Summary
Se describe un método para el análisis de la degradación de proteínas usando radiomarcado y proteínas de fusión luciferasa-en extracto de huevo de Xenopus y su adaptación para la selección de alto rendimiento para moduladores de moléculas pequeñas de la degradación de proteínas.
Abstract
Extracto de huevo de Xenopus laevis es un bien caracterizado, sistema robusto para el estudio de la bioquímica de los diversos procesos celulares. Extracto de huevo de Xenopus se ha utilizado para estudiar el recambio de proteínas en muchos contextos celulares, incluyendo el ciclo celular y las vías de transducción de señales 1-3. En la presente memoria, se describe un método para el aislamiento de extracto de huevo de Xenopus que se ha optimizado para promover la degradación del componente de la ruta de Wnt crítico, β-catenina. Dos diferentes métodos se describen para evaluar la degradación de proteína β-catenina en el extracto de huevo Xenopus. Un método es visualmente informativo ([35 S]-radiomarcado proteínas), mientras que el otro se escala más fácilmente para ensayos de alto rendimiento (proteínas de fusión de luciferasa de luciérnaga-etiquetados). Las técnicas descritas se pueden utilizar para, pero no se limitan a, evaluar β-catenina recambio de proteínas e identificar componentes moleculares que contribuyen a su volumen de negocios. Además, el Abildad para purificar grandes volúmenes de extracto de huevo de Xenopus homogénea combinada con la lectura cuantitativa y fácil de proteínas de luciferasa de etiquetado permite que este sistema sea adaptado fácilmente para la selección de alto rendimiento para moduladores de la degradación de β-catenina.
Introduction
Extracto de huevo Xenopus laevis se ha utilizado ampliamente para estudiar muchos procesos biológicos celulares, incluyendo la dinámica del citoesqueleto, ensamblaje nuclear y la importación, la apoptosis, el metabolismo de la ubiquitina, la progresión del ciclo celular, la transducción de señales, y el recambio proteico 1-17. El sistema de extracto de huevo de Xenopus es susceptible al análisis bioquímico de una legión de procesos celulares debido extracto de huevo representa esencialmente citoplasma sin diluir que contiene todos los componentes citoplasmáticos esenciales necesarios para ejecutar estos procesos y permitir investigación. Grandes cantidades de extracto de huevo se pueden preparar de una sola vez para manipulaciones bioquímicas que requieren grandes cantidades de material (por ejemplo, la purificación de proteínas o cribado de alto rendimiento) 18-20. Otra ventaja es que la concentración de proteínas específicas en extracto de huevo de Xenopus puede ajustarse con precisión mediante la adición de proteína y / o inmunodepleción de EndoG recombinanteproteínas genas en contraste con la transfección de ADN de plásmido en donde es difícil de controlar la expresión de la proteína de interés. Además, la falta de proteínas recombinantes disponibles puede ser superado por la adición de las transcripciones que codifican la proteína de interés, tomando ventaja de la alta capacidad de la recién preparada de Xenopus de extracto de huevo para traducir ARNm añadidas de forma exógena.
La regulación de la degradación de proteínas es crítica para el control de muchas vías celulares y procesa 21. Extracto de huevo de Xenopus se ha utilizado ampliamente para estudiar la degradación de proteínas como el sistema permite múltiples formas de controlar el recambio de proteínas y sin influencias de confusión de la transcripción y la traducción. La vía de señalización de Wnt es una vía de señalización altamente conservadas que desempeña papeles críticos en el desarrollo y la enfermedad. El volumen de negocio de β-catenina, el principal efector de la vía Wnt, está muy regulada, y un aumento del estado de equilibrio lEvel de β-catenina es crítica para la activación de los genes diana de Wnt. La importancia de la degradación de β-catenina se pone de relieve por el hecho de que las mutaciones en la vía Wnt que inhiben la degradación de β-catenina encuentran en ~ 90% de todos los casos esporádicos de cáncer colorrectal 22. degradación de β-catenina por componentes de la vía Wnt puede ser recapitulado fielmente en extracto de huevo Xenopus para estudiar el mecanismo de su volumen de negocios, así como para identificar nuevos moduladores de molécula pequeña de su degradación 2, 19, 20, 23-29.
Los métodos para la preparación de extracto de huevo de Xenopus para estudiar el ciclo celular se han descrito en publicaciones anteriores JoVE 30-32. El protocolo actual describe una modificación de estos métodos y está optimizado para la degradación de [35 S]-radiomarcado β-catenina y luciferasa-etiquetados β-catenina enExtracto de huevo Xenopus. El ensayo de degradación radiomarcado permite la visualización directa de los niveles de proteína a través de la autorradiografía. [35 S] metionina se incorpora en la proteína de interés usando una reacción de traducción in vitro que luego se puede añadir directamente a una reacción de degradación. Además, el ensayo de volumen de negocios proteína radiomarcada no requiere un anticuerpo contra la proteína de interés o una etiqueta de epítopo, que puede influir en la estabilidad de proteínas. Debido a que incluso pequeños cambios en los niveles de proteína, tal como se refleja en cambios en la intensidad de la banda de proteína radiomarcada, se visualizan fácilmente por autorradiografía, el [35 S]-radiomarcado ensayo de degradación representa un método muy útil para la visualización de rotación de proteínas 2.
La fusión de β-catenina a luciferasa de luciérnaga (en adelante denominado simplemente "luciferasa") permite mediciones cuantitativas precisas y fáciles de los niveles de proteína, con el finpara determinar las propiedades cinéticas de rotación de β-catenina 19, 20. Una ventaja importante de el ensayo de luciferasa es que proporciona un fuerte sistema cuantitativo que se puede escalar fácilmente hasta. El siguiente protocolo proporciona métodos simples para el ensayo de degradación de β-catenina y un método robusto, eficiente y eficaz para la selección de alto rendimiento de nuevos moduladores β-catenina.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Preparación de extracto de huevo de Xenopus
NOTA: Cada rana produce aproximadamente 1 ml de extracto de huevo utilizable. Extractos de 10 ranas se preparan típicamente en un tiempo, y el volumen de tampón se describe a continuación es para la realización de un 10 rana Xenopus extracto de huevo de preparación. El volumen de tampón puede ser ajustada en consecuencia para las preparaciones más grandes o más pequeñas de extracto de huevo. Preps generados de esta manera producen consistentemente concentraciones de proteína ≥ 50 mg / ml. El proceso de recolección de los huevos y su transformación en extracto es más eficaz cuando se realiza por dos personas. (Para conocer las técnicas básicas de cría de la rana, ver Sive et al. 33).
- Huevo Colección
- Para cebar las ranas, se inyectan cada rana femenina con 100 U de Pregnant Mare Serum gonadotropina (PMSG) de un recién hecho 250 U / ml de valores. Utilice una jeringa de tuberculina 3 ml con una aguja de calibre 27 para inyectar por vía subcutánea, con el bisel dela aguja hacia arriba, en el saco linfático dorsal, que se encuentra aproximadamente a 1 cm de la línea media de los cambios de color con muescas a lo largo de la longitud de las patas de la rana.
- Tienda ranas cebados en el agua (además de NaCl 20 mM, ver Sive et al. 33) a 18 ° C durante 5-10 días. Para sistemas de tanques de agua estancada, la densidad de animales es de aproximadamente 4 litros de agua por la rana hembra. NOTA: El tiempo mínimo requerido para el cebado surta efecto es de 5 días, y los efectos de priming desgaste después de 10 días.
- Preparar Modificado Ringers (MMR) solución 0.5x de Marc desde una MMR de stock 20x. 20x MMR consiste de cloruro de sodio 2 M, cloruro de potasio 40 mM, cloruro de calcio 40 mM, cloruro de magnesio 20 mM y 100 mM de 4 - (2-hidroxietil)-1-piperazinetanosulfónico ácido (HEPES), pH 7,4.
- Configure cubos para todas las ranas inyectadas (una rana por 4 L cubeta). NOTA: Aunque más de una rana se puede colocar en la misma cubeta para la recolección de huevos, si una de las ranaspone huevos predominantemente de baja calidad, se requiere una cantidad sustancial de esfuerzo para separar los huevos de mala calidad de los que son adecuados para la fabricación de extracto. Por lo tanto, maximizar el número de ranas en el mismo tanque para minimizar la cantidad de búfer utilizado para el huevo recoge no vale la pena el riesgo.
- Inyectar 750 U gonadotropina coriónica humana (HCG) en el saco linfático dorsal de cada rana con una aguja 27 G como se describe en 1.1.1.
- Coloque cada una de las ranas de HCG-inyectado en cubos 4 L individuales que contienen MMR 0.5x enfría a 16 ° C.
- Coloque los recipientes con las ranas en una incubadora de 16 ° C para recoger los huevos O / N (15-16 h). NOTA: El mantenimiento de la temperatura adecuada es fundamental para todo el proceso, desde la recogida de los huevos para preparar el extracto de huevo.
- Dejellying Huevos
NOTA: Los huevos están cubiertos con una capa que debe ser eliminado antes de hacer extracto de jalea. La probabilidad de lisis espontánea de los huevos aumenta como el tiempo between la puesta de huevos y extraer los aumentos de preparación. Por lo tanto, es importante proceder a través de los siguientes pasos tan rápidamente como sea posible.- Preparar 4 l de 1x MMR, 50 ml de 0,1 x MMR, y 400 ml de 2% de cisteína, pH 7,7, hecho en agua destilada. Mantener todas las soluciones a 16 ° C.
- Para expulsar huevos adicionales, apriete suavemente la espalda baja y el abdomen de la rana.
- Retire las ranas y el grueso de la MMR, a dejar los huevos en aproximadamente 1 a 200 ml de MMR en cada cubo.
- Retire los residuos con una pipeta de transferencia, y evaluar la calidad de los huevos: huevos de alta calidad están marcados generalmente por una clara separación entre el hemisferio animal de pigmentación oscura y el hemisferio vegetal de color claro y tienen el mayor contraste de oscuro a claro. Deseche con una pipeta de transferencia de los huevos que aparecen fibrosa, moteado o lisadas (blanco e hinchados), ya que se reducirá la calidad del extracto. Si> 10% de los huevos son de mala calidad, todo ellote debe ser desechada.
- Combine los huevos en un vaso de precipitados de vidrio de 500 ml y derramar tanta MMR posible, manteniendo los huevos sumergidos.
- Enjuague los huevos agitando suavemente con el doble de volumen del huevo de MMR. Repita dos veces, y eliminar los residuos o los huevos, obviamente, de baja calidad.
- Añadir aproximadamente 100 ml de 2% de cisteína al vaso de precipitados vaso, revuelva suavemente para mezclar y dejar los huevos se asienten durante 5 min a 16 ° C. Se retira la cisteína. NOTA: Dejellying está marcada por la aparición gradual de capas jalea flotantes por encima de los huevos y el embalaje más compacto de los huevos ya que ahora ocupan un volumen más pequeño y sin la capa de gelatina.
- Añadir otros 100 ml de 2% de cisteína, agite suavemente, espere 5 minutos, y luego verter lentamente la cisteína. Repita hasta que los huevos se han convertido en muy compacto (por lo general por el tercer tratamiento cisteína). Nota: Si los huevos se dejan demasiado tiempo en cisteína, que son propensos a la lisis. Del mismo modo, los huevos dejellied son frágiles y propensos a la lisis mecánica si sese arremolinaba con demasiada fuerza o si se exponen al aire. Una vez que los huevos han sido dejellied, es importante proceder rápidamente a las etapas de centrifugación.
- Vierta de cisteína, y enjuagar la capa de jalea y otros desechos lavando suavemente los huevos en 1x MMR. Vierta tampón cuidadosamente a lo largo del lado del vaso de precipitados. Repita dos veces o hasta que la solución MMR ya no está nublado. Al enjuagar con 1x MMR seguir para eliminar los huevos malos utilizando una pipeta de transferencia.
- Realizar un enjuague suave final con 30 ml de 0,1 x MMR, y verter suavemente la mayor cantidad de la memoria intermedia como sea posible. Una vez más, sacar las larvas obviamente malas.
- Embalaje y Aplastamiento huevos por centrifugación
NOTA: El extracto se describe a continuación que se utiliza para la degradación de β-catenina es una variante del extracto de factor de citostático (metafase II-detenidos). En contraste con el extracto de baja velocidad y alta velocidad que se utiliza para los estudios del ciclo celular, el extracto de velocidad intermedia que funciona mejor para la degradación de β-catenina. Yoextracto nterphase promueve igual de firme degradación β-catenina, aunque es más laborioso de preparar.- Añadir leupeptina, pepstatina, mezcla de aprotinina (LPA, un inhibidor de la proteasa) en 10 g / ml (diluido a partir de una solución de 10 mg / ml en DMSO) y citocalasina D a 20 g / ml (diluido a partir de una solución madre de 10 mg / ml en DMSO) en los restantes 20 ml de 0,1 x MMR.
- Añade 0. X SPR con LPA y citocalasina D para los huevos lavados, agitar suavemente e incubar durante 5 minutos a 16 ° C.
- Transfiera los huevos en 16 ° C preenfriados 50 ml tubos de centrífuga, permita que los huevos se depositan, y eliminar el tampón residual de la parte superior. Para evitar la exposición al aire, retirar una pequeña cantidad de memoria intermedia en la pipeta de transferencia antes de retirar los huevos para la transferencia. Continuar para transferir los huevos adicionales en los tubos de centrífuga y eliminar el tampón residual de la parte superior del tubo hasta que los huevos llenar el tubo de centrífuga a la parte superior, que va a maximizar el rendimiento deextraer.
- Para empaquetar los huevos, tubos de centrífuga de centrifugado a 400 xg durante 60 segundos a 4 ° C usando un rotor de ángulo fijo. Eliminar el tampón residual de la parte superior de los tubos de centrífuga.
- Para el giro de trituración, girar los tubos a 15.000 xg durante 5 min a 4 ° C.
- Recogida de la Capa citoplásmica de Extracto
NOTA: El método descrito a continuación difiere del método clásico de perforar el lado del tubo de centrífuga con el fin de recoger la capa citoplasmática. Este protocolo ha sido adaptado para la simplificación y para su uso con tubos de centrífuga particulares, que son reutilizables. No hay diferencias notables en la cinética de la degradación de β-catenina se encuentran con cualquiera de los métodos. En este extracto de punto deben mantenerse fríos durante todo el proceso, y todos los pasos deben realizarse a 4 ° C.- Borrar de un agujero en la capa de lípidos utilizando puntas de pipeta P1000.
- Recoger la capa citoplasmática (entre la capa pigmentada oscura y la light capa lipídica) utilizando una nueva punta de pipeta P1000 en tubos de centrífuga previamente refrigerada limpias (Figura 1). Por extracto de alta calidad que degrada fuertemente β-catenina, minimizar la cantidad de capa pigmentada y de lípidos que se retira con la capa citoplasmática.
- Girar extrajo capa citoplasmática a 15.000 xg durante 10 min a 4 ° C y de nuevo recoger la capa citoplasmática. Repita el giro y la extracción 1X. NOTA: El extracto debe ser "de color paja." Si hay contaminación sustancial con las capas pigmentadas y de lípidos en este punto, se puede repetir el giro una vez más, a pesar de los giros excesivos pueden disminuir la capacidad del extracto de degradar β-catenina.
- Añadir LPA y citocalasina D para el extracto a concentraciones finales de 10 mg / ml cada uno. NOTA: Usando el método descrito produce una concentración bastante consistente de proteína total de aproximadamente 50 mg / ml (52,41 ± 5,40 mg / ml, n = 3 preparaciones separadas) en Xenopus por ejemplo,extractos g.
- (Opcional) Para los ensayos de traducción, añadir cubiertas ARNm (0,1 mg / ml), ARNsin (1,5 U / ml), y la mezcla de regeneración de energía (2.2.1) y se incuba la reacción a temperatura ambiente durante 2 horas (para más información ver sálica et . al 2 y Sive et al. 33). Utilice extracto traducido de inmediato para los ensayos de degradación de β-catenina o snap-congelado en nitrógeno líquido para su uso posterior. NOTA: extracto recién preparado tiene una alta capacidad de traducir exógenamente añadido ARNm, pero, por desgracia, esta capacidad se pierde una vez que el extracto se congela. Capsulado ARNm se puede preparar fácilmente usando kits disponibles comercialmente.
- Extracto de Snap-congelación en nitrógeno líquido. NOTA: Los extractos se almacenan en pequeños (200 l) alícuotas de un solo uso, ya que pierden rápidamente su capacidad para degradar β-catenina si volver a congelar. Para el almacenamiento a largo plazo, el extracto puede ser almacenado en nitrógeno líquido. Para almacenamiento a corto plazo, extracto puede ser almacenado a -80 ° C, aunque la capacidad de Oextracto de f para degradar β-catenina se puede reducir dramáticamente con el almacenamiento prolongado a -80 ° C (más de 2 meses).
2. Preparación de extracto para Ensayo de Degradación de β-catenina
- El agotamiento de Xenopus extracto
NOTA: Una ventaja importante de extracto de Xenopus es la capacidad para agotar fácilmente componentes de una vía y añadir precisamente de nuevo una cantidad definida de una proteína con el fin de determinar sus efectos dependientes de la dosis.- Utilice extracto de huevo Xenopus recién preparada o rápidamente descongelar el extracto y el lugar congelado en el hielo. Realice todas las manipulaciones en el frío.
- Añadir extracto a 1/10 el volumen de anticuerpo granulado o perlas de afinidad (por ejemplo, 20 ml de perlas sedimentadas a extracto de 200 ml). Con el fin de minimizar la dilución del extracto, retirar todo el líquido de las perlas como sea posible antes de la adición del extracto utilizando puntas de carga de gel con largos y puntas afiladas.
- Gire extracto-mezcla de microesferas a 4 º C durante 1 hora.
- Girar mezcla extracto-grano en 12.600 xg en microcentrífuga a 4 ° C durante 30 segundos. Alternativamente, si se utilizan perlas magnéticas, aplicar el campo magnético para recoger los granos.
- Transferencia agotado extracto a un tubo de microcentrífuga en hielo. Tenga cuidado de no transferir cuentas con el extracto.
- Confirmar eficiencia de agotamiento por inmunotransferencia tanto extracto empobrecido y los granos.
- Preparar el extracto para el ensayo de degradación de β-catenina como se describe en 2.2.
- Optimización de Xenopus Extracto de la degradación de β-catenina
NOTA: La degradación de β-catenina en el extracto de huevo Xenopus es un proceso dependiente de energía que agota rápidamente las reservas de ATP endógeno. En consecuencia, se requiere un sistema de regeneración de energía para mantener robusta degradación β-catenina.- Preparar un 20x regeneración de energía (ER) de mezcla que consta de 150 mM de fosfato de creatina, ATP 20 mM, 600 mg / ml de la creatina fosfoquinasa,y 20 mM MgCl 2. ER debe dividió en alícuotas y se almacenó a -80 ° C. Evite los ciclos de congelación / descongelación repetidos utilizando pequeñas alícuotas congeladas.
- Descongelar rápidamente extracto de huevo Xenopus frotando el tubo congelado entre manos. Coloque el tubo en hielo justo antes de todo el extracto se ha derretido.
- Añadir 10 l de mezcla de regeneración de energía (20x ER) en una alícuota (200 l) de extracto de huevo Xenopus. Mezclar bien pulse rápido un tubo y el pulso vórtice. Pulso-spin y colocar inmediatamente en hielo.
- (Opcional) El volumen de negocios de β-catenina se puede mejorar ligeramente en extracto de huevo Xenopus mediante la adición de la ubiquitina (1,25 mg / ml final). La cicloheximida (final de 0,1 mg / ml) también se puede añadir para reducir al mínimo la traducción de los transcritos endógenos.
- Alícuota de los volúmenes adecuados para el ensayo de degradación en tubos de microcentrífuga pre-refrigerados en hielo. Para los ensayos de degradación de β-catenina radiomarcados, se retiran 2-5 ml extraer para cada momento. </ Li>
3. Radiomarcados β-catenina ensayo de degradación en el extracto de huevo Xenopus
NOTA: Todos los pasos deben realizarse en el hielo a menos que se indique lo contrario.
- Preparación radiomarcados β-catenina
- Preparar recién sintetizado in vitro [35 S]-metionina proteína radiomarcada utilizando kits disponibles comercialmente. NOTA: La generación 35-S etiquetados (vida media de 87 días), las proteínas se producen fácilmente y eficientemente usando vitro acoplada kits de transcripción-traducción disponibles comercialmente en. Es importante que la proteína traducida está suficientemente marcado de tal manera que los cambios en el recambio de proteínas se pueden visualizar fácilmente.
- Para confirmar radiomarcaje éxito, realizar SDS-PAGE/autoradiography con 0,5 l de la proteína traducida. Cuantificar la intensidad de la banda de β-catenina radiomarcado utilizando ImageJ, ImageQuant, o un progr software cuantitativo alternativoam. NOTA: La banda de proteína β-catenina radiomarcado debe ser claramente visible en la película dentro de unas pocas horas (4-6 horas).
- Snap-congelar la proteína radiomarcada en nitrógeno líquido para el almacenamiento hasta su uso. Nota: El almacenamiento prolongado (> 2 meses) y múltiples de congelación / descongelación (mayor que 2) puede afectar gravemente a la capacidad de la radiomarcado β-catenina para degradar robustamente en extracto de huevo de Xenopus. Típicamente, la estabilidad de las proteínas radiomarcadas disminuye significativamente después de 1 mes de almacenamiento a -80 ° C; por lo tanto, radiomarcado β-catenina relativamente recién preparada da mejores resultados en estos ensayos de degradación.
- Realización del ensayo Degradación β-catenina
- Añadir 1-3 l (dependiendo de la fuerza de la señal de banda radiomarcada) de β-catenina en traducida in vitro (y otras proteínas, moléculas pequeñas, etc que se están probando) en 20 l de mezcla de reacción de Xenopus en hielo. Mezcle bien con la quickly agitando el tubo y un pulso corto de vórtice; este es un paso importante como extracto de huevo Xenopus es muy viscosa y mezcla incompleta afectará la consistencia de los resultados. Giro de pulso y colocar en hielo.
- Inicie la β-catenina reacción de degradación al cambiar los tubos a temperatura ambiente.
- En el punto de tiempo designado, eliminar 1-5 ml de la muestra y mezclar inmediatamente con tampón de muestra SDS (volumen 5x) para detener la reacción. Para asegurarse de que la reacción de degradación está completamente terminado, el tubo de película varias veces y agitar vigorosamente.
- Realice SDS-PAGE/autoradiography. Ejecutar 1 ml equivalentes (~ 50 mg de proteína) del extracto para cada punto / carril. La degradación de β-catenina en el extracto de huevo Xenopus debe ser evidenciado por la disminución dependiente del tiempo en la intensidad del radiomarcado β-catenina banda de la Figura 2. Cuantificar los resultados utilizando ImageJ, ImageQuant, u otro software de imagen de elección en caso de necesidad.
- (Optional) Soak gel de SDS-poliacrilamida en solución de fijación (ácido acético al 10% y 30% de metanol en agua destilada) antes del secado para disminuir la radioactividad de fondo y aumentar la calidad de la imagen.
4. Β-catenina-Luciferase Assay Degradación en Xenopus extracto de huevo
Realice todos los pasos en el hielo a menos que se indique lo contrario.
- Preparación de β-catenina-luciferasa
- Sintetizar no radiomarcado, luciferasa-etiquetados β-catenina usando el sistema acoplado de transcripción-traducción con la mezcla de aminoácidos completa.
- Confirmar la producción de la luciferasa-etiquetados β-catenina mediante la medición de la actividad de luciferasa 0,5 a 1 l de la reacción. Evaluar la luminiscencia de fondo mediante la medición de la luminiscencia a partir de una mezcla de reacción no traducida. NOTA: Los kits comerciales múltiples están disponibles para medir la actividad de la luciferasa. Luminiscencia de larga duración, sin embargo, funciona especialmente bien para la assa degradaciónY.
- Realización del ensayo Degradación β-catenina-luciferasa
- Descongelar y preparar el extracto de huevo Xenopus como en 2.2.
- Añadir vitro-fusión traducido en β-catenina-luciferasa (de 4.1) en la mezcla de reacción Xenopus preparado (de 2,2) en hielo y mezclar bien como en 3.2.1. NOTA: La actividad de la luciferasa de β-catenina que se añade al extracto es típicamente entre 20 - 50.000 unidades relativas de luminiscencia (RLU) / ml de extracto de (sobre la base de las mediciones obtenidos a partir de 4.1.2). Señal de salida debe ser de aproximadamente 100.000 RLU (2-5 ml de la β-catenina-luciferasa de fusión en traducida in vitro).
- Cambie el extracto de RT para iniciar la reacción de degradación.
- Eliminar una parte alícuota de la reacción en el momento indicado y complemento de congelación en nitrógeno líquido. NOTA: muestras por triplicado se eliminan típicamente para el análisis para cada punto de tiempo. Extracto congelado se puede almacenar a -80 ° C untIL que están listos para ser analizado.
- Descongelar las muestras de hielo, las muestras de transferencia a placas de 96 pocillos blancos estándar en el hielo, y el proceso para la actividad luciferasa.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Un esquema de la degradación de β-catenina en extracto de huevo de Xenopus se muestra en la Figura 2A. 35 marcado con S β-catenina se incubó en extracto de huevo de Xenopus, partes alícuotas (1 ml extraer equivalente) se eliminaron en los momentos apropiados, y las muestras se sometieron a SDS-PAGE seguida de autorradiografía. la degradación de β-catenina por componentes de la vía de Wnt está mediada por el sistema de ubiquitina-proteasoma 2, y la degradación de β-catenina [35 S]-radiomarcado en el extracto de Xenopus se inhibe por la adición del inhibidor de proteasoma MG132 Figura 2B. La degradación de β-catenina por componentes de la vía de Wnt es dependiente de su fosforilación por GSK3 34. Degradación de GSK3-dependiente puede demostrarse fácilmente en varias formas utilizando Xenopus extracto de huevo: 1) La β-catenina (SA) mutante (sitios de fosforilación GSK3 mutaron a alaninas) se estabiliza en Xenohuevo pus extracto en relación con de tipo salvaje proteína β-catenina Figura 2B. 2) inhibidores de moléculas pequeñas de la GSK3 (LiCl) de manera similar inhiben la degradación de β-catenina (Figura 2C). 3) Finalmente, el agotamiento de GSK3 de extracto de huevo de Xenopus inhibe la degradación de β-catenina; la degradación puede ser rescatado mediante la adición exógena de GSK3 figuras 2D-E.
El ensayo de la degradación de β-catenina radiomarcado proporciona una evaluación visual particularmente informativa de su modo de degradación (es decir, la degradación mediada por ubiquitina-frente a la escisión apoptótica). Autorradiografía, sin embargo, es un trabajo intensivo, y, en su mayor parte, limitado para el análisis de alto rendimiento de la vía (por ejemplo, el cribado de moduladores de molécula pequeña de la vía Wnt). El ensayo de la degradación de β-catenina-luciferasa es más fácil y rápidamente cuantificable como la cantidad de luminiscencia emitida es directamente proporcional a la mañanaporte de la proteína β-catenina-luciferasa. Esta característica hace que el ensayo de luciferasa simple y fácilmente adaptable para ensayos de alto rendimiento.
Es importante determinar que la fusión de luciferasa tiene propiedades similares a la de la proteína no de fusión. Esto se puede determinar empíricamente mediante la fusión de la proteína luciferasa a la N-terminal, C-terminal, o internamente. La fusión de luciferasa a la N-o C-terminal de β-catenina no afecta a su capacidad de activar genes diana de Wnt inculturados células de mamífero o su tasa de rotación en Xenopus extracto de huevo 2, 19, 20.
Un ensayo de degradación de β-catenina-luciferasa representante en extracto de huevo de Xenopus se muestra en la Figura 3A en la que la degradación de β-catenina-luciferasa se evaluó por SDS-PAGE/autoradiography de la actividad de la proteína luciferasa y radiomarcado de la fusión. La tasa de degradation de la β-catenina-luciferasa es similar a la proteína β-catenina sin etiquetar. La regulación de la degradación de la fusión β-catenina-luciferasa es esencialmente idéntica a la proteína no de fusión como la adición de LiCl o el agotamiento de GSK3 resultado en la inhibición de la β-catenina-luciferasa volumen de negocios. Como se muestra en las Figuras 3B-C, los cambios en la señal radiactiva de la proteína β-catenina-luciferasa es paralela a los cambios en la actividad enzimática de la luciferasa en el tiempo. Un problema que surge del uso de β-catenina-luciferasa (especialmente proteína de fusión generada a partir del sistema de transcripción-traducción in vitro) es la señal de luciferasa de fondo causado por el uso de los sitios de inicio de traducción internas o terminación de la traducción prematura Figura 3D. Este problema a veces se puede superar mediante la optimización de la concentración de ADN usada en la reacción de IVT. No obstante, se observa una disminución de la actividad de la luciferasa de fondo cuando variamosla concentración de ADN plásmido para nuestra construcción de β-catenina-luciferasa particular. Es probable que vamos a necesitar hacer una reingeniería de la proteína de fusión a través de mutagénesis con el fin de minimizar aún más los sitios internos de inicio de traducción y / o terminación de la traducción prematura de la proteína de fusión β-catenina-luciferasa. Debido a que la proteína luciferasa es bastante estable en el curso del tiempo de la reacción de degradación en Xenopus huevo extracto de la Figura 3A, sin embargo, esta señal de fondo se puede simplemente resta si la relación de la proteína luciferasa truncada a de longitud completa β-catenina de fusión es conocida .
Una fuerza de el ensayo de luciferasa es la capacidad de escalar a un formato de múltiples pocillos que permite realizar cribado de alto rendimiento para moduladores de la degradación de β-catenina. En la Figura 4, un análisis de tablero de ajedrez representativo se muestra el uso de un inhibidor de la degradación de β-catenina, MG132, que inhibe la proteasoma. El resultado del experimento de tablero de ajedrez indica que el ensayo es uniforme y reproducible en un formato de 96 pocillos y se demuestra su idoneidad para el cribado de alto rendimiento.
Figura 1. Una representación esquemática de la preparación de extracto concentrado de huevo de Xenopus. Se recogen los huevos de HCG con inyección de hembras de Xenopus laevis, compactadas con una baja velocidad (400 xg) de giro, y trituradas y separadas con una velocidad media (15.000 xg ) giro. Tenga cuidado para inyectar por vía subcutánea en el saco linfático dorsal, quitar los huevos mal cuidado, y separar con cuidado el extracto citoplasmático de alta calidad a partir del extracto oscuro de menor calidad como se indica en el texto.
igura 2 "fo: content-width =" 5in "fo: src =" / files/ftp_upload/51425/51425fig2highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51425/51425fig2.jpg "/>
Figura 2. Β-catenina robusta degrada cuando se incubaron en extracto de huevo de Xenopus. A) Un diagrama esquemático de un ensayo de degradación. B) [35 S] marcado con β-catenina preparado por una reacción de IVT se degrada con firmeza cuando se incubaron en extracto de huevo de Xenopus. La adición de MG132 (200 M) con extracto de huevo Xenopus inhibe la degradación de β-catenina. Mutación de alaninas de los phosphosites GSK3 dentro de β-catenina (β-catenina SA) o la adición de LiCl (25 mM) C) inhibe la degradación de β-catenina. D) El sitio de unión de la GSK3 Axin (aminoácidos 506 a 560) agota de manera eficiente GSK3 de extracto de huevo de Xenopus. E) extracto de huevo de Xenopus GSK3-empobrecido inhibe la degradación de β-catenina y puede ser rescatado mediante la adición Of GSK3 recombinante (0,1 mg / ml). La adición de LiCl (25 mm) bloquea la capacidad de GSK3 recombinante para rescatar a la degradación de β-catenina en el extracto de GSK3-agotado. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.
Figura 3. Luciferasa-etiquetados β-catenina se degrada cuando se incubaron en extracto de huevo de Xenopus. Una) radiomarcados β-catenina-luciferasa se degrada a una tasa similar a la de la proteína no etiquetada β-catenina. Al igual que con la proteína de tipo salvaje, la adición de LiCl (25 mM) inhibe-β-catenina luciferasa degradación. Luciferasa solos no gira notablemente en en Xenopus huevo extracto. Los cambios en la actividad de la luciferasa de la β-catenina-luciferfusión ase paralelo los cambios en sus niveles de proteína. B) La adición de LiCl (25 mM) o el agotamiento de GSK3 C) inhibe-β-catenina luciferasa facturación, evaluada mediante la actividad de la luciferasa. D) La inmunotransferencia para in vitro traducido β-catenina- luciferasa (utilizando un anticuerpo anti-luciferasa) reveló importantes cantidades de proteína luciferasa libre en ciertas preparaciones que probablemente contribuye a un segundo plano más alto en comparación con el ensayo de degradación radiomarcado. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.
Figura 4. Regulado la degradación de β-catenina-luciferasa en el extracto de Xenopus se puede adaptar aun formato de alto rendimiento. Un análisis de tablero de ajedrez representante para β-catenina-luciferasa usando MG132 (450 M) como un inhibidor de la degradación de β-catenina. Columnas sombreadas indican los pozos tratados con MG132 y columnas claros representan vehículo pozos (DMSO) tratados. Cuantificación y resultado del cálculo de Z-factor en una puntuación de 0,3 lo que indica un ensayo aceptable para el uso potencial en el cribado de alto rendimiento.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Extracto de huevo Xenopus es un sistema bioquímico sólida para la investigación de rotación β-catenina. La concentración de β-catenina en el extracto de huevo Xenopus es de ~ 25 nM 2. En condiciones óptimas, el extracto de huevo es capaz de degradar β-catenina a una velocidad de 50-100 nM / h, y es mitad de la máxima a 200 nM 24. Hay varios pasos críticos para la reconstitución exitosa de la degradación de β-catenina usando extracto de huevo Xenopus. Estos incluyen 1) la generación de la alta calidad de Xenopus extracto de huevo y la manera en que se prepara el extracto de huevo, 2) la generación de calidad radiomarcado β-catenina y la proteína β-catenina-luciferasa, 3) optimización de las condiciones de reacción para apoyar la degradación de β-catenina, y 4 ) procesamiento adecuado de puntos de tiempo de reacción.
Una preparación de alta calidad de extracto de huevo de Xenopus en el que β-catenina se degrada fuertemente depende tanto de la calidad de the huevos y cómo los huevos se manejan antes de la etapa de trituración, así cómo el extracto se centrifugó posteriormente para obtener el extracto final. Como se mencionó en el protocolo, es importante asegurarse de que se utilizan sólo huevos de alta calidad (acreditados por fuerte contraste entre el hemisferio oscuro del animal y el hemisferio vegetal ligero), que los huevos de mala calidad (bocanadas fibrosos, moteadas o blancas) se retiran a lo largo el proceso, que los huevos se mantienen a una temperatura fresca (16 ° C) durante todo el procedimiento, y que el procedimiento se lleva a cabo lo más rápidamente posible. Es importante no sacrificar la calidad por la cantidad de extracto. Además, como se mencionó anteriormente, los huevos de una rana que pone los huevos de mala calidad (> 10%) deben ser totalmente descartados.
El extracto descrito anteriormente es una modificación de la meiosis II-detenido extracto CSF 11. La preparación de extracto de huevo Xenopus para la degradación de β-catenina (extracto de velocidad intermedia) diffres a partir de extractos clásicos preparados para el estudio del ciclo celular 30-32, que son de baja velocidad o alta velocidad extractos 35. Adaptación extracto de huevo Xenopus para la degradación de otras proteínas óptima puede requerir la alteración de la velocidad de centrifugación y el número de vueltas. Extracto de baja velocidad contiene orgánulos intactos y otros componentes celulares de gran tamaño. Por lo tanto, giros de mayor velocidad alterarán la composición del extracto y potencialmente eliminar los componentes inhibidores y / o esenciales que afectan a la degradación de la proteína de interés. La preparación de extracto de velocidad intermedia en el presente documento se describe está optimizado para la degradación de β-catenina por componentes de la vía de Wnt. Rotar el extracto mayor que 4X puede disminuir de manera significativa la capacidad del extracto para degradar β-catenina (aunque tiene un efecto mínimo sobre la degradación de otro componente de Wnt, Axin). β-catenina es susceptible a la proteolisis mediada por caspasa en el extracto de giro a baja velocidad y no noticeably degradarse en el extracto de giro de alta velocidad. Por lo tanto, es probable que diferentes extractos de velocidad será óptima para la degradación de los componentes de otras vías de señalización.
La generación de 35 S-β-catenina y β-catenina-luciferasa se puede realizar usando un número de kits disponibles comercialmente. La producción de proteínas usando sistemas acoplados de transcripción-traducción es altamente dependiente de la calidad del plásmido: midi-preparaciones altamente puros de plásmidos funcionan mejor y son más fiables en comparación con mini-preparaciones de ADN. Para radiomarcaje β-catenina, recién obtenido [35 S] metionina o Translabel ([35 S] metionina más [35 S] cisteína) se prefiere. Tenga en cuenta que la metionina y la cisteína tanto tienen una tendencia a oxidarse con un almacenamiento prolongado disminuyendo de ese modo su incorporación en β-catenina en la reacción de transcripción-traducción in vitro acoplada. Debido a que el almacenamiento prolongado y repetido de congelación-descongelaciónciclos pueden inhibir la degradación, pequeñas cantidades de la radiomarcado β-catenina se preparan en un momento y utilizan poco después.
La cantidad de proteína traducida y el número de metioninas en la proteína de determinar la fortaleza de la señal de radiomarcado. Para β-catenina, no debería haber problemas para obtener fuertes señales radiactivas para ensayos de degradación. Para las proteínas con pocos metioninas y / o que no se traducen bien, a [35 S] metionina y [35 S] mezcla cisteína se puede utilizar en lugar de [35 S] metionina y / o ha agregado una etiqueta de epítopo (Myc) que contiene múltiples metioninas. Aunque el éxito con varios plásmidos de expresión que contienen los promotores de fagos apropiados (T7, T3, y SP6) se puede obtener por reacciones in vitro de transcripción-traducción in, basado en el plásmido pCS2 generalmente da los mejores resultados. Además, la señal de la proteína traducida a veces se puede aumentar dramáticamente mediante la supresión de la endógena 5'UTR. Por último, para los experimentos a gran escala (por ejemplo, cribado de alto rendimiento), puede ser necesaria una gran cantidad de β-catenina-luciferasa recombinante. β-catenina-luciferasa del / sistema de baculovirus Sf9 se degrada con una cinética similar como la de tipo salvaje β-catenina en el extracto de Xenopus y embriones 2. Alternativamente, un alto rendimiento en el sistema de expresión in vitro (por ejemplo, germen de trigo-basados) ha sido utilizado con éxito para la selección de alto rendimiento 19, 20.
Con el fin de medir con fiabilidad la degradación de β-catenina en el sistema de extracción, es importante que la señal inicial de cualquiera de la β-catenina radiomarcado o la luciferasa β-catenina de fusión es suficientemente robusto. Por lo tanto, una cierta cantidad de la optimización por el experimentador en el tamaño del ensayo de degradación, el número de puntos de tiempo necesario, y la eficiencia de la Wi reacción de traducción in vitroll se requiera. En el montaje de la reacción de degradación, hay varios pasos que pueden tomarse para mejorar la posibilidad de obtener la degradación robusto. En primer lugar, todos los reactivos deben ser descongeladas rápidamente y se colocan en hielo antes de su descongelación completa. Debido a que la degradación de β-catenina es altamente dependiente de la energía, es importante que la ER es relativamente fresco. En segundo lugar, extracto de huevo de Xenopus es viscoso, y es crítico que la reacción se mezcla a fondo después de la adición de la fusión β-catenin/β-catenin-luciferase radiomarcado, ER, proteína, moduladores de molécula pequeña, etc En tercer lugar, de pre-incubación de la reacción mezclar durante 20-30 min en hielo da resultados más reproducibles al probar los efectos de moduladores de molécula pequeña.
La capacidad de agotar las proteínas a partir de extracto de huevo Xenopus representa una poderosa herramienta para evaluar la función de las proteínas y sus efectos dependientes de la concentración. A modo de ejemplo, se demuestra que el ozono GSK3 de Xenopus bloques extracto de huevo de la degradación de β-catenina, lo que indica el importante papel de la GSK3 β en la facturación-catenina. Tendrá que ser determinado empíricamente para diferentes proteínas diferentes condiciones de agotamiento. Por ejemplo, las proteínas abundantes requerirán un aumento en la cantidad de anticuerpos o de afinidad ligando cuentas utilizadas para lograr el agotamiento completo. Un buen punto de partida es el uso de perlas empaquetadas en un décimo del volumen del extracto con el fin de minimizar la dilución de extracto. Además de la fuerza de la unión del ligando anticuerpo / afinidad a la proteína diana, el tipo de perlas (por ejemplo, sefarosa, agarosa, o magnético) usado puede afectar a la eficiencia de agotamiento de la proteína de Xenopus extracto de huevo 36. Finalmente, sería ideal para analizar el grado de agotamiento (típicamente por inmunotransferencia). Una vez que se completa la reacción β-catenina, la manera en que se procesan las muestras puede afectar en gran medida los resultados del experimento. La concentración deXenopus huevo preparaciones de extracto preparado de la manera descrita es 52,41 mg / ml ± 5,40 mg / ml, y es importante no sobrecargar la capacidad del gel de SDS-PAGE; esto no es un problema con el ensayo de luciferasa-β-catenina. Por lo tanto, para cada punto de tiempo, no más de 1 ml de equivalentes de extracto deben ser cargados en cada carril de un gel de SDS-PAGE. Para mejorar aún más la calidad de los resultados, la etapa de fijación de gel (opcional) disminuirá radioactividad de fondo y aumentar la relación señal-ruido. Para el ensayo de luciferasa, una disminución con respecto a una señal inicial de 100.000 RLU en el extracto de huevo Xenopus refleja fielmente el cambio en los niveles de proteína de la proteína de fusión β-catenina-luciferasa.
El sistema de extracto de huevo de Xenopus representa un sistema atractivo para estudiar la regulación de la degradación de β-catenina. El sistema de extracción permite el control preciso de la concentración de proteínas individuales a través de agotamiento y reconstitución ción. La capacidad para controlar sus efectos sobre la cinética de la rotación de β-catenina en el tiempo permite una mejor comprensión del mecanismo bioquímico de este paso crucial en la transducción de señales Wnt. Tales manipulaciones han proporcionado un entendimiento profundo de las complejas interacciones moleculares entre los componentes de la vía Wnt y eran críticas para el desarrollo de la primera modelo matemático de la vía Wnt 24. Una advertencia es que se han encontrado las concentraciones de componentes de la ruta de Wnt en extracto de huevo de Xenopus y lisados de células de mamífero para diferir, posiblemente reflejando las diferencias en la forma en que la ruta de Wnt está regulada durante la embriogénesis en comparación con la situación de adultos 37. La capacidad para realizar ensayos tanto radiactivos y enzimáticos, basado en la luciferasa utilizando extracto de huevo Xenopus brinda mayor poderosos instrumentos cualitativos y cualitativos complementarios para el estudio de la regulación bioquímica de la degradación de β-catenina.
t "> Además de supervisar la facturación de β-catenina, la degradación del regulador negativo de Wnt, Axin, se puede controlar en extracto de huevo de Xenopus, ya sea como una proteína radiomarcada o fusión de luciferasa. Uso de una variante de la luciferasa, de Renilla, fusionado a Axin, se adaptó anteriormente para el ensayo de degradación de la luciferasa en un formato de alto rendimiento para cribar simultáneamente para los moduladores de dos proteínas de la vía de Wnt, β-catenina y Axin 19, 20. Esta pantalla bioquímica identificó el fármaco, pyrvinium aprobado por la FDA que el aumento y disminución de la tasa de degradación de β-catenina y Axin, respectivamente, en Xenopus extracto de huevo 19. pyrvinium fue posteriormente validado en células humanas cultivadas y en diversos organismos modelo (por ejemplo, Xenopus y C. elegans) como un inhibidor de molécula pequeña de la vía canónica de Wnt vía. En resumen, el sistema de extracto de huevo de Xenopus es un versátil sistema bioquímico del that puede ser explotado en una multitud de maneras de estudiar el mecanismo de la señalización de Wnt, así como para la identificación de moduladores de molécula pequeña de la vía Wnt. El método bioquímico descrito en el presente documento se puede aplicar a otras vías de señalización en el que la degradación de proteínas pueden jugar un papel crítico.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Damos las gracias a Laurie Lee para la lectura crítica del manuscrito. TWC se apoya en una beca predoctoral de la American Heart Association (12PRE6590007). MRB es apoyado por una beca de formación del Instituto Nacional del Cáncer (CA119925 T32). SSH está apoyada por los Institutos Nacionales de Salud (R01DK078640). EL es apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (R01GM081635 y R01GM103926).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) | ProSpec | hor-272-A | Reconstituted with distilled water before use. |
| Human chorionic gonadotropin | Sigma | CG10-10VL | |
| Potassium chloride | Fisher | BP366-1 | |
| Sodium chloride | Research Products International | S23020-5000.0 | |
| Magnesium chloride | Fisher | BP214-500 | |
| Calcium chloride | Acros Organics | AC42352-5000 | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Cysteine | Acros Organics | AC17360-1000 | |
| Leupeptin | Sigma | L2884-10MG | |
| Aprotinin | Sigma | A1153-10MG | |
| Pepstatin | Sigma | P4265-5MG | |
| Cytochalasin B | Sigma | C8273-10MG | |
| 3 ml syringe: Luer Lock tip | Becton Dickinson | 309657 | |
| 27 G needle | Becton Dickinson | 305109 | |
| 96 well solid white polystyrene microplate, round bottomed | Corning | 3605 | |
| Steady-Glo luciferase assay system | Promega | E2520 | Store long-term at -80 °C, can store for up to 1 month at -20 °C |
| TNT Sp6 coupled reticulocyte lysate system | Promega | L4600 | |
| TNT Sp6 high-yield wheat germ protein expression system | Promega | L3260 | Generally higher yield than reticulocyte lysate |
| EasyTag Express protein labeling mix [S35] | Perkin Elmer | NEG772007MC | |
| Creatine phosphate | Sigma | 27920-5G | |
| ATP | Sigma | A2383-5G | |
| Creatine phosphokinase | Sigma | C3755-35KU | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418-50ML | |
| Dual-Glo luciferase assay system | Promega | E2920 | Same storage conditions as Steady-Glo |
| 50 ml Centrifuge tubes | Fisher Scientific | 0556214D | |
| Sorvall SS-34 fixed angle rotor | Thermo Scientific | 28020 | |
| 115 V 50/60 Hz Minicentrifuge | Fisher Scientific | 05-090-128 | |
| mMessage mMachine Sp6 kit | Ambion | AM1340 | |
| Anti-firefly luciferase antibody | Abcam | ab16466 | |
| Anti-GSK3 antibody | BD Transduction Laboratories | 610201 | |
| FLUOStar Optima | BMG Labtech | ||
| Sorvall RC-6 Plus centrifuge | Thermo Scientific | ||
| 16 °C Incubator | Percival Scientific |
References
- Glotzer, M., Murray, A. W., Kirschner, M. W. Cyclin is degraded by the ubiquitin pathway. Nature. 349, 132-138 (1991).
- Salic, A., Lee, E., Mayer, L., Kirschner, M. W. Control of beta-catenin stability: reconstitution of the cytoplasmic steps of the wnt pathway in Xenopus egg extracts. Molecular Cell. 5, 523-532 (2000).
- Murray, A. W. Cell cycle extracts. Methods in cell biology. 36, 581-605 (1991).
- Dabauvalle, M. C., Scheer, U. Assembly of nuclear pore complexes in Xenopus egg extract. Biology of the cell / under the auspices of the European Cell Biology Organization. 72, 25-29 (1991).
- Tutter, A. V., Walter, J. C. Chromosomal DNA replication in a soluble cell-free system derived from Xenopus eggs. Methods Mol Biol. 322, 121-137 (2006).
- Theriot, J. A., Rosenblatt, J., Portnoy, D. A., Goldschmidt-Clermont, P. J., Mitchison, T. J. Involvement of profilin in the actin-based motility of L. monocytogenes in cells and in cell-free extracts. Cell. 76, 505-517 (1994).
- Maresca, T. J., Heald, R. Methods for studying spindle assembly and chromosome condensation in Xenopus egg extracts. Methods Mol Biol. 322, 459-474 (2006).
- Shennan, K. I. Xenopus egg extracts: a model system to study proprotein convertases. Methods Mol Biol. 322, 199-212 (2006).
- Kornbluth, S., Yang, J., Powers, M. Analysis of the cell cycle using Xenopus egg extracts. Current protocols in cell biology / editorial board, Juan S. Bonifacino ... [et al.]. 11, (2006).
- Chan, R. C., Forbes, D. I. In vitro study of nuclear assembly and nuclear import using Xenopus egg extracts. Methods Mol Biol. 322, 289-300 (2006).
- Masui, Y., Markert, C. L. Cytoplasmic control of nuclear behavior during meiotic maturation of frog oocytes. The Journal of experimental zoology. 177, 129-145 (1971).
- Forbes, D. J., Kirschner, M. W., Newport, J. W. Spontaneous formation of nucleus-like structures around bacteriophage DNA microinjected into Xenopus eggs. Cell. 34, 13-23 (1983).
- Lohka, M. J., Masui, Y. Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components. Science. 220, 719-721 (1983).
- Newport, J. W., Kirschner, M. W. Regulation of the cell cycle during early Xenopus development. Cell. 37, 731-742 (1984).
- Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312, 237-242 (1984).
- Blow, J. J., Laskey, R. A. Initiation of DNA replication in nuclei and purified DNA by a cell-free extract of Xenopus eggs. Cell. 47, 577-587 (1986).
- Verma, R., et al. Ubistatins inhibit proteasome-dependent degradation by binding the ubiquitin chain. Science. 306, 117-120 (2004).
- Yu, H., King, R. W., Peters, J. M., Kirschner, M. W. Identification of a novel ubiquitin-conjugating enzyme involved in mitotic cyclin degradation. Curr Biol. 6, 455-466 (1996).
- Thorne, C. A., et al. Small-molecule inhibition of Wnt signaling through activation of casein kinase 1alpha. Nature Chemical Biology. 6, 829-836 (2010).
- Thorne, C. A., et al. A biochemical screen for identification of small-molecule regulators of the Wnt pathway using Xenopus egg extracts. Journal of Biomolecular Screening. 16, 995-1006 (2011).
- Hinkson, I. V., Elias, J. E. The dynamic state of protein turnover: It's about time. Trends in Cell Biology. 21, 293-303 (2011).
- Kinzler, K. W., Vogelstein, B. Lessons from Hereditary Colorectal Cancer. Cell. 87, 159-170 (1996).
- Lee, E., Salic, A., Kirschner, M. W. Physiological regulation of [beta]-catenin stability by Tcf3 and CK1epsilon. J Cell Biol. 154, 983-993 (2001).
- Lee, E., Salic, A., Krüger, R., Heinrich, R., Kirschner, M. W. The roles of APC and Axin derived from experimental and theoretical analysis of the Wnt pathway. PLoS Biology. 1, (2003).
- Seeling, J. M., et al. Regulation of beta-catenin signaling by the B56 subunit of protein phosphatase 2A. Science. 283, 2089-2091 (1999).
- Guger, K. A., Gumbiner, B. M. beta-Catenin has Wnt-like activity and mimics the Nieuwkoop signaling center in Xenopus dorsal-ventral patterning. Dev Biol. 172, 115-125 (1995).
- Cselenyi, C. S., et al. LRP6 transduces a canonical Wnt signal independently of Axin degradation by inhibiting GSK3's phosphorylation of β-catenin. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 8032-8037 (2008).
- Jernigan, K. K., et al. Gbetagamma activates GSK3 to promote LRP6-mediated beta-catenin transcriptional activity. Science Signaling. 3, (2010).
- Major, M. B., et al. Wilms tumor suppressor WTX negatively regulates WNT/beta-catenin signaling. Science. 316, 1043-1046 (2007).
- Cross, M. K., Powers, M. Obtaining eggs from Xenopus laevis females. J Vis Exp. , (2008).
- Cross, M. K., Powers, M. Preparation and fractionation of Xenopus laevis egg extracts. J Vis Exp. , (2008).
- Willis, J., DeStephanis, D., Patel, Y., Gowda, V., Yan, S. Study of the DNA damage checkpoint using Xenopus egg extracts. J Vis Exp. , (2012).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus Laevis : A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
- Rubinfeld, B., et al. Binding of GSK3β to the APC-β-Catenin Complex and Regulation of Complex Assembly. Science. 272, 1023-1026 (1996).
- Salic, A., King, R. W. Identifying small molecule inhibitors of the ubiquitin-proteasome pathway in Xenopus egg extracts. Methods in Enzymology. 399, 567-585 (2005).
- Trinkle-Mulcahy, L., et al. Identifying specific protein interaction partners using quantitative mass spectrometry and bead proteomes. J Cell Biol. 183, 223-239 (2008).
- Tan, C. W., et al. Wnt signalling pathway parameters for mammalian cells. PLoS One. 7, (2012).
