как показано на фиг.3В-C, изменения в радиоактивного сигнала белка β-катенин-люциферазы параллельно изменения в ферментативной активности люциферазы с течением времени. Вопрос, который возникает от использования β-катенина-люциферазу (особенно слитого белка, полученные от системы транскрипции-трансляции в пробирке) является фоном люциферазы сигнала, вызванные использованием внутренних трансляционных стартовых сайтов или преждевременным поступательное прекращения фиг.3Г. Эта проблема может иногда быть преодолены путем оптимизации концентрации ДНК, используемые в реакции IVT. Мы, однако, не наблюдается уменьшение фона активности люциферазы когда варьировалиськонцентрация ДНК плазмиды для нашего конкретного β-катенин-люциферазы конструкции. Вполне вероятно, что мы должны будем перестроить слитый белок с помощью мутагенеза в целях дальнейшего минимизации внутренних начала трансляции сайтов и / или преждевременные поступательное прекращение слитого белка β-катенин-люциферазы. Поскольку белок люциферазы довольно стабильными в течение времени протекания реакции разложения в Xenopus яичного экстракт фиг.3А, однако, это фоновый сигнал может быть просто вычитается, если отношение усеченного белка люциферазы в полной длины β-катенина синтеза, как известно .
Сила люциферазы является способность масштабировать до формата многолуночном, что позволяет для выполнения высокопроизводительного скрининга для модуляторов деградации β-катенина. На рисунке 4, представитель анализ шахматном показано с помощью ингибитора деградации β-катенина, MG132, который подавляет протеасомный. Результат эксперимента шахматном указывает, что проба является однородным и воспроизводимым в формате 96-луночного и демонстрирует его пригодность для высокопроизводительного скрининга.
Рисунок 1. Схематическое изображение подготовке концентрированной Xenopus яичного экстракта. Яйца собраны из HCG впрыском Xenopus Laevis самок, уплотненные с низкой скоростью (400 XG) спина, и измельченные и разделенных на среднесрочную скорости (15000 х г ) спин. Позаботьтесь, чтобы придать подкожно в спинной лимфатический мешок, тщательно удалить плохие яйца и осторожно отделить качественную цитоплазматический выписку из более низкого качества темной выписке отмечено в тексте.
На рис 2 "FO: контент-ширины =" 5 дюймов "FO: Пребывание" / files/ftp_upload/51425/51425fig2highres.jpg "Первоначально" / files/ftp_upload/51425/51425fig2.jpg "/>
Рисунок 2. Β-катенин ухудшает энергично при инкубации в Xenopus экстракта яйца. A) представлено схематическое изображение деградации анализа. B) [35 S]-меченного β-катенин получены путем реакции IVT ухудшает энергично при инкубации в Xenopus яичного экстракта. Добавление MG132 (200 мкм), чтобы Xenopus яичного экстракта ингибирует деградацию β-катенина. Мутация в аланинов этих phosphosites GSK3 внутри β-катенина (β-катенин SA) или добавлением LiCl (25 мм) C) ингибирует деградацию β-катенина. D) Связывание GSK3 сайт Axin (аминокислоты 506-560) эффективно истощает GSK3 от Xenopus яичного экстракта. Е) GSK3 обедненного Xenopus яйцо экстракт ингибирует деградацию β-катенина и может быть спасен того ое рекомбинантный GSK3 (0,1 мг / мл). Добавление LiCl (25 мм) блоков мощностью рекомбинантного GSK3 чтобы спасти деградации β-катенина в GSK3 обедненного экстракта. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
Рисунок 3. Люциферазы с метками β-катенин ухудшает при инкубации в Xenopus яичного экстракта.) С радиоактивной меткой β-катенин-люциферазы ухудшает со скоростью, аналогичной из немеченого белка β-катенина. Как с белком дикого типа, добавление LiCl (25 мм) ингибирует β-катенина-люциферазы деградации. Одна Люциферазную не заметно перевернуться в Xenopus яйца экстракта. Изменения в активности люциферазы в β-катенина-Люцифераазы слияние параллельно изменения в ее уровня белка. Б) Добавление LiCl (25 мм) или истощение GSK3 C) ингибирует β-катенина-люциферазы оборот как оценивали путем измерения активности люциферазы. D) Иммуноблоттинг для в пробирке переведены β-катенин- люциферазы (с помощью анти-люциферазы антитела) показало значительное количество свободной люциферазы белка в определенных препаратов, которые, вероятно, способствует более высокий план, когда по сравнению с радиоактивной меткой деградации анализа. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
Рисунок 4. Регулируемый деградация β-катенина-люциферазы в экстракте Xenopus могут быть адаптированы кформат высокой пропускной. Представитель анализ шахматной для β-катенина-люциферазы с использованием MG132 (450 мкМ) в качестве ингибитора деградации β-катенина. Затемненные колонки указывают MG132-обработанных скважин, и более легкие столбцы представляют автомобиль (ДМСО) обработанные скважины. Количественное и Z-фактор результат вычисления со счетом 0,3 указанием приемлемого анализ для возможного использования в высокопроизводительного скрининга.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Xenopus яйцо экстракт является надежным биохимическая система для исследования оборот β-катенина. Концентрация β-катенина в Xenopus яичного экстракта составляет ~ 25 нМ 2. При оптимальных условиях, экстракт яйцо способен разлагать β-катенин со скоростью 50-100 нм / ч и составляет половину от максимального при 200 нм 24. Есть несколько важных шагов для успешного восстановления деградации β-катенина с использованием Xenopus яйцо экстракта. К ним относятся: 1) формирование высокого качества Xenopus экстракт яйца и способ, с помощью которого экстракт яйцо подготовленный, 2) формирование качества радиоактивно β-катенин и β-катенин-люциферазы белок, 3) оптимизации условий реакции для поддержки деградации β-катенина и 4 ) надлежащая обработка реакции моменты времени.
Препарат высокого качества Xenopus яичного экстракта, в котором β-катенин решительно деградирует зависит как от качества гое яйца и яйца, как обрабатываются до стадии дробления, а как экстракт затем центрифугировали для получения конечного экстракта. Как уже упоминалось в протоколе, важно гарантировать, что только высокие яйца качества (о чем свидетельствует резкий контраст между темной полушария животных и легкой вегетативного полушария) используются, что низкое качество яйца (волокнистые, пестрые или белые затяжек) удаляются в течение процесс, что яйца выдерживают при невысокой температуре (16 ° C) в течение всей процедуры, и что процедура осуществляется как можно быстрее. Важно не жертвовать качеством ради количества экстракта. Кроме того, как уже упоминалось ранее, яйца от лягушки, что лежит плохие яйца качества (> 10%) должны быть полностью отброшены.
Экстракт описано выше, является модификацией мейоза II-CSF задержан экстракта 11. Подготовка Xenopus яичного экстракта для деградации β-катенина (экстракт промежуточного скорость) различийERS от классических экстрактов, полученных при изучении клеточного цикла 30-32, которые низкоскоростной или высокоскоростной извлекает 35. Адаптация Xenopus яичный экстракт для оптимального деградации других белков может потребовать изменения скорости центрифугированием и количество вращений. Экстракт низкой скорости содержит нетронутыми органелл и других крупных клеточных компонентов. Таким образом, более высокие скорости спины будет изменить состав экстракта и, возможно, удалить ингибирующие и / или основных компонентов, которые будут влиять деградацию белка, представляющего интерес. Получение промежуточного соединения экстракта скорости описанного здесь оптимизирован для деградации β-катенина компонентами пути Wnt. Вращение экстракт более чем в 4 раза может значительно уменьшить емкость экстракта разрушать β-катенин (хотя имеет минимальное влияние на ухудшение другого компонента Wnt, Axin). β-катенин подвержен каспазы-опосредованной протеолиза в низкой скорости спин экстракта и не Noticeably ухудшить в высокоскоростной спин экстракта. Таким образом, вполне вероятно, что различные экстракты скорость будет оптимальным для деградации компонентов других сигнальных путей.
Генерирование 35 S-β-катенина и β-катенина-люциферазы может быть выполнена с использованием ряда коммерчески доступных наборов. Продуцирование белка с помощью транскрипции-трансляции связанные системы в значительной степени зависит от качества плазмиды: высокой чистоты Midi-препараты плазмид работать лучше и более надежны по сравнению с ДНК мини-препараты. Для радиоактивной метки β-катенин, недавно получены [35 S] метионин или Translabel ([35 S] метионина плюс [35 S] цистеина) является предпочтительным. Следует отметить, что метионин и цистеин оба имеют тенденцию к окислению с длительном хранении тем самым уменьшая их включение в β-катенина в транскрипции-трансляции в сочетании реакции в пробирке. Поскольку длительное хранение и повторил замораживания-оттаиванияциклы могут ингибировать деградацию, небольшие количества меченного β-катенина, получают в то время, и вскоре после этого использовали.
Количество белка в переводе и количества метионинов в белке определения прочности радиоактивно меченого сигнала. Для β-катенина, что не должно быть никаких проблем получения сильных радиоактивных сигналы для деградации анализов. Для белков с нескольких метионинов и / или иного они не вписываются, в [35 S]-метионина и [35 S] цистеин смесь можно использовать вместо [35 S]-метионина и / или добавлении в эпитопную метку (Myc), содержащий несколько метионины. Хотя успех с различными экспрессирующими плазмидами, содержащими соответствующие фаговые промоторы (Т7, Т3 и SP6) могут быть получены по реакции пробирке транскрипции-трансляции в, PCS2 основе плазмида обычно дает наилучшие результаты. Кроме того, сигнал в транслированном белке, иногда может быть резко увеличена путем удаления эндогенного 5'УТР. Наконец, для крупномасштабных экспериментов (например, высокопроизводительного скрининга), большое количество рекомбинантного β-катенина-люциферазы могут потребоваться. β-катенин-люциферазы из Sf9 / бакуловирусной деградирует с аналогичными кинетики как дикого типа β-катенина в экстракте Xenopus и эмбрионов 2. С другой стороны, с высоким выходом в пробирке системы экспрессии (например зародышей пшеницы основе) успешно используется для высокопроизводительного скрининга 19, 20.
Для того чтобы надежно измерить деградации β-катенина в системе экстракта, важно, что начальный сигнал либо из радиоактивно меченного β-катенина или люциферазы β-катенина синтеза является достаточно прочным. Таким образом, некоторое количество оптимизация экспериментатора на размер деградации анализа, число временных точек необходимо, и эффективность реакции в пробирке перевод Wiбудете требуется. При сборке реакцию деградации, есть несколько шагов, можно предпринять, чтобы повысить шансы на получение надежной деградации. Во-первых, все реагенты должны быть быстро размораживают и помещают на лед до их полного оттепели. Поскольку ухудшение β-катенина в значительной степени зависит энергии, важно, что ER относительно свежим. Во-вторых, Xenopus яйцо экстракт является вязким, и очень важно, что реакцию тщательно перемешивают после добавления меченного β-catenin/β-catenin-luciferase синтеза, ER, белок, небольшие молекулы модуляторы и т.д. В-третьих, предварительной инкубации реакцию перемешать в течение 20-30 мин на льду дает более воспроизводимые результаты при тестировании эффекты малых модуляторов молекулы.
Способность к истощению белки от Xenopus яичного экстракта представляет собой мощный инструмент для оценки функции белка и их концентрация-зависимых эффектов. В качестве примера, мы показываем, что истощает GSK3 от Xenopus экстракт яйцо блоки деградации β-катенина, указывая на важную роль GSK3 оборота β-катенина. Различные условия истощение необходимо будет эмпирически определяется для различных белков. Например, обильные белки потребует увеличения количества антитела или аффинный лиганд шариков, используемых для достижения полного истощения. Хорошая отправная точка, чтобы использовать упакованные бусы в 1/10 объема экстракта с целью минимизации разбавление экстракта. В дополнение к прочности связывания антитела / аффинного лиганда с белком-мишенью, тип гранул (например, сефароза, агароза, или магнитный), используемых может повлиять на эффективность разрушения белка из экстракта яиц Xenopus 36. Наконец, было бы идеально, чтобы проанализировать степень истощения (как правило, с помощью иммуноблоттинга). По окончании реакции β-катенин завершена, способ, с помощью которого эти образцы обрабатываются может сильно повлиять на результаты эксперимента. КонцентрацияXenopus яйцо экстракт Preps, приготовленные по способу, описанному в 52,41 мг / мл ± 5,40 мг / мл, и важно, чтобы не перегружать потенциала геле SDS-PAGE; это не проблема с люциферазы-β-катенина анализа. Таким образом, для каждой временной точке, не более 1 мл эквивалентные экстракта должны быть загружены в каждой полосой в SDS-PAGE гель. Для дальнейшего повышения качества результатов, фиксация шаг гель (опционально) будет уменьшаться фона радиоактивности и увеличения отношения сигнал-шум. Для анализа люциферазы, уменьшение от начального сигнала 100000 РОС в Xenopus яичного экстракта точно отражает изменение уровней белка в слитом белке β-катенин-люциферазы.
Xenopus яйцо система экстракт представляет собой привлекательную систему для изучения регуляции деградации β-катенина. Система экстракт дает возможность точного контроля концентрации отдельных белков через истощения и reconstitu Тион. Способность контролировать их влияние на кинетику β-катенина оборота с течением времени позволяет лучше понять биохимический механизм этого важнейшего шага в Wnt передачи сигнала. Такие манипуляции предоставили глубокое понимание сложных молекулярных взаимодействий между компонентами пути Wnt и были критическими для развития первой математической модели Wnt пути 24. Одно предостережение в том, что концентрации компонентов тропа Wnt в Xenopus экстракта яиц и млекопитающих клеточных лизатов были найдены отличаться, возможно, отражает различия в том, как путь Wnt регулируется во время эмбриогенеза против взрослого ситуации 37. Способность выполнять как радиоактивные и ферментативные, люциферазы основе анализов с использованием Xenopus яичный экстракт обеспечивает дополнительную мощные дополнительные качественные и качественные инструменты для изучения биохимических регулирование деградации β-катенина.
т "> В дополнение к мониторингу оборот β-катенина, деградация отрицательной Wnt регулятора, Axin, можно отслеживать в Xenopus яичного экстракта или как с радиоактивной белка или слияния с люциферазы. Использование вариант люциферазы, Renilla, слит с Axin, ранее предназначенные для люциферазы деградации анализа в формат высокой пропускной одновременно экран для модуляторов двух Wnt тропа белков, β-катенина и Axin 19, 20. Эта биохимическая экран определили FDA-одобренный препарат, pyrvinium, что увеличение и снизилась скорость деградации β-катенина и Axin, соответственно, в Xenopus яичного экстракта 19. Pyrvinium впоследствии подтверждены в культивируемых клетках человека и в различных модельных организмов (например, Xenopus и C. Элеганс), как имеющего малую молекулу ингибитора канонического Wnt путь. Таким образом, Xenopus яйцо система экстракт является универсальным биохимическая система тхат может быть использована во множестве способов изучения механизма сигнализации Wnt, а также для идентификации низкомолекулярных модуляторов пути Wnt. Биохимический метод, описанный здесь, могут быть применены к другим сигнальных путей, в котором ухудшение белок может играть решающую роль.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.
Acknowledgments
Мы благодарим Лори Ли за критическое прочтение рукописи. TWC поддерживается в Американской ассоциации сердца Predoctoral Fellowship (12PRE6590007). MRB поддерживается учебного гранта Национального института рака (T32 CA119925). SSH поддерживается Национальных Институтов Здоровья (R01DK078640). EL поддерживается Национальными Институтами Здоровья (R01GM081635 и R01GM103926).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) | ProSpec | hor-272-A | Reconstituted with distilled water before use. |
| Human chorionic gonadotropin | Sigma | CG10-10VL | |
| Potassium chloride | Fisher | BP366-1 | |
| Sodium chloride | Research Products International | S23020-5000.0 | |
| Magnesium chloride | Fisher | BP214-500 | |
| Calcium chloride | Acros Organics | AC42352-5000 | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Cysteine | Acros Organics | AC17360-1000 | |
| Leupeptin | Sigma | L2884-10MG | |
| Aprotinin | Sigma | A1153-10MG | |
| Pepstatin | Sigma | P4265-5MG | |
| Cytochalasin B | Sigma | C8273-10MG | |
| 3 ml syringe: Luer Lock tip | Becton Dickinson | 309657 | |
| 27 G needle | Becton Dickinson | 305109 | |
| 96 well solid white polystyrene microplate, round bottomed | Corning | 3605 | |
| Steady-Glo luciferase assay system | Promega | E2520 | Store long-term at -80 °C, can store for up to 1 month at -20 °C |
| TNT Sp6 coupled reticulocyte lysate system | Promega | L4600 | |
| TNT Sp6 high-yield wheat germ protein expression system | Promega | L3260 | Generally higher yield than reticulocyte lysate |
| EasyTag Express protein labeling mix [S35] | Perkin Elmer | NEG772007MC | |
| Creatine phosphate | Sigma | 27920-5G | |
| ATP | Sigma | A2383-5G | |
| Creatine phosphokinase | Sigma | C3755-35KU | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418-50ML | |
| Dual-Glo luciferase assay system | Promega | E2920 | Same storage conditions as Steady-Glo |
| 50 ml Centrifuge tubes | Fisher Scientific | 0556214D | |
| Sorvall SS-34 fixed angle rotor | Thermo Scientific | 28020 | |
| 115 V 50/60 Hz Minicentrifuge | Fisher Scientific | 05-090-128 | |
| mMessage mMachine Sp6 kit | Ambion | AM1340 | |
| Anti-firefly luciferase antibody | Abcam | ab16466 | |
| Anti-GSK3 antibody | BD Transduction Laboratories | 610201 | |
| FLUOStar Optima | BMG Labtech | ||
| Sorvall RC-6 Plus centrifuge | Thermo Scientific | ||
| 16 °C Incubator | Percival Scientific |
References
- Glotzer, M., Murray, A. W., Kirschner, M. W. Cyclin is degraded by the ubiquitin pathway. Nature. 349, 132-138 (1991).
- Salic, A., Lee, E., Mayer, L., Kirschner, M. W. Control of beta-catenin stability: reconstitution of the cytoplasmic steps of the wnt pathway in Xenopus egg extracts. Molecular Cell. 5, 523-532 (2000).
- Murray, A. W. Cell cycle extracts. Methods in cell biology. 36, 581-605 (1991).
- Dabauvalle, M. C., Scheer, U. Assembly of nuclear pore complexes in Xenopus egg extract. Biology of the cell / under the auspices of the European Cell Biology Organization. 72, 25-29 (1991).
- Tutter, A. V., Walter, J. C. Chromosomal DNA replication in a soluble cell-free system derived from Xenopus eggs. Methods Mol Biol. 322, 121-137 (2006).
- Theriot, J. A., Rosenblatt, J., Portnoy, D. A., Goldschmidt-Clermont, P. J., Mitchison, T. J. Involvement of profilin in the actin-based motility of L. monocytogenes in cells and in cell-free extracts. Cell. 76, 505-517 (1994).
- Maresca, T. J., Heald, R. Methods for studying spindle assembly and chromosome condensation in Xenopus egg extracts. Methods Mol Biol. 322, 459-474 (2006).
- Shennan, K. I. Xenopus egg extracts: a model system to study proprotein convertases. Methods Mol Biol. 322, 199-212 (2006).
- Kornbluth, S., Yang, J., Powers, M. Analysis of the cell cycle using Xenopus egg extracts. Current protocols in cell biology / editorial board, Juan S. Bonifacino ... [et al.]. 11, (2006).
- Chan, R. C., Forbes, D. I. In vitro study of nuclear assembly and nuclear import using Xenopus egg extracts. Methods Mol Biol. 322, 289-300 (2006).
- Masui, Y., Markert, C. L. Cytoplasmic control of nuclear behavior during meiotic maturation of frog oocytes. The Journal of experimental zoology. 177, 129-145 (1971).
- Forbes, D. J., Kirschner, M. W., Newport, J. W. Spontaneous formation of nucleus-like structures around bacteriophage DNA microinjected into Xenopus eggs. Cell. 34, 13-23 (1983).
- Lohka, M. J., Masui, Y. Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components. Science. 220, 719-721 (1983).
- Newport, J. W., Kirschner, M. W. Regulation of the cell cycle during early Xenopus development. Cell. 37, 731-742 (1984).
- Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312, 237-242 (1984).
- Blow, J. J., Laskey, R. A. Initiation of DNA replication in nuclei and purified DNA by a cell-free extract of Xenopus eggs. Cell. 47, 577-587 (1986).
- Verma, R., et al. Ubistatins inhibit proteasome-dependent degradation by binding the ubiquitin chain. Science. 306, 117-120 (2004).
- Yu, H., King, R. W., Peters, J. M., Kirschner, M. W. Identification of a novel ubiquitin-conjugating enzyme involved in mitotic cyclin degradation. Curr Biol. 6, 455-466 (1996).
- Thorne, C. A., et al. Small-molecule inhibition of Wnt signaling through activation of casein kinase 1alpha. Nature Chemical Biology. 6, 829-836 (2010).
- Thorne, C. A., et al. A biochemical screen for identification of small-molecule regulators of the Wnt pathway using Xenopus egg extracts. Journal of Biomolecular Screening. 16, 995-1006 (2011).
- Hinkson, I. V., Elias, J. E. The dynamic state of protein turnover: It's about time. Trends in Cell Biology. 21, 293-303 (2011).
- Kinzler, K. W., Vogelstein, B. Lessons from Hereditary Colorectal Cancer. Cell. 87, 159-170 (1996).
- Lee, E., Salic, A., Kirschner, M. W. Physiological regulation of [beta]-catenin stability by Tcf3 and CK1epsilon. J Cell Biol. 154, 983-993 (2001).
- Lee, E., Salic, A., Krüger, R., Heinrich, R., Kirschner, M. W. The roles of APC and Axin derived from experimental and theoretical analysis of the Wnt pathway. PLoS Biology. 1, (2003).
- Seeling, J. M., et al. Regulation of beta-catenin signaling by the B56 subunit of protein phosphatase 2A. Science. 283, 2089-2091 (1999).
- Guger, K. A., Gumbiner, B. M. beta-Catenin has Wnt-like activity and mimics the Nieuwkoop signaling center in Xenopus dorsal-ventral patterning. Dev Biol. 172, 115-125 (1995).
- Cselenyi, C. S., et al. LRP6 transduces a canonical Wnt signal independently of Axin degradation by inhibiting GSK3's phosphorylation of β-catenin. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 8032-8037 (2008).
- Jernigan, K. K., et al. Gbetagamma activates GSK3 to promote LRP6-mediated beta-catenin transcriptional activity. Science Signaling. 3, (2010).
- Major, M. B., et al. Wilms tumor suppressor WTX negatively regulates WNT/beta-catenin signaling. Science. 316, 1043-1046 (2007).
- Cross, M. K., Powers, M. Obtaining eggs from Xenopus laevis females. J Vis Exp. , (2008).
- Cross, M. K., Powers, M. Preparation and fractionation of Xenopus laevis egg extracts. J Vis Exp. , (2008).
- Willis, J., DeStephanis, D., Patel, Y., Gowda, V., Yan, S. Study of the DNA damage checkpoint using Xenopus egg extracts. J Vis Exp. , (2012).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus Laevis : A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
- Rubinfeld, B., et al. Binding of GSK3β to the APC-β-Catenin Complex and Regulation of Complex Assembly. Science. 272, 1023-1026 (1996).
- Salic, A., King, R. W. Identifying small molecule inhibitors of the ubiquitin-proteasome pathway in Xenopus egg extracts. Methods in Enzymology. 399, 567-585 (2005).
- Trinkle-Mulcahy, L., et al. Identifying specific protein interaction partners using quantitative mass spectrometry and bead proteomes. J Cell Biol. 183, 223-239 (2008).
- Tan, C. W., et al. Wnt signalling pathway parameters for mammalian cells. PLoS One. 7, (2012).
