Summary
Ett förfarande beskrivs för att analysera proteinnedbrytning med användning av radiomärkt och luciferas-fusionsproteiner i Xenopus äggextrakt och dess anpassning för high-throughput screening för småmolekylära modulatorer av proteinnedbrytning.
Abstract
Xenopus laevis ägg extrakt är en väldefinierad, robust system för att studera biokemi olika cellulära processer. Xenopus ägg extrakt har använts för att studera proteinomsättningen i många cellulära sammanhang, bland annat cellcykeln och signaltransduktionsvägar 1-3. Häri beskrivs ett förfarande för isolering av Xenopus äggextrakt som har optimerats för att främja nedbrytningen av den kritiska Wnt banan komponent, β-catenin. Två olika metoder har beskrivits för att utvärdera β-catenin proteinnedbrytning i Xenopus äggextrakt. En metod är visuellt informativa ([35S]-märkt protein), medan den andra är mer lätt skalas för high-throughput analyser (eldflugeluciferas-märkta fusionsproteiner). De tekniker som beskrivs kan användas för, men är inte begränsade till, bedöma β-catenin proteinomsättning och identifiera molekylära komponenter som bidrar till dess omsättning. Dessutom fartyhet för att rena stora mängder homogen Xenopus äggextrakt kombination med den kvantitativa och enkel avläsning av luciferas-taggade proteiner tillåter detta system för att enkelt anpassas för high-throughput screening för modulatorer av β-catenin nedbrytning.
Introduction
Xenopus laevis ägg extrakt har använts i stor utsträckning för att studera många cellbiologiska processer inklusive cytoskelettala dynamik, kärn montering och import, apoptos, ubiquitin metabolism, cellcykelreglering, signaltransduktion och proteinomsättningen 1-17. Xenopus äggextrakt systemet är mottaglig för den biokemiska analysen av en legion av cellulära processer eftersom ägg extrakt representerar i huvudsak outspädd cytoplasma som innehåller alla viktiga cytoplasma komponenter som krävs för att genomföra dessa processer och möjliggör utredning. Stora mängder ägg extrakt kan förberedas på en gång för biokemiska manipulationer som kräver stora mängder material (t.ex. proteinrening eller high-throughput screening) 18-20. En annan fördel är att koncentrationen av specifika proteiner i Xenopus äggextrakt kan justeras exakt genom tillsats av rekombinant protein och / eller immunotömning av endogenous proteiner i motsats till transfektion av plasmid-DNA, där expression av proteinet av intresse är svårt att kontrollera. Dessutom kan avsaknaden av tillgängliga rekombinanta proteiner övervinnas genom tillsats av transkript som kodar för proteinet av intresse och dra fördel av den nyberedda Xenopus äggextrakt höga kapacitet att översätta exogent tillsatta mRNA.
Regleringen av proteinnedbrytning är avgörande för kontrollen av många cellulära vägar och processer 21. Xenopus ägg extrakt har använts i stor utsträckning för att studera proteinnedbrytning som systemet tillåter flera sätt att övervaka proteinomsättningen utan confounding influenser av transkription och translation. Den Wnt signalväg är ett starkt konservativa signalväg som spelar avgörande roller i utveckling och sjukdom. Omsättningen av β-catenin, den stora effektor av den Wnt banan, är hårt reglerad, och en ökad jämvikts lEvel av β-catenin är kritiskt för aktivering av Wnt mål gener. Vikten av β-catenin nedbrytning markeras av att mutationer i den Wnt banan som hämmar β-catenin nedbrytning som finns i ~ 90% av alla sporadiska fall av kolorektal cancer 22. β-catenin nedbrytning av komponenter i den Wnt banan kan troget rekapituleras i Xenopus ägg extrakt för att studera mekanismen av omsättningen samt att identifiera nya småmolekylära modulatorer av dess nedbrytning 2, 19, 20, 23-29.
Metoder för framställning av Xenopus äggextrakt för att studera cellcykeln har beskrivits i tidigare jove publikationer 30-32. Den nuvarande protokollet beskriver en modifiering av dessa metoder och är optimerad för nedbrytningen av [35S]-märkt β-catenin och luciferas-taggade β-catenin iXenopus ägg extrakt. Analys Den radiomärkta nedbrytning möjliggör direkt visualisering av proteinnivåer genom autoradiografi. [35 S] metionin införlivas i proteinet av intresse med användning av en in vitro-translationsreaktion som sedan kan tillsättas direkt till ett reaktions nedbrytning. Dessutom tar analys den radioaktivt märkta proteinomsättning inte kräva en antikropp mot proteinet av intresse eller en epitopmärkning, som kan påverka proteinstabilitet. Därför att även små förändringar i proteinnivåer, vilket avspeglas i förändringar i intensiteten av det radioaktivt märkta proteinband, lätt visualiseras genom autoradiografi, den [35 S]-märkt analys nedbrytning utgör en mycket användbar metod för visualisering av proteinomsättningen 2.
Fusion av β-catenin till eldfluga luciferas (nedan kallat bara "luciferas") möjliggör exakta och facile kvantitativa mätningar av proteinnivåer, i syfteatt bestämma de kinetiska egenskaperna hos β-catenin omsättning 19, 20. En stor fördel med den luciferas-analysen är att det ger en stark kvantitativ system som lätt skalas upp. Följande protokoll ger enkla metoder för analys av β-catenin nedbrytning och en robust, effektiv och effektiv metod för high-throughput screening av nya β-catenin modulatorer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Framställning av Xenopus äggextrakt
OBS: Varje groda ger ungefär 1 ml användbar ägg extrakt. Extrakt från 10 grodor framställs typiskt vid en tid, och den volym buffert som beskrivs nedan är för att utföra en 10 grodan Xenopus äggextrakt prep. Buffertvolymen kan justeras i enlighet därmed för större eller mindre beredningar av ägg extrakt. Preps alstras på detta sätt genomgående bildning av proteinkoncentrationer ≥ 50 mg / ml. Processen att samla in ägg och bearbeta dem i extrakt är mest effektiva när de genomfördes av två personer. (För grundläggande groda djurhållningsmetoder, se Sive et al. 33).
- Egg Collection
- För prime grodorna, injicera varje kvinnlig groda med 100 E Gravida Mare Serum gonadotropin (PMSG) från en nyligen gjord 250 U / ml lager. Använd en tuberkulinspruta 3 ml med en 27 G nål för att injicera subkutant med avfasning avnålen uppåt, in i rygg lymfan sac, som ligger ca 1 cm från mittlinjen från hack missfärgningar längs längden av benen på grodan.
- Store primade grodor i vatten (plus 20 mM NaCl, se Sive et al. 33) vid 18 ° C under 5 till 10 dagar. För stående vatten tanksystem, är den djurtäthet ca 4 liter vatten per kvinnliga groda. OBS: Den minsta tid som krävs för grundning för att träda i kraft är 5 dagar, och effekterna av priming gå över efter 10 dagar.
- Förbered 0,5 x Marcs Modifierad Ringers (MMR)-lösning från en 20x MMR lager. 20x MMR består av 2 M natriumklorid, 40 mM kaliumklorid, 40 mM kalciumklorid, 20 mM magnesiumklorid och 100 mM 4 - (2-hydroxietyl)-1-piperazinetansulfonsyra (HEPES), pH 7,4.
- Ställ in hinkar för alla injicerade grodor (en groda per 4 L hink). OBS: Även om mer än en groda kan placeras i samma hink för insamling av ägg, om en av de grodorinnehåller övervägande dålig kvalitet ägg, kommer en betydande mängd ansträngning krävs för att separera dålig kvalitet ägg från de som är lämpliga för att göra extrakt. Således, att maximera antalet grodor i samma tank för att minimera mängden buffert används för ägg samla är inte värt risken.
- Injicera 750 U humant koriongonadotropin (HCG) i rygg lymfan säcken för varje groda med hjälp av en 27 G nål enligt 1.1.1.
- Placera var och en av HCG-injicerade grodor i enskilda 4 L hinkar som innehåller 0,5 x MMR kyls till 16 ° C.
- Placera behållare med grodor i en 16 ° C inkubator för att samla ägg O / N (15-16 h). OBS: Att upprätthålla rätt temperatur är avgörande för hela proceduren, från att samla ägg att förbereda ägg extrakt.
- Dejellying Ägg
OBS: Ägg är täckta med en gelé päls som måste avlägsnas innan du köper extrakt. Sannolikheten för spontan lys av äggen ökar när tiden mellan äggläggningen och extrahera förberedelse ökar. Således är det viktigt att fortsätta genom de följande stegen så snabbt som möjligt.- Förbered 4 L av 1x MMR, 50 ml av 0,1 x MMR, och 400 ml av 2% cystein, pH 7,7, som gjorts i destillerat vatten. Behåll alla lösningar vid 16 ° C.
- För att driva ut ytterligare ägg, försiktigt pressa nedre delen av ryggen och magen av grodan.
- Ta grodorna och huvuddelen av MMR, att lämna äggen i ca 1-200 ml MMR i varje hink.
- Ta bort skräp med en överföringspipett och bedöma kvaliteten på äggen: högkvalitativa ägg är i allmänhet märkta med en tydlig åtskillnad mellan det mörkt pigmenterade djuret halvklotet och den lätt färgade växthalvklotet och har den högsta dark-till-ljus kontrast. Kasta med en överföringspipett några ägg som visas trådiga, fläckiga eller lyserade (vitt och fluffigt), eftersom de kommer att minska den totala kvaliteten av extraktet. Om> 10% av äggen är av dålig kvalitet, helaparti ska kasseras.
- Kombinera ägg i en 500 ml glasbägare och häll på så mycket MMR som möjligt samtidigt som ägg under vatten.
- Skölj äggen av försiktig rote med dubbelt ägget volymen MMR. Upprepa två gånger, och ta bort eventuellt skräp eller uppenbart dålig kvalitet ägg.
- Tillsätt ca 100 ml av 2% cystein till glasbägare, virvla försiktigt för att blanda och låt ägg sedimentera under 5 minuter vid 16 ° C. Häll av cystein. OBS: Dejellying markeras av den gradvisa uppkomsten av gelé rockar flyter ovanför äggen och mer kompakt förpackning av äggen som de nu upptar en mindre volym utan gelé pälsen.
- Lägg till ytterligare 100 ml 2% cystein, snurra försiktigt, vänta 5 minuter, och sedan långsamt häll bort cystein. Upprepa tills äggen har blivit hårt packad (vanligen genom den tredje cystein behandling). OBS: Om äggen är kvar för länge i cystein, de är benägna att lys. Likaså dejellied äggen är ömtåliga och känsliga för mekanisk lys, om deär snurras för kraftigt eller om de utsätts för luft. När äggen har dejellied, är det viktigt att snabbt gå vidare till centrifugeringssteg.
- Häll av cystein, och skölj bort gelé päls och annat skräp genom att försiktigt tvätta ägg i 1x MMR. Häll av buffert försiktigt längs sidan av bägaren. Upprepa två gånger eller tills MMR-lösning inte längre är grumlig. Medan sköljning med 1x MMR fortsätter att ta bort de dåliga äggen med hjälp av en pipett.
- Utför en slutlig varsam sköljning med 30 ml 0,1 x MMR, och försiktigt hälla bort så mycket av bufferten som möjligt. Återigen, ta bort alla uppenbarligen dåliga ägg.
- Packning och Krossning ägg genom centrifugering
OBSERVERA: Extraktet beskrivs nedan, som används för β-catenin nedbrytning är en variant av den cytostatiska faktorn extrakt (metafas Il-arrested). I motsats till låg hastighet och hög hastighet extrakt som används för cellcykelstudier, fungerar mellanvarv extrakt bäst för β-catenin nedbrytning. Jagnterphase extrakt främjar likaledes robust β-catenin nedbrytning även är mer arbetskrävande att förbereda.- Lägg leupeptin, pepstatin, aprotinin blandning (LPA, en proteasinhibitor) vid 10 | ig / ml (utspädd från en 10 mg / ml stamlösning i DMSO) och Cytochalasin D vid 20 | ig / ml (utspädd från en 10 mg / ml stamlösning i DMSO) i de återstående 20 ml 0,1 x MMR.
- Lägg 0. X MMR innehåller LPA och Cytochalasin D till de tvättade ägg, snurra försiktigt och inkubera i 5 min vid 16 ° C.
- Överför äggen i 16 ° C i förväg kyld 50 ml centrifugrör, tillåta äggen att sedimentera, och avlägsnande av kvarvarande buffert från toppen. För att undvika exponering för luft, ta ut en liten mängd buffert i överföringspipetten innan återkalla ägg för överföring. Fortsätt att överföra ytterligare ägg in i centrifugrör och avlägsnande av kvarvarande buffert från toppen av röret tills äggen fylla centrifugröret till toppen, vilket kommer att maximera utbytet avextrahera.
- Att packa de ägg, spinn centrifugrör vid 400 x g under 60 sek vid 4 ° C med användning av en fixerad vinkelrotor. Avlägsna kvarvarande buffert från toppen av centrifugrören.
- För krossning spinn, snurra rören vid 15.000 xg under 5 minuter vid 4 ° C.
- Samla Cytoplasmisk lager av Extract
OBSERVERA: Den nedan beskrivna metoden skiljer sig från den klassiska metoden för att punktera den sida av centrifugröret för att samla in den cytoplasmatiska skiktet. Detta protokoll har anpassats för att förenkla och för att användas med speciella centrifugrör, som kan återanvändas. Inga märkbara skillnader i kinetiken för β-catenin nedbrytning påträffas med endera metoden. Vid denna punkt extrakt bör förvaras kallt under hela processen, och alla steg skall utföras vid 4 ° C.- Rensa ett hål i lipidskikt med användning av P1000 pipettspetsen.
- Samla den cytoplasmatiska skikt (mellan den mörka pigmentskiktet och light lipidskikt) med användning av en ny P1000 pipettspetsen i rena pre-chilled centrifugrör (Figur 1). För högkvalitativt extrakt som kraftigt försämrar β-catenin, minimera mängden pigmenterade och lipid skikt som dras med cytoplasma lagret.
- Spin extraherade cytoplasmatisk lagret vid 15.000 xg under 10 minuter vid 4 ° C och åter samla den cytoplasma lagret. Upprepa spinn och utvinning 1X. OBSERVERA: Extraktet bör vara "halmfärgad". Om det finns en betydande förorening med de pigmenterade och lipidskikten vid denna punkt, kan en upprepa centrifuger en gång, även om överdrivna snurrar kommer att minska förmågan hos extraktet för att degradera β-catenin.
- Lägg LPA och Cytochalasin D till extraktet vid slutliga koncentrationer på 10 | ig / ml vardera. OBSERVERA: Med användning av metoden beskriven ger en ganska konsekvent total proteinkoncentration av ca 50 mg / ml (52,41 ± 5,40 mg / ml, n = 3 separata preps) i Xenopus t.ex.g extrakt.
- (Tillval) För översättningsanalyser, lägga tak mRNA (0,1 mg / ml), RNAsin (1,5 U / ml), och energiregenere mix (2.2.1) och inkubera reaktionen vid rumstemperatur i 2 timmar (för ytterligare information se Saliska et al. två och Sive et al. 33). Använd omedelbart översatt utdrag för β-catenin nedbrytnings analyser eller snap-frysa i flytande kväve för senare användning. OBS: Nyberedda extrakt har en hög kapacitet att översätta exogent tillsatt mRNA, men tyvärr är denna kapacitet förloras när extraktet är frusen. Capped mRNA kan lätt framställas med användning av kommersiellt tillgängliga kit.
- Snap-frysextrakt i flytande kväve. OBS: Extrakt lagras i små (200 mikroliter) alikvoter för engångsbruk eftersom de snabbt förlorar sin förmåga att bryta ned β-catenin om frysas om. För långtidsförvaring, kan extraktet lagras i flytande kväve. För kortvarig förvaring kan extraktet förvaras vid -80 ° C, även om kapaciteten of extrakt för att bryta ned β-catenin kan minskas dramatiskt med förlängd lagring vid -80 ° C (längre än 2 månader).
2. Förberedelse Extract för β-catenin Nedbrytning Assay
- Depletion från Xenopus Extract
OBS: En stor fördel med Xenopus extrakt är förmågan att lätt tömma delar av en väg och precist lägga tillbaka en definierad mängd av ett protein för att bestämma dess dosberoende effekter.- Använd nylagade Xenopus ägg extrakt eller snabbt tina fryst extrakt och placera på is. Utför alla manipulationer i kylan.
- Lägg extrakt till 1/10 av volymen av pellete antikropp eller affinitetspärlor (t.ex. 20 ml pelleterade pärlorna 200 ml extrakt). För att minimera utspädning av extraktet, ta ut så mycket vätska från pärlorna som möjligt innan tillsats av extraktet med hjälp av gel lastning tips med långa, avsmalnande spetsar.
- Rotera extrakt-pärlmix vid 4 ° C under 1 timme.
- Spin extrakt-pärla mix vid 12.600 xg i mikrocentrifug vid 4 ° C i 30 sekunder. Alternativt, om magnetiska pärlor används, applicera magnetfält för att samla pärlorna.
- Överföring utarmat extrakt till ett nytt mikrofugrör på is. Var noga med att inte överföra några kulor med extraktet.
- Bekräfta effektivitet utarmning genom immun både utarmat extrakt och pärlor.
- Förbered extrakt för analys β-catenin nedbrytning enligt beskrivningen i 2.2.
- Optimera Xenopus Extrahera för β-catenin Nedbrytning
NOTERA: β-catenin nedbrytning i Xenopus äggextrakt är en energiberoende process som snabbt tömmer de endogena ATP butiker. Följaktligen är ett energiregenereringssystem som krävs för att upprätthålla robusta β-catenin nedbrytning.- Förbered en 20x återvinning (ER) blandning bestående av 150 mM kreatinfosfat, 20 mM ATP, 600 mikrogram / ml kreatinfosfokinas,och 20 mM MgCl2. ER bör alikvoter och lagrades vid -80 ° C. Undvik upprepad frysning / upptining med hjälp av små frysta alikvoter.
- Snabbt tina Xenopus ägg extrakt genom att gnugga den frusna röret mellan händerna. Placera röret på is just innan alla av extraktet har smält.
- Tillsätt 10 l av energiregeneremixen (20x ER) i en portion (200 l) av Xenopus ägg extrakt. Blanda noggrant genom att snabbt ställa röret och puls vortex. Puls-spin och omedelbart placera på is.
- (Tillval) Omsättningen av β-catenin kan lätt förstärkas i Xenopus ägg extrakt genom tillsats av ubiquitin (1,25 mg / ml slutlig). Cykloheximid (0,1 mg / ml slutlig) kan också tillsättas för att minimera översättning av endogena transkript.
- Alikvotera lämpliga volymer för analys nedbrytning i förväg kylda mikrofugrör på is. För radioaktivt märkta β-catenin nedbrytningsanalyser återkalla 2-5 ml extrakt för varje tidpunkt. </ Li>
3. Radiomärkt β-catenin analys nedbrytning i Xenopus ägg extrakt
NOTERA: Alla steg skall utföras på is, om inte annat anges.
- Förberedelse Radiomärkt β-catenin
- Bered färsk in vitro-syntetiserad [35S] metionin-märkt protein med användning av kommersiellt tillgängliga kit. OBS: Generera 35 S-märkt (halveringstid 87 dagar) proteiner är enkelt och effektivt produceras med kommersiellt tillgängliga in vitro-kopplade kit transkription-översättning. Det är viktigt att det translaterade proteinet är tillräckligt märkt så att förändringar i proteinomsättningen med lätthet kan visualiseras.
- För att bekräfta lyckad radiomärkning, utföra SDS-PAGE/autoradiography med 0,5 l av den översatta proteinet. Kvantifiera intensiteten av den radiomärkta β-catenin band med ImageJ, Imagequant, eller ett alternativt kvantitativ programvara Program. ANMÄRKNING: radiomärkt β-catenin proteinband ska vara klart synliga på film inom några timmar (4-6 h).
- Snäpp-frysa radiomärkt protein i flytande kväve för lagring fram till användning. Obs: Långvarig lagring (> 2 månader) och multipel frysning / tining (större än 2) kan allvarligt påverka förmågan hos den radiomärkta β-catenin för att bryta ned kraftigt i Xenopus äggextrakt. Vanligtvis stabiliteten av radioaktivt märkta proteiner avtar markant efter 1 månads lagring vid -80 ° C; alltså, ger relativt nygjord radioaktivt märkt β-catenin bästa resultat i dessa nedbrytningsanalyser.
- Performing β-catenin Nedbrytning Assay
- Lägg 1-3 pl (beroende på styrkan av den radiomärkta band signal) av in vitro-translaterad β-catenin (och andra proteiner, små molekyler, etc. som testas) i 20 pl av Xenopus-reaktionsblandningen på is. Blanda noggrant genom quickly ställa röret och en kort puls av virvling; Detta är ett viktigt steg som Xenopus ägg extrakt är mycket trögflytande, och ofullständig blandning kommer att påverka konsistensen av resultaten. Puls spinn och placera på is.
- Starta β-catenin nedbrytningsreaktion genom att förskjuta rören till RT.
- Vid den angivna tidpunkten, ta bort 1-5 ml av provet och blanda genast med SDS-provbuffert (5x volym) för att stoppa reaktionen. För att se till reaktions nedbrytningen är helt upphört, flick röret flera gånger och skaka kraftigt.
- Utför SDS-PAGE/autoradiography. Kör 1 ml ekvivalenter (~ 50 mg protein) av extraktet för varje tidpunkt / lane. Nedbrytning av β-catenin i Xenopus ägg extrakt bör bevisas av den tidsberoende minskning av intensiteten av den radiomärkta β-catenin bandet Figur 2. Kvantifiera resultat med ImageJ, Imagequant, eller annan önskad bildbehandlingsprogram om det behövs.
- (Optional) Blöt SDS-polyakrylamidgel i fixeringslösning (10% ättiksyra och 30% metanol i destillerat vatten) före torkning för att minska bakgrundsradioaktiviteten och öka kvaliteten på bilden.
4. Β-catenin-luciferas Nedbrytning analys i Xenopus Ägg Extract
Utför alla stegen på is, om inte annat anges.
- Förberedelse β-catenin-luciferas
- Syntetisera icke-radioaktivt märkt, luciferas-taggade β-catenin med hjälp av transkription-translation kopplat system med komplett aminosyra mix.
- Bekräfta produktionen av luciferas-taggade β-catenin genom mätning av luciferasaktiviteten 0,5-1 | il av reaktionen. Bedöm bakgrund luminiscens genom att mäta luminiscens från en oöversatt reaktionsblandning. OBS: Flera kommersiella kit finns tillgängliga för att mäta luciferasaktivitet. Långlivat luminiscens, dock fungerar särskilt bra för assa nedbrytningsy.
- Utföra β-catenin-luciferas Nedbrytning analys
- Tina och förbereda Xenopus ägg extrakt som i 2.2.
- Lägg in vitro-översatta β-catenin-luciferas fusion (från 4.1) i beredd Xenopus reaktionsblandning (från 2,2) på is och blanda väl som i 3.2.1. OBS: Aktiviteten av β-catenin luciferas som läggs till extraktet är vanligtvis mellan 20 - 50.000 relativa luminiscens heter (RLU) / ml extrakt (baserat på mätvärdena från 4.1.2). Start signal bör vara cirka 100.000 RLU (2-5 ml av in vitro-översatta β-catenin-luciferas fusion).
- Shift extraktet till RT för att starta reaktionen nedbrytning.
- Avlägsna en alikvot av reaktionen vid den angivna tiden och snäpp skyddsmedel i flytande kväve. OBSERVERA: Tredubbla prover typiskt avlägsnas för analys för varje tidpunkt. Fryst extrakt kan förvaras vid -80 ° C until är de redo att analyseras.
- Tina prover is, överföra prover till standard vita plattor med 96 brunnar på is, och processen för luciferasaktivitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En schematisk bild av β-catenin nedbrytning i Xenopus äggextrakt visas i figur 2A. 35 S-märkt β-catenin inkuberades i Xenopus äggextrakt alikvoter (1 ml extrakt ekvivalent) avlägsnas vid lämpliga tidpunkter, och prover utsattes för SDS-PAGE följt av autoradiografi. β-catenin nedbrytning av komponenterna i den Wnt banan förmedlas av ubiquitin-proteasome systemet 2, och nedbrytning av [35S]-märkt β-catenin i Xenopus extrakt inhiberas genom tillsats av proteasom-inhibitor MG132 figur 2B. Nedbrytning av β-catenin av komponenterna i den Wnt banan är beroende av fosforylering av GSK3 34. GSK3-beroende nedbrytning lätt kan påvisas på flera olika sätt med användning av Xenopus äggextrakt: 1) Den β-catenin (SA) mutant (GSK3 fosforyleringsställen muterades till alaniner) stabiliseras i Xenopus äggextrakt i förhållande till vildtyp-β-catenin protein figur 2B. 2) småmolekylära hämmare av GSK3 (LiCl) hämmar på liknande nedbrytning av β-catenin (figur 2C). 3) Slutligen, utarmning av GSK3 från Xenopus ägg extrakt hämmar nedbrytningen av β-catenin; nedbrytning kan räddas genom tillsats av exogen GSK3 Siffror 2D-E.
Radioaktivt märkt analys Den β-catenin nedbrytning ger en särskilt informativ visuell bedömning av det sätt på nedbrytning (dvs. ubiquitinmedierad nedbrytning kontra apoptotiska klyvning). Autoradiografi är emellertid arbetskrävande, och, för det mesta, begränsas för high-throughput-analys av reaktionsvägen (t.ex. screening för småmolekylära modulatorer av Wnt banan). Assay Den β-catenin-luciferas nedbrytning är lättare och snabbare kvantifierbar som mängden luminescens som emitteras står i direkt proportion till den amount av β-catenin-luciferas-proteinet. Denna funktion gör luciferasanalysen enkel och lätt anpassningsbar för high-throughput analyser.
Det är viktigt att fastställa att den luciferas fusion har liknande egenskaper som den för nonfusion proteinet. Detta kan bestämmas empiriskt genom att smälta luciferasprotein till N-terminalen, C-terminalen eller internt. Fusion av luciferas till N-eller C-terminalen av β-catenin inte påverkar dess förmåga att aktivera Wnt mål gener incultured däggdjursceller eller dess omsättningshastighet i Xenopus ägg extrakt 2, 19, 20.
Ett representativt β-catenin-luciferasanalys nedbrytning i Xenopus äggextrakt visas i figur 3A, i vilken nedbrytning av β-catenin-luciferas bedömdes genom SDS-PAGE/autoradiography av det radioaktivt märkta proteinet och luciferasaktiviteten av fusionen. Hastigheten för degradation av β-catenin-luciferas är liknande den omärkta β-catenin protein. Regleringen av nedbrytning för β-catenin-luciferas fusion är i huvudsak identiskt med nonfusion protein som tillägg av LiCl eller utarmning av GSK3 medförde hämning av β-catenin-luciferas omsättning. Såsom visas i figurerna 3B-C, förändringar i den radioaktiva signalen i den β-catenin-luciferasprotein paralleller förändringarna i luciferas enzymatisk aktivitet över tiden. En fråga som uppstår från att använda β-catenin-luciferas (särskilt fusionsprotein som genereras från transkriptionen-översättningssystemet in vitro) är bakgrunden luciferas signal som orsakas av användning av interna translationstartplatser eller förtida translationstermine Figur 3D. Detta problem kan ibland övervinnas genom att optimera DNA-koncentrationen som användes i IVT-reaktion. Vi har dock inte observera en minskning av bakgrunds luciferas aktivitet när vi varieradeplasmid-DNA-koncentrationen för vår särskilda β-catenin-luciferas konstruktion. Det är troligt att vi kommer att behöva reengineer fusionsproteinet via mutagenes i syfte att ytterligare minimera interna translationsstartställen och / eller för tidig translationsavslutning av β-catenin-luciferas-fusionsprotein. Eftersom luciferas-proteinet är relativt stabil över tiden reaktionsförloppet nedbrytning i Xenopus äggextrakt figur 3A, men detta bakgrundssignalen kan helt enkelt dras av, om förhållandet mellan den stympade luciferasprotein med fullständig längd β-catenin fusion är känd .
En styrka hos luciferasanalysen är förmågan att skala till en multi-brunnsformat som möjliggör utförande av high-throughput screening för modulatorer av β-catenin nedbrytning. I fig. 4 visas en representativ checkerboard analys visas med användning av en inhibitor av β-catenin nedbrytning, MG132, som hämmar proteasomen. Resultatet av checkerboard experiment indikerar att analysen är enhetlig och reproducerbar i ett 96-brunnsformat och visar dess lämplighet för high-throughput screening.
Figur 1. En schematisk bild av beredningen av koncentrerat Xenopus ägg extrakt. Ägg samlas in från HCG-injicerade Xenopus laevis honor, pressats med en låg hastighet (400 xg) spinn, och krossade och separerade med en medelhastighet (15.000 xg ) spinn. Var noga med att injicera subkutant i rygg lymfan sac, ta bort de dåliga äggen noggrant och försiktigt separera högkvalitativa cytoplasma utdrag ur lägre kvalitet mörkare extrakt som noterats i texten.
igure 2 "fo: innehåll-width =" 5in "fo: src =" / files/ftp_upload/51425/51425fig2highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51425/51425fig2.jpg "/>
Figur 2. Β-catenin försämrar kraftigt när de inkuberas i Xenopus äggextrakt. A) en schematisk vy av en analys nedbrytning. B) [35S]-märkt β-catenin ställas genom en IVT reaktion försämras kraftigt när de inkuberas i Xenopus äggextrakt. Tillsats av MG132 (200 M) till Xenopus ägg extrakt hämmar β-catenin nedbrytning. Mutation till alaniner av GSK3 phosphosites inom β-catenin (β-catenin SA) eller tillsats av LiCl (25 mM) C) inhiberar β-catenin nedbrytning. D) Den GSK3-bindningsstället av Axin (aminosyror 506-560) effektivt utarmar GSK3 från Xenopus ägg extrakt. E) GSK3-utarmat Xenopus ägg extrakt hämmar β-catenin nedbrytning och kan räddas genom tillsats of rekombinant GSK3 (0,1 mg / ml). Tillsats av LiCl (25 mM) blockerar kapacitet av rekombinant GSK3 att rädda β-catenin nedbrytning i GSK3-utarmade extrakt. Klicka här för att visa en större bild.
Figur 3. Luciferas-taggade β-catenin nedbrytes när de inkuberas i Xenopus äggextrakt. A) Radiomärkt β-catenin-luciferas degraderar med en hastighet liknande den för omärkt β-catenin protein. Såsom med vildtyp-proteinet, tillsats av LiCl (25 mM) hämmar β-catenin-luciferas nedbrytning. Enbart luciferas inte märkbart vända sig i Xenopus ägg extrakt. Förändringar i luciferasaktivitet av β-catenin-luciferase fusion parallella förändringar i sina proteinnivåer. B) Tillägg av LiCl (25 mM) eller utarmning av GSK3 C) hämmar β-catenin-luciferas omsättning genom mätning av luciferasaktivitet. D) Immunoblotting för in vitro-översatta β-catenin- luciferas (med hjälp av en anti-luciferas antikropp) visade signifikanta mängder fritt luciferasprotein i vissa preps som sannolikt bidrar till den högre bakgrunden jämfört med analys av radioaktivt märkta nedbrytning. Klicka här för att visa en större bild.
Figur 4. Reglerad nedbrytning av β-catenin-luciferas i Xenopus extrakt kan anpassas tilla high-throughput format. En representativ schackbrädesanalys för β-catenin-luciferas med användning av MG132 (450 pM) som en inhibitor av β-catenin nedbrytning. Skuggade kolumner indikerar MG132-behandlade brunnar, och lättare kolumner representerar fordon (DMSO)-behandlade brunnar. Kvantifiering och resultat Z-faktor beräkning i en värdering på 0,3 indikerar en acceptabel analys för potentiell användning i high-throughput screening.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Xenopus ägg Extrakt är en robust biokemiskt system för att utreda β-catenin omsättning. Koncentrationen av β-catenin i Xenopus äggextrakt är ~ 25 nM 2. Under optimala betingelser är äggextrakt förmåga att bryta ned β-catenin med en hastighet av 50 till 100 nm / h och är halv-maximal vid 200 nM 24. Det finns flera viktiga steg för lyckad beredning av β-catenin nedbrytning med hjälp av Xenopus ägg extrakt. Dessa inkluderar en) alstra högkvalitativt Xenopus äggextrakt och det sätt på vilket äggextrakt framställes, 2) alstring av kvalitetsradiomärkt β-catenin och β-catenin-luciferas-proteinet, 3) att optimera reaktionsbetingelserna för att stödja β-catenin nedbrytning, och fyra ) korrekt behandling av reaktions tidpunkter.
En högkvalitativ beredning av Xenopus ägg extrakt där β-catenin är robust försämras beror på både kvaliteten på the ägg och hur äggen hanteras innan den kross steg samt hur extraktet därefter centrifugeras för att erhålla den slutliga extraktet. Som nämndes i protokollet, är det viktigt att se till att endast hög kvalitet ägg (representerade av skarp kontrast mellan det mörka djuret halvklotet och lätt vegetal halvklotet) används, att ägg dålig kvalitet (trådiga, fläckiga eller vita puffs) tas bort under processen, att ägg hålls på en sval temperatur (16 ° C) under hela förfarandet, och att förfarandet genomförs så snabbt som möjligt. Det är viktigt att inte offra kvalitet för kvantitet extrakt. Dessutom, såsom tidigare nämnts, ägg från en groda som lägger dåliga kvalitet ägg (> 10%) helt bör kasseras.
Extraktet som beskrivs ovan är en modifiering av meios II-arresterad CSF-extrakt 11. Beredningen av Xenopus ägg extrakt för β-catenin nedbrytning (mellanvarv extrakt) differs från klassiska extrakt förberedda för att studera cellcykeln 30-32, som är låg hastighet eller hög hastighet extrakt 35. Anpassning Xenopus ägg extrakt för optimal nedbrytning av andra proteiner kan behöva ändra centrifugeringshastigheten och antalet snurrar. Låg hastighet extrakt innehåller intakta organeller och andra stora cellulära komponenter. Sålunda kommer högre hastighets snurrar ändra sammansättningen av extraktet och eventuellt avlägsna inhiberande och / eller väsentliga komponenter som påverkar nedbrytningen av proteinet av intresse. Beredningen av mellanvarvtals extrakt häri beskrivna är optimerad för nedbrytning av β-catenin av komponenterna i den Wnt banan. Spinning extraktet större än 4X kan avsevärt minska kapaciteten av extraktet för att degradera β-catenin (även om det har minimal effekt på nedbrytningen av en annan Wnt komponent Axin). β-catenin är mottagliga för kaspas-medierad proteolys i låg hastighet spinn extrakt och inte noticeably brytas ned i hög hastighet spinn extrakt. Sålunda är det sannolikt att olika hastighets extrakt kommer att vara optimal för nedbrytning av komponenter av andra signalvägar.
Alstringen av 35 S-β-catenin och β-catenin-luciferas kan utföras med användning av ett antal kommersiellt tillgängliga kit. Proteinproduktion med hjälp av transkription-översättning kopplade system är i hög grad beroende av kvaliteten av plasmiden: mycket rena midi-beredningar av plasmider fungerar bättre och är mer tillförlitlig jämfört med DNA-miniberedningar. För radiomärkning av β-catenin, nyligen erhållna [35 S] metionin eller Translabel ([35 S] metionin plus [35 S] cystein) är föredragen. Observera att metionin och cystein har båda en tendens att oxidera med långvarig lagring och därigenom minska deras införlivande i β-catenin i in vitro-transkription-translation kopplad reaktion. Eftersom långvarig lagring och upprepad frysning-tiningcyklerna kan hämma nedbrytning, är små mängder av den radiomärkta β-catenin ställas vid en tidpunkt och användas strax efter.
Mängden av protein translaterat och antalet metioniner i proteinet fastställa styrkan hos den radioaktivt märkta signalen. För β-catenin, borde det inte finnas några problem med att få starka radioaktiva signaler för nedbrytningsanalyser. För proteiner med få metioniner och / eller att inte översätta bra, en [35 S] metionin och kan [35 S] cystein mix användas i stället för [35S] metionin och / eller lagt till en epitopmärkning (Myc) som innehåller flera metioniner. Trots framgången med olika uttrycksplasmider innehållande lämpliga fagpromotorer (T7, T3 och SP6) kan erhållas för in vitro-reaktioner transkription-översättnings pCS2-baserade plasmiden ger i allmänhet bäst resultat. Dessutom kan signalen för den translaterade proteinet ibland ökas dramatiskt genom att ta bort den endogena 5'UTR. Slutligen, för storskaliga experiment (t.ex. höghastighetsscreening), en stor mängd av rekombinant β-catenin-luciferas kan krävas. β-catenin-luciferas från Sf9 / baculovirussystemet degraderar med liknande kinetik som vildtyp β-catenin i Xenopus extrakt och embryon 2. Alternativt kan ett högt utbyte in vitro-expressionssystem (t ex vetegroddar-baserad) har framgångsrikt använts för high-throughput screening 19, 20.
För att tillförlitligt mäta nedbrytningen av β-catenin i extraktet system, är det viktigt att den första signalen från antingen den radiomärkta β-catenin eller luciferas β-catenin fusion är tillräckligt robust. Sålunda en viss mängd av optimering av försöksledaren på storleken av assay nedbrytningen, det antal tidpunkter behövs och effektiviteten i den in vitro-translationsreaktionen will krävas. Vid montering av reaktions nedbrytning, finns det flera åtgärder som man kan vidta för att öka chansen att få robust nedbrytning. För det första bör alla reagenser tinas snabbt och placeras på is före deras fullständiga tina. Eftersom nedbrytningen av β-catenin är mycket energiberoende, är det viktigt att ER är relativt färska. För det andra är Xenopus äggextrakt viskös, och det är kritiskt att reaktionen blandas grundligt efter tillsats av radiomärkt β-catenin/β-catenin-luciferase fusion, ER, protein, småmolekylära modulatorer etc. För det tredje, pre-inkubering av reaktionen blanda i 20-30 minuter på is ger mer reproducerbara resultat när man testar effekten av småmolekylära modulatorer.
Förmågan att tömma proteiner från Xenopus ägg extrakt utgör ett kraftfullt verktyg för att bedöma proteiners funktion och deras koncentrationsberoende effekter. Som ett exempel, visar vi att förbruka GSK3 från XeNOPUS ägg extrakt blockerar nedbrytning av β-catenin, som anger viktiga roll GSK3 i β-catenin omsättning. Olika utarmningsförhållanden kommer att behöva bestämmas empiriskt för olika proteiner. Till exempel kommer rikliga proteiner kräva en ökning av mängden antikroppar eller affinitetsliganden pärlor som används för att uppnå full utarmning. En bra utgångspunkt är att använda packade pärlor på 1/10 av volymen av det extrakt för att minimera extrakt utspädning. Förutom styrkan i bindningen av antikroppen / affinitetsligand till målproteinet, typen av pärlor (t.ex., sepharos, agaros, eller magnetiska) används kan påverka effektiviteten av protein utarmning från Xenopus äggextrakt 36. Slutligen skulle det vara idealiskt för att analysera omfattningen av utarmning (typiskt genom immunoblotting). När β-catenin reaktionen är fullbordad, kan det sätt på vilket proverna bearbetas kraftigt påverka resultaten av experimentet. Koncentrationen avXenopus äggextrakt preps framställda på det beskrivna sättet är 52,41 mg / ml ± 5,40 mg / ml, och det är viktigt att inte överbelasta kapaciteten i SDS-PAGE-gel; detta är inte ett problem med luciferas-β-catenin-analysen. Således, för varje tidpunkt, inte mer än 1 ml motsvarande extrakt bör laddas i varje körfält av en SDS-PAGE-gel. För att ytterligare förbättra kvaliteten på resultaten, kommer gelen fixeringssteget (tillval) minskar bakgrundsradioaktiviteten och öka signal-till-brus-förhållande. För luciferasanalysen, en minskning från en ursprunglig signal av 100.000 RLU i Xenopus äggextrakt troget avspeglar förändringen i proteinnivåerna av β-catenin-luciferas-fusionsprotein.
Xenopus äggextrakt systemet utgör ett attraktivt system för att studera regleringen av β-catenin nedbrytning. Extraktet Systemet möjliggör exakt kontroll av koncentrationen av enskilda proteiner via utarmning och reconstitu tion. Förmågan att övervaka deras effekter på kinetiken av β-catenin omsättning över tid ger en bättre förståelse av biokemiska mekanismen för detta avgörande steg i Wnt signaltransduktion. Sådana manipulationer har gett djup insikt i de komplexa molekylära interaktioner mellan komponenterna i den Wnt banan och var kritiska för utvecklingen av den första matematisk modell av den Wnt banan 24. Ett villkor är att koncentrationerna av Wnt banan komponenter i Xenopus ägg extrakt och däggdjurs cellysater har visat sig skilja sig åt, vilket speglar skillnader i hur den Wnt banan regleras under fosterutvecklingen kontra vuxenläget 37. Förmågan att utföra både radioaktiva och enzymatiska, luciferas-baserade analyser med hjälp av Xenopus ägg extrakt ger extra kraftfull kompletterande kvalitativa och kvalitativa verktyg för att studera biokemiska regleringen av β-catenin nedbrytning.
t "> Förutom att övervaka omsättningen av β-catenin, kan försämring av den negativa Wnt regulator, Axin, övervakas i Xenopus ägg extrakt antingen som en radiomärkt protein eller fusion till luciferas. Med hjälp av en variant av luciferas, Renilla, smält till Axin, var tidigare anpassad för analys av luciferas nedbrytning i en hög genomströmning format för att samtidigt screena för modulatorer av två Wnt banan proteiner, β-catenin och Axin 19, 20. Denna biokemiska skärm identifierade FDA-godkända läkemedel, pyrvinium som ökat och minskad nedbrytningshastigheten för β-catenin och Axin, respektive, i Xenopus äggextrakt 19. Pyrvinium därefter valideras i odlade humanceller och i olika modellorganismer (t.ex. Xenopus och C. elegans) som en liten molekyl hämmare av den kanoniska Wnt väg. Sammanfattningsvis är Xenopus äggextrakt systemet en mångsidig biokemiska systemet that kan utnyttjas på en mängd olika sätt att studera mekanismen för Wnt-signalering samt för identifiering av småmolekylära modulatorer av den Wnt banan. Den biokemiska metod som beskrivs häri kan tillämpas på andra signalvägar i vilka proteinnedbrytning kan spela en kritisk roll.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Vi tackar Laurie Lee för kritisk läsning av manuskriptet. TWC stöds av en American Heart Association Predoctoral Fellowship (12PRE6590007). MRB stöds av en National Cancer Institute utbildningsbidrag (T32 CA119925). SSH stöds av National Institutes of Health (R01DK078640). EL stöds av National Institutes of Health (R01GM081635 och R01GM103926).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) | ProSpec | hor-272-A | Reconstituted with distilled water before use. |
| Human chorionic gonadotropin | Sigma | CG10-10VL | |
| Potassium chloride | Fisher | BP366-1 | |
| Sodium chloride | Research Products International | S23020-5000.0 | |
| Magnesium chloride | Fisher | BP214-500 | |
| Calcium chloride | Acros Organics | AC42352-5000 | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Cysteine | Acros Organics | AC17360-1000 | |
| Leupeptin | Sigma | L2884-10MG | |
| Aprotinin | Sigma | A1153-10MG | |
| Pepstatin | Sigma | P4265-5MG | |
| Cytochalasin B | Sigma | C8273-10MG | |
| 3 ml syringe: Luer Lock tip | Becton Dickinson | 309657 | |
| 27 G needle | Becton Dickinson | 305109 | |
| 96 well solid white polystyrene microplate, round bottomed | Corning | 3605 | |
| Steady-Glo luciferase assay system | Promega | E2520 | Store long-term at -80 °C, can store for up to 1 month at -20 °C |
| TNT Sp6 coupled reticulocyte lysate system | Promega | L4600 | |
| TNT Sp6 high-yield wheat germ protein expression system | Promega | L3260 | Generally higher yield than reticulocyte lysate |
| EasyTag Express protein labeling mix [S35] | Perkin Elmer | NEG772007MC | |
| Creatine phosphate | Sigma | 27920-5G | |
| ATP | Sigma | A2383-5G | |
| Creatine phosphokinase | Sigma | C3755-35KU | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418-50ML | |
| Dual-Glo luciferase assay system | Promega | E2920 | Same storage conditions as Steady-Glo |
| 50 ml Centrifuge tubes | Fisher Scientific | 0556214D | |
| Sorvall SS-34 fixed angle rotor | Thermo Scientific | 28020 | |
| 115 V 50/60 Hz Minicentrifuge | Fisher Scientific | 05-090-128 | |
| mMessage mMachine Sp6 kit | Ambion | AM1340 | |
| Anti-firefly luciferase antibody | Abcam | ab16466 | |
| Anti-GSK3 antibody | BD Transduction Laboratories | 610201 | |
| FLUOStar Optima | BMG Labtech | ||
| Sorvall RC-6 Plus centrifuge | Thermo Scientific | ||
| 16 °C Incubator | Percival Scientific |
References
- Glotzer, M., Murray, A. W., Kirschner, M. W. Cyclin is degraded by the ubiquitin pathway. Nature. 349, 132-138 (1991).
- Salic, A., Lee, E., Mayer, L., Kirschner, M. W. Control of beta-catenin stability: reconstitution of the cytoplasmic steps of the wnt pathway in Xenopus egg extracts. Molecular Cell. 5, 523-532 (2000).
- Murray, A. W. Cell cycle extracts. Methods in cell biology. 36, 581-605 (1991).
- Dabauvalle, M. C., Scheer, U. Assembly of nuclear pore complexes in Xenopus egg extract. Biology of the cell / under the auspices of the European Cell Biology Organization. 72, 25-29 (1991).
- Tutter, A. V., Walter, J. C. Chromosomal DNA replication in a soluble cell-free system derived from Xenopus eggs. Methods Mol Biol. 322, 121-137 (2006).
- Theriot, J. A., Rosenblatt, J., Portnoy, D. A., Goldschmidt-Clermont, P. J., Mitchison, T. J. Involvement of profilin in the actin-based motility of L. monocytogenes in cells and in cell-free extracts. Cell. 76, 505-517 (1994).
- Maresca, T. J., Heald, R. Methods for studying spindle assembly and chromosome condensation in Xenopus egg extracts. Methods Mol Biol. 322, 459-474 (2006).
- Shennan, K. I. Xenopus egg extracts: a model system to study proprotein convertases. Methods Mol Biol. 322, 199-212 (2006).
- Kornbluth, S., Yang, J., Powers, M. Analysis of the cell cycle using Xenopus egg extracts. Current protocols in cell biology / editorial board, Juan S. Bonifacino ... [et al.]. 11, (2006).
- Chan, R. C., Forbes, D. I. In vitro study of nuclear assembly and nuclear import using Xenopus egg extracts. Methods Mol Biol. 322, 289-300 (2006).
- Masui, Y., Markert, C. L. Cytoplasmic control of nuclear behavior during meiotic maturation of frog oocytes. The Journal of experimental zoology. 177, 129-145 (1971).
- Forbes, D. J., Kirschner, M. W., Newport, J. W. Spontaneous formation of nucleus-like structures around bacteriophage DNA microinjected into Xenopus eggs. Cell. 34, 13-23 (1983).
- Lohka, M. J., Masui, Y. Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components. Science. 220, 719-721 (1983).
- Newport, J. W., Kirschner, M. W. Regulation of the cell cycle during early Xenopus development. Cell. 37, 731-742 (1984).
- Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312, 237-242 (1984).
- Blow, J. J., Laskey, R. A. Initiation of DNA replication in nuclei and purified DNA by a cell-free extract of Xenopus eggs. Cell. 47, 577-587 (1986).
- Verma, R., et al. Ubistatins inhibit proteasome-dependent degradation by binding the ubiquitin chain. Science. 306, 117-120 (2004).
- Yu, H., King, R. W., Peters, J. M., Kirschner, M. W. Identification of a novel ubiquitin-conjugating enzyme involved in mitotic cyclin degradation. Curr Biol. 6, 455-466 (1996).
- Thorne, C. A., et al. Small-molecule inhibition of Wnt signaling through activation of casein kinase 1alpha. Nature Chemical Biology. 6, 829-836 (2010).
- Thorne, C. A., et al. A biochemical screen for identification of small-molecule regulators of the Wnt pathway using Xenopus egg extracts. Journal of Biomolecular Screening. 16, 995-1006 (2011).
- Hinkson, I. V., Elias, J. E. The dynamic state of protein turnover: It's about time. Trends in Cell Biology. 21, 293-303 (2011).
- Kinzler, K. W., Vogelstein, B. Lessons from Hereditary Colorectal Cancer. Cell. 87, 159-170 (1996).
- Lee, E., Salic, A., Kirschner, M. W. Physiological regulation of [beta]-catenin stability by Tcf3 and CK1epsilon. J Cell Biol. 154, 983-993 (2001).
- Lee, E., Salic, A., Krüger, R., Heinrich, R., Kirschner, M. W. The roles of APC and Axin derived from experimental and theoretical analysis of the Wnt pathway. PLoS Biology. 1, (2003).
- Seeling, J. M., et al. Regulation of beta-catenin signaling by the B56 subunit of protein phosphatase 2A. Science. 283, 2089-2091 (1999).
- Guger, K. A., Gumbiner, B. M. beta-Catenin has Wnt-like activity and mimics the Nieuwkoop signaling center in Xenopus dorsal-ventral patterning. Dev Biol. 172, 115-125 (1995).
- Cselenyi, C. S., et al. LRP6 transduces a canonical Wnt signal independently of Axin degradation by inhibiting GSK3's phosphorylation of β-catenin. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 8032-8037 (2008).
- Jernigan, K. K., et al. Gbetagamma activates GSK3 to promote LRP6-mediated beta-catenin transcriptional activity. Science Signaling. 3, (2010).
- Major, M. B., et al. Wilms tumor suppressor WTX negatively regulates WNT/beta-catenin signaling. Science. 316, 1043-1046 (2007).
- Cross, M. K., Powers, M. Obtaining eggs from Xenopus laevis females. J Vis Exp. , (2008).
- Cross, M. K., Powers, M. Preparation and fractionation of Xenopus laevis egg extracts. J Vis Exp. , (2008).
- Willis, J., DeStephanis, D., Patel, Y., Gowda, V., Yan, S. Study of the DNA damage checkpoint using Xenopus egg extracts. J Vis Exp. , (2012).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus Laevis : A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
- Rubinfeld, B., et al. Binding of GSK3β to the APC-β-Catenin Complex and Regulation of Complex Assembly. Science. 272, 1023-1026 (1996).
- Salic, A., King, R. W. Identifying small molecule inhibitors of the ubiquitin-proteasome pathway in Xenopus egg extracts. Methods in Enzymology. 399, 567-585 (2005).
- Trinkle-Mulcahy, L., et al. Identifying specific protein interaction partners using quantitative mass spectrometry and bead proteomes. J Cell Biol. 183, 223-239 (2008).
- Tan, C. W., et al. Wnt signalling pathway parameters for mammalian cells. PLoS One. 7, (2012).
