Summary
Bir yöntem olup Xenopus yumurta özü ve protein degradasyon küçük molekül modülatörleri için yüksek miktarda madde taraması için uyarlanması radyoaktif olarak etiketlenmiş ve lusiferaz füzyon proteinleri kullanılarak protein degradasyonunu analiz edilmesi için anlatılmıştır.
Abstract
Xenopus laevis yumurta ekstresi. Xenopus yumurta özü, hücre döngüsü ve sinyal transdüksiyon yollarının 1-3 dahil olmak üzere birçok hücresel bağlamlarda protein dönüşümünü incelemek için kullanılmıştır çeşitli hücresel süreçlerin biyokimyasını incelemek için iyi karakterize edilmiş sağlam bir sistemdir. Burada, bir yöntem olup, Wnt yolu kritik bir bileşen, β-katenin degradasyonunu teşvik etmek için optimize edilmiştir Xenopus yumurta özü izole edilmesi için anlatılmıştır. Iki farklı yöntem Xenopus yumurta özü β-katenin protein degradasyonunu değerlendirmek için tarif edilmiştir. Diğer hali hazırda daha yüksek verimlilik deneyleri (ateş böceği lusiferaz etiketli füzyon proteinleri) için ölçekli bir yöntem ise, ([35 S]-radyo-etiketli proteinleri) görsel olarak bilgilendirici. Açıklanan teknikler β-katenin protein ciro değerlendirmek ve ciro katkıda molekül bileşenleri tanımlamak için kullanılabilir, ancak bunlarla sınırlı değildir. Buna ek olarak, öğrendiğilusiferaz etiketli proteinlerin sayısal ve kolay okuma ile birlikte homojen bir Xenopus yumurta ekstresi geniş hacimli arındırmak için ity bu sistem kolaylıkla β-katenin bozulmasının modülatörler için yüksek miktarda madde taraması için adapte edilmesine olanak sağlamaktadır.
Introduction
Xenopus laevis yumurta özü sitoskeletal dinamikleri, nükleer montaj ve ithalat, apoptoz, ubikuitin metabolizması, hücre döngüsü ilerlemesi, sinyal iletimi, ve protein cirosu 1-17 dahil olmak üzere birçok hücre biyolojik süreçleri incelemek için yaygın olarak kullanılır olmuştur. Yumurta özü aslında bu süreçleri yürütmek ve soruşturma sağlamak için gerekli tüm temel sitoplazmik bileşenleri içeren sulandırılmamış sitoplazmasını temsil ettiği Ksenopus yumurta özü sistem hücresel süreçlerin bir lejyon biyokimyasal analiz için uygun değildir. Yumurta ekstresi büyük miktarlarda malzeme (örneğin, protein saflaştırma veya yüksek verimli tarama) 18-20 büyük miktarlarda ihtiyaç biyokimyasal manipülasyonlar için aynı anda hazırlanabilirler. Diğer bir avantajı Xenopus yumurta özü spesifik protein konsantrasyonu tam olarak yeniden birleştirici protein ve / veya imüno-endog eklenmesi ile ayarlanabilir olmasıdırilgilenilen proteinin ekspresyonu kontrol etmek zordur, plazmid DNA transfeksiyonu aksine enous proteinleri. Buna ek olarak, mevcut rekombinant proteinlerin eksikliği eksogen olarak ilave mRNA çevirmek için taze hazırlanmış Xenopus yumurta ekstrakte yüksek kapasiteli yararlanarak, ilgi konusu proteini kodlayan transkriptlerin eklenmesi ile aşılabilir.
Protein degradasyon düzenleme pek çok hücresel yollarının kontrolü için kritiktir ve 21,. Xenopus yumurta özüt sistem, transkripsiyon ve çevirinin karıştırıcı etki olmadan protein devir izlemek için çok sayıda yollar sağlar gibi protein degradasyonunu incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır işler. Wnt sinyal yolu hastalığı geliştirme ve kritik roller oynayan bir yüksek ölçüde korunmuş bir sinyal yoludur. Β-katenin, Wnt yolu en önemli effektör devir, son derece artan bir kalıcı-hal yarım litre, veβ-katenin evel Wnt hedef genlerin aktivasyonu için kritiktir. Β-katenin bozulması önemi β-katenin bozulmasını engelleyen Wnt yolu mutasyonlar ~ kolorektal kanser 22 tüm sporadik vakaların% 90 olarak bulundu gerçeği ile vurgulanır. Wnt yolağının bileşenleri ile β-katenin bozulması sadık olarak ciro mekanizması çalışma yanı sıra bozulma 2, 19, 20, 23-29 e ait yeni küçük moleküllü modülatörlerini tanımlamak için Xenopus yumurta özü değinmeyecek edilebilir.
Hücre döngüsü incelemek için Xenopus yumurta ekstresinin hazırlanması için yöntemler önceki yayınlarda JoVE 30-32 'de tarif edilmiştir. Mevcut protokol bu yöntemlerin bir modifikasyonunu açıklar ve bozulması için optimize edilmiştir [35 S]-radyo işaretli β-katenin ve lusiferaz etiketli β-katenin inXenopus yumurta özü. Radyo-etiketli bozulma deney otoradyografi ile protein seviyelerinin doğrudan görselleştirme için izin verir. [35 S] methionine daha sonra doğrudan bir bozulma reaksiyona ilave edilebilir bir in vitro çeviri reaksiyonu kullanılarak, ilgi konusu proteine dahil edilebilir. Buna ek olarak, radyoaktif olarak işaretlenmiş protein devir tahlili protein istikrarı etkileyebilir ilgilenilen protein veya bir epitop etiketi, karşı bir antikor gerektirmez. Protein düzeylerindeki küçük değişikliklerin bile, radyo-etiketli protein bandının yoğunluğundaki değişiklikler yansıtılan kolaylıkla otoradyografi ile görselleştirilmektedir için, [35 S]-radyo işaretli bozunma protein tahlili devir 2 görselleştirilmesi için çok yararlı bir yöntemi temsil eder.
Amacıyla, ateşböceği lusiferaz için β-katenin Fusion (bundan sonra sadece "lusiferaz" olarak anılacaktır), protein düzeylerinin kesin ve kolay nicel de elde edilebilirβ-katenin devir 19, 20 kinetik özelliklerini belirlemek için. Lusiferaz deneyi önemli bir avantajı kolay bir şekilde ölçeklenir güçlü bir kantitatif sistem sağlamasıdır. Aşağıdaki protokol β-katenin bozulmasını ve yeni β-katenin modülatörlerinin, yüksek miktarda madde taraması için sağlam, etkin ve etkili bir yöntem test etmek için basit bir yöntem sağlamaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Xenopus Yumurta Özü 1. Hazırlanması
NOT: Her kurbağa kullanılabilir yumurta ekstresi, yaklaşık 1 ml verir. 10 kurbağalar ekstreler, tipik olarak bir anda hazırlanır, ve aşağıda tarif tampon hacmi, 10 kurbağa Xenopus yumurta özü hazırlık yapmak için olan edilir. Tampon madde hacmi, yumurta özü daha büyük veya daha küçük preparasyonlar için uygun olarak ayarlanabilir. Bu şekilde üretilen Preps sürekli protein konsantrasyonlarının ≥ 50 mg / ml elde edildi. Iki kişi tarafından gerçekleştirildiği zaman yumurta toplama ve özü içine işleme süreci en verimli. (Temel kurbağa yetiştirme teknikleri için, Sive et al. 33).
- Yumurta Toplama
- Prime kurbağalar, bir taze yapılmış 250 U / ml stok Hamile Mare Serum Gonadotropin 100 U (PMSG) ile her bir dişi kurbağa enjekte. Ve konik, deri altından enjekte etmek için bir 27 G iğne ile, 3 ml tüberkülin şırınga kullanınYaklaşık 1 cm uzakta kurbağa bacaklarının uzunluğu boyunca çentikli renklenmeler gelen orta hattan bulunduğu dorsal lenf kesesi içine iğne kadar.
- Su deposu astarlanmış kurbağa 5-10 gün boyunca 18 ° C 'de (ek 20 mM NaCl, Sive et al. 33). Su tankı sistemleri ayakta için, hayvan yoğunluk dişi kurbağa başına su yaklaşık 4 L,. NOT: yürürlüğe girmesi emişli için gereken minimum süre 5 gün ve prime etkisi 10 gün sonra eskitmek.
- 20x MMR stoktan 0.5x Marc'ın Modifiye Ringers (MMR) çözeltisi hazırlayın. (2-hidroksietil)-1-piperazinetansülfonik asit (HEPES), pH 7.4 - 20x MMR 2 M sodyum klorid, 40 mM potasyum klorid, 40 mM kalsiyum klorid, 20 mM magnezyum klorür ve 100 mM 4 oluşur.
- Tüm enjekte kurbağalar (4 L kova başına bir kurbağa) kepçeler ayarlayın. NOT: Birden fazla kurbağa, yumurta toplanması için aynı kova yerleştirilebilir rağmen eğer kurbağa biriağırlıklı olarak kalitesiz yumurta bırakır, çaba önemli bir miktarda ekstresi yapmak için uygun olanlardan kalitesiz yumurtaları ayırmak için gerekli olacaktır. Böylece, yumurta için kullanılan tampon miktarını en aza indirmek için aynı tankta kurbağa sayısını toplamak maksimize risk almaya değmez.
- 1.1.1 de açıklandığı gibi, 27 G iğne kullanılarak her bir kurbağa dorsal lenf kesesi içine 750 U İnsan koryonik gonadotropin (HCG) enjekte edilir.
- 0.5x MMR içeren tek 4 L kova içine HCG enjekte kurbağaların her Sıra 16 ° C'ye soğutuldu
- O / N (15-16 saat) yumurta toplamak için bir 16 ° C inkübatör kurbağa ile kapları yerleştirin. Not: uygun sıcaklık bakımı yumurta ekstrenin hazırlanması için yumurta toplama gelen, bütün prosedür için çok önemlidir.
- Yumurta Dejellying
NOT: Yumurta öncesi özü yapmak için kaldırılması gereken bir jöle tabakası ile kaplıdır. Yumurta kendiliğinden lizis olasılığı zaman betwee artarn yumurtlama ve hazırlık artar ayıklayın. Bu nedenle, mümkün olduğunca hızla aşağıdaki adımlarda devam etmek önemlidir.- 1x MMR 4 L, 0.1x MMR 50 ml ve damıtılmış su içerisinde yapılan% 2 sistein, pH 7.7, 400 ml hazırlayın. 16 ° C'de tüm çözümler koruyun
- Ek yumurta çıkarmak için yavaşça kurbağa alt sırt ve karın sıkın.
- , Kurbağa ve MMR toplu çıkarın her kova MMR yaklaşık 1-200 ml yumurta bırakmak.
- Bir transfer pipet ile enkaz kaldırma ve yumurta kalitesini değerlendirmek: Yüksek kaliteli yumurta genellikle koyu pigmentli hayvan yarımkürede ve hafif renkli bitkisel yarımkürede arasında net bir ayrım tarafından işaretlenir ve en koyu-to-ışık kontrast vardır. Bir transfer pipet atmak onlar ekstraktının genel kalitesini azalacak gibi (beyaz ve kabarık), lifli benekli veya lize görünür herhangi bir yumurta. Yumurtaların>% 10 kalitesiz ise, tümToplu atılmalıdır.
- 500 ml'lik bir cam kabın içine yumurta birleştirin ve su altı yumurta tutarken mümkün olduğunca MMR dökmek.
- MMR iki yumurta hacmi ile nazik dönme tarafından yumurta durulayın. Iki kez tekrarlayın, ve herhangi bir enkaz veya açıkça kalitesiz yumurta kaldırmak.
- , Cam behere 2% sisteinin yaklaşık 100 ml ilave edilir karıştırmak için yavaşça girdap ve yumurta 16 ° C'de 5 dakika boyunca yerleşmek için izin Sistein dökün. NOT: onlar şimdi jöle kat olmadan daha küçük bir hacim işgal olarak Dejellying yumurta ve yumurta daha kompakt ambalaj üzerinde yüzen jöle kat kademeli görünümünü tarafından işaretlenir.
- ,% 2 sisteinin diğer bir 100 ml ilave edilir yavaşça girdap, 5 dakika bekleyin ve daha sonra yavaş yavaş sistein dökün. Yumurta (genellikle üçüncü sistein tedavisi ile) sıkıca sıkıştırılmış haline gelmiştir kadar tekrarlayın. Not: yumurta sistein çok uzun süre kalan, bunlar lize yatkındır. Benzer şekilde, dejellied yumurta kırılgan ve mekanik liziz eğilimli eğerOnlar havaya maruz eğer çok güçlü bir şekilde kıvrıldı veya edilir. Yumurta dejellied edilmiş, hızlı bir şekilde santrifüj adımları devam etmek için önemlidir.
- Sistein dökün ve hafifçe 1x MMR yumurta yıkayarak jöle ceket ve diğer enkaz uzaklıkta yıkayın. Beherin tarafı boyunca dikkatli bir şekilde tampon dökün. Iki kez tekrarlayın veya MMR çözüm kadar bulutlu artık. 1x MMR ile durulama sırasında bir transfer pipet kullanarak kötü yumurta kaldırmak için devam ediyor.
- 30 ml 0.1x MMR ile bir nihai nazik durulama gerçekleştirmek ve yavaşça mümkün olduğu kadar tampon kadar kapalı dökün. Yine, herhangi bir tabii ki kötü yumurta kaldırmak.
- Santrifüj ile Yumurta Paketleme ve Kırma
Not: Bu, aşağıda tarif Ekstre β-katenin bozulması için kullanılan sitostatik faktör ekstraktı (metafaz II-tutuklandı) bir çeşididir. Hücre döngüsü çalışmaları için kullanılan düşük hızda ve yüksek hızlı ekstresi aksine, orta hızlı ekstresi β-katenin indirgenmesi için en iyi şekilde çalışır. Benhazırlamak için yoğun emek daha olmasına rağmen nterphase özü benzer sağlam β-katenin bozulmasını teşvik etmektedir.- 10 mg / ml stok solüsyonundan seyreltilmiştir 20 ug / ml (at ve Cytochalasin D (a DMSO içerisinde 10 mg / ml stok çözeltisinden seyreltilmiş) 10 ug / ml 'de Leupeptin, Pepstatin, Aprotinin karışımı (LPA, bir proteaz inhibitörü) ekleme 0.1x MMR kalan 20 ml), DMSO.
- 0 ekleyin. X MMR yıkandı, yumurta ve LPA Cytochalasin D ihtiva eden, yavaşça girdap ve 16 ° C sıcaklıkta 5 dakika boyunca inkübe
- , 16 ° C önceden soğutulmuş 50 ml santrifüj tüplerine yumurta transferi yumurta yerleşmek için izin ve üst kalıntı tamponu çıkarın. , Havaya maruz kalmayı önlemek önce transferini yumurta çekilmesi için aktarma pipet içine tampon küçük bir miktar geri çekmek için. Yumurta üstüne santrifüj tüpü doldurmak kadar verimini maksimize edecek olan, santrifüj tüplerine ilave yumurta transferi ve tüpün üstünden kalan tampon kaldırmak için devamayıklayın.
- Bir sabit açılı rotor kullanılarak 4 ° C'de 60 saniye boyunca 400 xg'de yumurta, spin santrifüj tüpleri paketi için. Santrifüj tüplerine üstünden kalıntı tamponunu çıkarın.
- Ezme bir dönüş için, 4 ° C'de 5 dakika boyunca 15,000 xg'de tüpler dönmeye
- Özü Sitoplazmik Katmanı Toplama
Not: Aşağıda tarif edilen yöntem olup, sitoplazmik tabaka toplamak için, santrifüj tüpünün yan delme klasik yöntem farklıdır. Bu protokol, basitleştirme ve yeniden kullanılabilir, özellikle santrifüj tüpleri, kullanım için adapte edilmiştir. Β-katenin degradasyon kinetiği hiçbir gözle görülür bir fark yöntemi ile ya da bulunur. Bu noktada özü de süreç boyunca sırasında soğuk tutulmalıdır ve tüm adımlar 4 ° C'de gerçekleştirilmelidir- P1000 pipet kullanarak lipit tabakasında bir delik temizleyin.
- Koyu renkli bir tabaka ile li arasında sitoplazmik tabakasının (toplamaktemiz önceden soğutulmuş santrifüj tüplerine yeni P1000 pipet kullanarak GHT lipit tabakası) (Şekil 1). Sağlam β-katenin bozan, yüksek kaliteli özü için, sitoplazmik tabaka ile çekilir pigmentli ve lipid tabakasının miktarını en aza indirir.
- Spin 4 ° C'de 10 dakika boyunca 15,000 xg'de sitoplazmik tabaka tekrar ekstre edildi ve sitoplazmik faz toplanır. Spin ve çıkarma 1X tekrarlayın. NOT: özü "saman renkli." Olmalıdır Önemli bir kirlenme bu noktada pigmentli ve lipid tabakaları ile varsa fazla döndürme β-katenin indirgeme özü kapasitesini azaltmak rağmen, bir, spin bir kez daha tekrarlayın.
- 10 ug / ml her bir nihai konsantrasyonlarda ekstreye LPA ve Cytochalasin D ekleyin. Not: tanımlanan yöntemi kullanarak, bir yaklaşık olarak 50 mg / ml 'lik oldukça tutarlı bir toplam protein konsantrasyonunu (52.41 ± 5.40 mg / ml, n = 3 ayrı preparatlarıyla) Xenopus verir, örneğing özler.
- (İsteğe bağlı) çeviri tahlilleri için, kapaklı mRNA (0.1 mg / ml) ekleyin, RNAsin (1.5 U / ml), ve enerji yenilenmesi karışımı (2.2.1) ve 2 saat boyunca oda sıcaklığında, reaksiyonu inkübe (Daha fazla bilgi için bkz: Salisli diğ ark. 2 ve Sive et al. 33). Β-katenin bozulması deneyleri ya da daha sonra kullanmak için sıvı azot içinde ek dondurulmasını yerelleştirilmiş özü kullanın. NOT: Taze hazırlanmış özü egzojenik eklendi mRNA çevirmek için yüksek kapasiteye sahip, ama özü donmuş bir kez, ne yazık ki, bu kapasite kaybolur. Kapaklı mRNA hali hazırda ticari olarak temin edilebilen kitler kullanılarak hazırlanabilir.
- Sıvı nitrojen içinde dondurularak özü ek bileşen. Not: hızla refrozen ise β-katenin indirgeme kapasitelerini kaybeder çünkü özleri, tek kullanım için küçük (200 ul) alikotlar içinde muhafaza edilirler. Uzun süreli depolama için, özü sıvı azot içinde saklanabilir. Kısa süreli depolama için, özü, -80 ° C'de saklanabilir rağmen kapasite oβ-katenin indirgeme f çıkarmak önemli ölçüde -80 ° C (2 aydan daha uzun) da uzatılmış depolama ile azaltılabilir.
2.. Β-katenin Parçalanma Testi için ekstresinin hazırlanması
- Xenopus Özü Tükenme
Not: Xenopus özü önemli bir avantajı, kolay bir şekilde bir yolunun bileşenlerini tüketmek ve tam da doza bağlı etkileri belirlemek amacıyla bir proteinin belirli bir miktar geri ekleme kapasitesidir.- Taze hazırlanmış Xenopus yumurta özü kullanın ya da hızlı buz üzerinde donmuş özü ve yer eritin. Soğuk tüm manipülasyonlar gerçekleştirin.
- Topak haline antikor veya afinite taneleri (örneğin, 200 mi, 20 ml ekstresine topak boncuk) hacminin 1/10 ile özü ekleyin. , Ekstrenin seyreltme en aza indirmek uzun, konik uçları olan jel yükleme ipuçları ile özü eklenerek önce mümkün olduğu tanelerden kadar sıvıyı çekmek için.
- Döndür özü-1 saat boyunca 4 ° C 'de boncuk karışımı.
- 30 saniye için 4 ° C'de 12,600 x g'de mikrofüj içinde Spin özü boncuk karışımı. Alternatif olarak, manyetik boncuklar kullanıldığında, boncuk toplamak için manyetik bir alan uygulanır.
- Aktarım buz üzerinde yeni bir mikrofüj tüpüne özü tükenmiş. Özü ile herhangi bir boncuk aktarmak için dikkatli olun.
- Tükenmiş özü ve boncuklar hem imünolekelemeyle tükenmesi verimliliğini onaylayın.
- 2.2 'de tarif edildiği gibi β-katenin indirgeme deneyi için özü hazırlayın.
- Xenopus β-katenin Bozulması Özü optimize
Not: Xenopus yumurta özü β-katenin bozunma hızlı bir endojen ATP depolarını azaltan bir enerji-bağımlı bir süreçtir. Sonuç olarak, bir enerji dönüşüm sistemi güçlü bir β-katenin bozulmasını sağlamak için gereklidir.- 150 mM kreatin fosfat aşağıdakilerden oluşan bir 20x enerjisi geri kazanımı (ER) karışım hazırlayın, 20 mM ATP, 600 mg / mL kreatin fosfokinaz,ve 20 mM MgCl2. ER -80 ° C'de numune alınır ve saklanmalıdır Küçük dondurulmuş alikotları kullanılarak tekrarlanan donma / çözülme döngüsü kaçının.
- Hızla elleri arasında donmuş tüp sürtünme tarafından Ksenopus yumurta özü eritin. Ekstrenin her eridikten hemen önce buz üzerinde tüp yerleştirin.
- Xenopus yumurta ekstresinin bir kısım (200 ul) içine enerji yenilenmesi karışımı (20x ER) 10 ul ekle. Hızlı boru ve darbe vorteks hafifçe vurarak iyice karıştırın. -Spin Darbe ve hemen buz üzerine yerleştirin.
- (Isteğe bağlı) β-katenin devir hafifçe ubikitin (1.25 mg / ml nihai) ilavesi ile Xenopus yumurta özü geliştirilebilir. Sikloheksimid (nihai 0.1 mg / ml), aynı zamanda, endojen transkriptlerinin çevrilmesinin en aza indirmek için ilave edilebilir.
- Buzda önceden soğutulmuş mikrofüj tüplerine bozulması tahlili için, uygun hacimleri kısım. Radyo-etiketli β-katenin bozulması deneyleri için, 2-5 ml her bir zaman noktası için geri çıkarmak. '/ Li>
Xenopus yumurta özü 3. Radyo-β-katenin indirgeme deneyi
NOT: Aksi belirtilmedikçe tüm aşamaları, buz üzerinde gerçekleştirilmelidir.
- Radyo-β-katenin hazırlanması
- Ticari olarak temin edilebilen kitler kullanılarak in vitro olarak sentezlenmiş [35 S] methionine-radyo işaretli protein taze hazırlayın. Not: Yaratma 35 (87 gün yarı-ömür) S-etiketli proteinler, kolay ve etkili bir şekilde ticari olarak temin edilebilir, in vitro transkripsiyon çiftli-çeviri kitleri kullanılarak üretilmektedir. Bu çevrilen protein yeterince protein devir değişiklikler kolaylıkla görselleştirilebilir şekilde işaretlenmiş olması önemlidir.
- Başarılı radyolabelinge doğrulamak için, çevrilmiş proteinin 0.5 ul SDS-PAGE/autoradiography gerçekleştirin. ImageJ, ImageQuant, ya da alternatif bir kantitatif bir yazılım progr kullanılarak radyo-etiketlenmiş β-katenin bant yoğunluğunu ölçmekduyuyorum. NOT: radyoetiketlenmiş β-katenin protein bandı birkaç saat (4-6 saat) içinde filmde açıkça görülebilir olmalıdır.
- Depolama için sıvı azot içinde radyo etiketli protein Gizlenebilir dondurularak kullanılana kadar. Not: Uzun süreli depolama (> 2 ay) ve birden fazla donma / çözülme (2 'den daha büyük) ciddi bir şekilde Xenopus yumurta özü sağlam indirgeme radyo-etiketli β-katenin kapasitesini etkileyebilir. Tipik olarak, radyoaktif olarak işaretlenmiş proteinlerin stabilitesi -80 ° C 'de depolama 1 ay sonra önemli ölçüde azalır; Bu şekilde nispeten taze hazırlanmış radyo-etiketli β-katenin, bu bozulma deneylerde iyi sonuçları verir.
- Β-katenin Parçalanma Testi gerçekleştirmek
- In vitro dönüştürülmemiş β-katenin 1-3 ul (radyo-etiketli bant sinyalinin gücüne bağlı olarak) ilave (ve diğer proteinler, test edilmektedir gibi küçük moleküller) buz üzerinde Xenopus Reaksiyon karışımı 20 ul halinde. Quickl ile iyice karıştırıntüp ve vorteks kısa bir darbe flicking y; Xenopus yumurta özü çok viskoz olduğu gibi bu önemli bir adımdır, ve eksik karıştırma sonuçlarının tutarlılığını etkileyecektir. Buz üzerinde nabız spin ve yer.
- Oda sıcaklığına kadar tüpler kaydırarak β-katenin bozunma reaksiyonunu başlatın.
- Belirlenmiş bir zaman noktasında, numunenin 1-5 ml çıkarın ve reaksiyonu durdurmak için SDS numune tamponu (5x hacim) ile hemen karıştırın. Emin olmak için bozunma reaksiyon tamamen şiddetle fiske tüpü, birkaç kez ve vorteks sonlandırılır.
- SDS-PAGE/autoradiography gerçekleştirin. Her bir zaman noktası / şerit için ekstraktı 1 mL eşdeğer (~ 50 mg protein) çalıştırın. Xenopus yumurta özü β-katenin bozulması radyo-etiketli β-katenin bant Şekil 2'nin yoğunluğu zamana bağımlı olarak azalmasına bağlı olmalıdır. ImageJ, ImageQuant veya diğer tercih edilen görüntüleme yazılımı gerektiğinde kullanarak sonuçları ölçmek.
- (Optimumonal) arka plandaki radyoaktivitenin azaltmak ve görüntü kalitesini arttırmak için kurutmadan önce damıtılmış su) çözeltisi içinde (% 10 asetik asit ve% 30 metanol sabitleme SDS-poliakrilamid jeli bekletin.
Xenopus Yumurta Özü 4. Β-katenin-lusiferaz Parçalanma Deneyi
Aksi belirtilmedikçe, buz üzerinde tüm adımları uygulayın.
- Β-katenin-lusiferaz hazırlanması
- Tam bir amino asit karışımı ile transkripsiyon-çevirme bağlanmış sistemi kullanılarak radyo-etiketlenmemiş, lusiferaz etiketli-β-katenin sentezlenmesi.
- Reaksiyonun 0.5-1 ul lusiferaz aktivitesi ölçülerek lusiferaz etiketli β-katenin üretimini teyit edin. Çevrilmemiş Reaksiyon karışımı ışıltı ölçülerek arka plan aydınlığı değerlendirin. NOT: Birden çok kit lusiferaz aktivitesinin ölçülmesi için kullanılabilir. Uzun ömürlü parlaklık Bununla birlikte, bozunma assa için özellikle iyi çalışıry.
- Β-katenin-lusiferaz Parçalanma Testi gerçekleştirmek
- Çözülme ve 2.2 olarak Ksenopus yumurta özü hazırlamak.
- Buz üzerinde (2,2) hazırlanan Ksenopus reaksiyon karışımı içine in-vitro tercüme β-katenin-lusiferaz füzyon (4.1 dan itibaren) ekleyin ve 3.2.1 olarak iyice karıştırın. Not: ekstresine ilave edilir β-katenin lusiferaz aktivitesi, tipik olarak 20'dir - 50000, göreli ışık birimi (4.1.2 elde edilen ölçümlerine göre) ekstresinin (RLU) / ml. Başlangıç sinyali yaklaşık olarak 100.000 RLU (in vitro çevrilmiştir-β-katenin-lusiferaz füzyon 2-5 ml) az olmalıdır.
- Oda sıcaklığına özü Shift bozunma reaksiyonunu başlatın.
- Belirtildiğinde, reaksiyonun bir kısım çıkarın ve ek sıvı azot içinde dondurulması. Not: Üç kopya numuneler tipik olarak, her bir zaman noktası için analiz için kaldırılır. Dondurulmuş özü -80 ° C'de saklanabilir until bunlar analiz edilecek hazırız.
- Çözülme örnekleri buz, buz üzerinde standart beyaz 96 oyuklu plakalara aktarımı örnekleri, ve lusiferaz aktivitesi için işlem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Xenopus yumurta özü β-katenin bozulmasının bir şematik Şekil 2A'da gösterilmiştir. 35 S-etiketli β-katenin Xenopus yumurta özü inkübe edildi, alikotlar (1 mi eşdeğer özü) uygun zamanlarda çıkarıldı ve numuneler tabi tutuldu SDS-PAGE ve ardından otoradyografi. Wnt yolağının bileşenleri ile β-katenin bozulması, ubikitin-proteazom sistemi 2 tarafından aracılık edilir ve Xenopus özü [35 S]-radyo işaretli β-katenin bozunma MG132 proteazom önleyicisi Şekil 2B eklenmesi ile inhibe edilir. Wnt yolağının bileşenleri ile β-katenin bozulması GSK3 34 tarafından fosforilasyonu bağlıdır. Xeno olarak stabilize 1) β-katenin (SA) mutant (GSK3 fosforilasyon siteleri alaninler için mutasyona): GSK3 bağımlı bozulması kolayca Xenopus yumurta ekstraktı kullanılarak çeşitli şekillerde gösterilebilirvahşi tip β-katenin protein Şekil 2B'ye irin yumurta özü göreceli. 2) GSK3 (LiCİ) küçük molekül inhibitörleri Benzer β-katenin (Şekil 2C) parçalanmasını inhibe eder. 3) Son olarak, Xenopus yumurta ekstreden GSK3 tükenmesi β-katenin bozunmasını inhibe eder; bozunma eksojen GSK3 eklenmesiyle tarafından kurtarıldı olabilir 2D-E Rakamlar.
Radyo-etiketli β-katenin bozulma deney bozulma kendi modu (apoptotik bölünmeye karşı ubikuitin-aracılı, yani bozulma) bir özel bilgi görsel değerlendirme sağlar. Otoradyografi, ancak, emek yoğun, ve büyük bir kısmı, yolun yüksek verimli analiz için sınırlı (örneğin, Wnt yolu küçük molekül modülatörleri için eleme) 'dir. Β-katenin-lusiferaz deney bozulma daha kolay ve hızlı bir şekilde ölçülebilir yayılan ışıma miktarı gibidir am doğrudan orantılıdırβ-katenin-lusiferaz proteini seviyesini arttırır. Bu özellik, yüksek verimlilik deneyleri için, lusiferaz deneyi, basit ve kolayca uyarlanabilir hale getirir.
Bu fuzyon olmayan lusiferaz füzyon proteininin edilene benzer özelliklere sahip olduğunu belirlemek önemlidir. Bu deneysel dahili olarak N-terminalinde, C-terminalinde, ya da lusiferaz proteinini kaynaştırarak belirlenebilir. Β-katenin N-veya C-terminaline lusiferaz füzyon Xenopus yumurta özü 2, 19, 20, memeli hücreleri ya da dönüşüm hızını incultured Wnt hedef genleri aktive etme kapasitesini etkilemez.
Xenopus yumurta özü temsili bir β-katenin-lusiferaz deney bozulması β-katenin-lusiferazın bozulması radyo-etiketli füzyon proteini ve lusiferaz aktivitesinin SDS-PAGE/autoradiography ile değerlendirildi ettiği Şekil 3A'da gösterilmiştir. Degradatio oranıβ-katenin-lusiferaz n etiketsiz β-katenin protein benzer. Β-katenin-lusiferaz füzyon için bozulma düzenleme β-katenin-lusiferaz ciro inhibisyonu ile sonuçlanmıştır LiCI eklenmesi veya GSK3 tükenmesi ile fuzyon olmayan protein ile esasen aynıdır. Şekiller 3B-C'de gösterildiği gibi, β-katenin-lusiferaz proteini radyoaktif sinyalindeki değişiklikler, zaman içinde enzimatik lusiferaz aktivitesindeki değişiklik ile orantılıdır. Β-katenin-lusiferaz (in vitro transkripsiyon, çeviri sistemi için özel olarak oluşturulmuş füzyon proteini) kullanarak ortaya çıkan bir sorun, dahili translasyon başlangıç sitesi veya erken translasyon sonlandırma Şekil 3D kullanımından kaynaklanan arka plan lusiferaz sinyaldir. Bu sorun, bazen IVT reaksiyonda kullanılan DNA konsantrasyonunun optimize edilmesi ile üstesinden gelinebilir. Biz değişiyordu Biz, ancak, arka plan lusiferazm bir düşüş yoktuBizim özellikle β-katenin-lusiferaz yapı için plazmid DNA konsantrasyonu. Bu, daha ayrıntılı bir iç translasyon başlangıç sitesi ve / veya β-katenin-lusiferaz füzyon proteininin, erken translasyon sonlandırma en aza indirmek için mutagenez ile füzyon proteini yeniden tasarlanması gerekir olasıdır. Lusiferaz protein Xenopus yumurta özü Şekil 3A'da bozunma reaksiyonunun süresi boyunca oldukça kararlı olduğu için, tam uzunluktaki β-katenin füzyon lusiferaz kesik proteinin oranı bilinen ise, bununla birlikte, bu arka plan sinyali sadece çıkartılabilir .
Lusiferaz deneyi bir ışınım β-katenin bozulmasının modülatörler için yüksek verimli tarama yapmak için izin veren bir çok-çukurlu formatta şekilde büyütülebilir kapasitesidir. Şekil 4'te, temsili bir dama tahtası analizi inhibe β-katenin bozunma inhibitörü, MG132 kullanılarak gösterilir proteazomu. Dama tahtası Deneyin sonucu, tahlil, bir 96-çukurlu formatta tek tip ve yeniden üretilebilir ve yüksek miktarda madde taraması için uygun olduğunu göstermektedir gösterir.
Şekil 1.. Konsantre Xenopus yumurta ekstresinin hazırlanması şematik bir temsili. Yumurta HCG enjekte Xenopus'ta toplanan bir düşük hızda (400 xg) Spin ile sıkıştırılmış ve ezilmiş ve orta hızda (15.000 xg ile ayrılmış kadın, laevis'den ) dönerler. , Dorsal lenf kesesi içine deri altına enjekte dikkatle kötü yumurta kaldırmak ve metinde belirtildiği gibi dikkatlice düşük kaliteli koyu özütten yüksek kaliteli sitoplazmik özü ayırmak için özen gösterin.
ŞEKIL 2 "fo: İçerik-width =": / files/ftp_upload/51425/51425fig2highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51425/51425fig2.jpg "/>" src = fo "5in
Xenopus yumurta özü kuluçkaya olduğunda bir IVT reaksiyona sokulması suretiyle hazırlanabilir Şekil 2,. Β-katenin Xenopus yumurta ekstresi. A) ve bozulma tahlilinde. B şematik inkübe güçlü şekilde bozar) [35S] etiketli β-katenin güçlü şekilde bozar. Xenopus yumurta ekstresine MG132 (200 uM) ilavesi, β-katenin bozulmasını inhibe eder. GSK3 β-katenin içinde phosphosites (β-katenin SA) ya da LiCI (25 mM) C) eklenmesi Alaninlere mutasyon β-katenin bozulmasını. D) Axin (amino asitler 506-560 ve GSK3 bağlanma sitesi) etkili bir şekilde inhibe eder tüketir GSK3'ün Xenopus yumurta özütten. E) GSK3-tükenmiş Ksenopus yumurta özü β-katenin bozulmasını önleyen ve o ilave tarafından kurtarıldı olabilirf rekombinant GSK3 (0.1 mg / ml). LiCİ (25 mM) blokları GSK3-tükenmiş ekstrede β-katenin bozulmasını kurtarmak için rekombinant GSK3 kapasitesini eklenmesi. resmi büyütmek için buraya tıklayın.
Xenopus yumurta özü kuluçkaya zaman Şekil 3,. Lusiferaz-etiketli β-katenin düşürür. A) Radyo-β-katenin-lusiferaz etiketsiz β-katenin protein edilene benzer bir oranda düşürür. Vahşi tip protein ile olduğu gibi, LiCI (25 mM) ilavesi β-katenin-lusiferaz bozulmasını inhibe eder. Yalnız Lüsiferaz belirgin Ksenopus yumurta özü over açılmıyor. Β-katenin-Lucifer lusiferaz aktivitesinde değişiklikler. D lusiferaz aktivitesi ölçülerek değerlendirilir olarak ase ile füzyon proteini seviyelerindeki değişiklikleri paraleldir. B) LiCI (25 mM) ilavesi veya GSK3 C tükenmesi) in vitro) immunoblotting β-katenin-lusiferaz geri kazanımını önleyen çevrilmiştir β-katenin- (bir anti-lusiferaz antikor kullanarak) lusiferaz olasılıkla radyoaktif işaretli bozulma tahlile göre daha yüksek arka katkıda belirli preps serbest lusiferaz önemli miktarlarda protein saptandı. resmi büyütmek için buraya tıklayın.
Xenopus özü β-katenin-lusiferazın Şekil 4. Düzenlenmiş bozunma uyarlanabiliryüksek verimli bir biçim. β-katenin bozunma inhibitörü olarak MG132 (450 uM) ile β-katenin-lusiferaz için temsili bir dama tahtası analizi. Gölgeli sütun MG132-muamele edilmiş kuyu gösterir ve daha açık sütunlar (DMSO) ile muamele edilmiş kuyu araç temsil eder. Yüksek verimli tarama potansiyel kullanım için kabul edilebilir bir tahlili gösteren, 0.3 puanı miktar tayini ve Z-faktör hesap sonucu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Xenopus yumurta özü β-katenin ciro araştırmak için sağlam bir biyokimyasal sistemidir. Xenopus yumurta özü β-katenin konsantrasyonu ~ 25 nM 2'dir. Uygun koşullar altında, yumurta özü 50-100 nM / st 'lik bir oranda β-katenin parçalama yeteneğine sahip olan ve 200 nM, 24 yarı-maksimumdur. Xenopus yumurta özü kullanılarak β-katenin bozulması başarılı sulandırma için birkaç önemli adım vardır. Bu yüksek kaliteli Xenopus yumurta özü ve yumurta ekstrakt elde edildiği şekilde üreten 1), 2) radyo-etiketlenmiş kalite β-katenin ve β-katenin-lusiferaz proteinini, 3) β-katenin bozulmasını desteklemek için reaksiyon koşullarını optimize etmek ve 4 üretilmesi reaksiyon zamanı puan) uygun işleme.
Β-katenin sağlam düşer edildiği Xenopus yumurta özü yüksek kalitede bir hazırlama th kalitesine hem de bağlıdıre yumurta ve yumurta gibi özüt daha sonra, son özü elde etmek üzere santrifüj işlemine nasıl önce ezilme aşamasından nasıl ele. Protokolde belirtildiği gibi, kalitesiz yumurta (, lifli benekli veya beyaz puflar) boyunca kaldırılır, (karanlık hayvan yarımkürede ve hafif bitkisel yarımküre arasındaki tezat kanıtladığı) sadece yüksek kaliteli yumurta kullanılmasını sağlamak için önemlidir yumurta prosedür boyunca soğuk bir sıcaklıkta (16 ° C) muhafaza edildi ve prosedür kısa sürede gerçekleştirilir ki olduğu proses. Bu ekstresinin miktar için kaliteden ödün vermemek önemlidir. Ayrıca, daha önce belirtildiği gibi, kalitesiz yumurta (>% 10) bırakır bir kurbağa yumurta tamamen atılmalıdır.
Yukarıda tarif Ekstre mayoz II-tutuklandı CSF özü 11 bir modifikasyonudur. Β-katenin bozulması (ara-ürün hızlı ekstresi) fark için Xenopus yumurta ekstresinin hazırlanmasıers düşük hızda veya yüksek hız olan hücre döngüsünü 30-32 eğitimi için hazırlanan klasik özleri, 35 ayıklar. Diğer proteinlerin optimum bozulması için Ksenopus yumurta özü Uyarlama santrifüj hızı ve spin sayısını değiştirmeden gerektirebilir. Düşük hız özü sağlam organelleri ve diğer büyük hücresel bileşenleri içerir. Bu nedenle, daha yüksek hız spin ekstrenin bileşimini değiştirmek ve potansiyel olarak, ilgi konusu proteinin bozunmasını etkileyecek önleyici ve / ya da temel bileşeni kaldırır. Bu tarifnamede tarif edilen ara hız ekstresinin hazırlanması Wnt yolağının bileşenleri ile β-katenin indirgenmesi için optimize edilmiştir. (Başka bir Wnt bileşen, Axin degradasyonu üzerinde minimal bir etkiye sahip olmasına rağmen) 4X daha büyük özü İplik önemli β-katenin indirgeme özü kapasitesini azaltabilir. β-katenin düşük hızlı eğirme özü kaspaz aracılı proteolize karşı hassastır ve yok değildir noticeably yüksek hızlı sıkma özü parçalanabilir. Bu nedenle, farklı hız ekstreler diğer sinyal yollarının bileşenlerinin indirgenmesi için uygun olması olasıdır.
35. S-β-katenin ve β-katenin-lusiferaz üretimi ticari olarak temin edilebilen kitler bir dizi kullanarak gerçekleştirilebilir. Transkripsiyon için birleştirilmiş sistemleri kullanılarak protein üretim plazmidin kalitesine çok bağlıdır: plazmidlerin oldukça saf midi-preparatları daha iyi çalışır ve DNA mini preparatlar ile karşılaştırıldığında daha güvenilirdir. Β-katenin, radyo-etiketleme için, taze [35 S] metionin ya da Translabel ([35 S] methionine artı [35 S] sistein) tercih edilir elde edilmiştir. Bu metiyonin ve sistein hem de uzun süreli depolama ve böylece in vitro transkripsiyon için bağlanmış reaksiyonunda β-katenin içine dahil edilmesi, azalan oksitlemek için bir eğilim vardır edin. Çünkü uzun süreli depolama ve tekrarlanan donma-çözülmedöngüleri bozulmasını inhibe edebilir, radyo-etiketli β-katenin, az miktarda bir anda hazırlanır ve kısa bir süre sonra kullanılır.
Çevrilmiş proteinin ve proteinin içinde metiyoninler sayısının miktarı, radyo-etiketli sinyalin gücünü belirler. Β-katenin için, bozulması deneyleri için güçlü bir radyoaktif sinyaller elde herhangi bir sorun olması gerekir. Birkaç metioninler ve / veya çok iyi tercüme yok, bir [35 S] metionin ve proteinler için [35 S] sistein mix yerine [35 S] metionin kullanılan ve / veya birden içeren bir epitop etiketi (Myc'nin) eklenebilir metionin. Uygun faj promoterleri (T7, T3 ve SP6) içeren çeşitli ekspresyon plazmidleri ile başarılı in vitro transkripsiyon için reaksiyonlar için elde edilebilir olsa da, pCS2 bazlı plazmid genellikle en iyi sonucu verir. Buna ek olarak, çevrilmiş proteinin sinyal bazen önemli ölçüde endojen 5 silerek arttırılabilir'UTR. Son olarak, büyük ölçekli deneyler (örneğin, yüksek verimli tarama) için, yeniden birleştirici β-katenin-lusiferaz büyük bir miktar gerekli olabilir. Sf9 / bakulovirüs sistemi için β-katenin-lusiferaz Xenopus özü ve embriyolar 2'deki vahşi tip β-katenin ile benzer kinetiklerle alçaldığı için. Seçenek olarak ise, in vitro sentezleme sisteminde, yüksek verim (örneğin, buğday tohumu bazlı) başarılı bir şekilde yüksek verimli tarama 19, 20 için kullanılmıştır.
Güvenilir bir özüt sisteminde β-katenin bozunmasını ölçmek için, bu radyo-etiketli β-katenin veya lusiferaz β-katenin füzyon ya da ikinci başlangıç sinyalinin yeteri kadar sağlam olması önemlidir. Bu durumda, bozulma tahlilin boyutuna deneyi ile optimizasyon bir miktar, zaman noktalarının sayısı gerekli ve in vitro dönüştürme reaksiyonu wi verimgerekli olacak. Bozunma reaksiyonu monte ederken, bir sağlam bozulması elde şansını artırmak için atabileceğiniz bazı adımlar vardır. İlk olarak, tüm reaktiflerin hemen çözdürülmelidir ve önce kendi tam çözülmesi için buz üzerine yerleştirilmiştir. Β-katenin bozulması son derece bağlıdır enerji olduğundan, bu ER nispeten taze olması önemlidir. İkinci olarak, Xenopus yumurta özü viskozdur ve bu tepkime iyice radyo-etiketli füzyon β-catenin/β-catenin-luciferase ilave edildikten sonra, ER, vb protein, küçük molekül modülatörleri, Üçüncü olarak, reaksiyonun ön kuluçkaya karıştırılır kritiktir küçük molekül modülatörlerinin etkilerini test edilirken buz daha fazla tekrarlanabilir sonuçlar verir 20-30 dakika boyunca karıştırın.
Xenopus yumurta özü proteinleri tüketmek için kapasite protein işlevi ve onların konsantrasyon bağımlı etkilerini değerlendirmek için güçlü bir araç temsil eder. Bir örnek olarak, göstermektedir ki Xe ikinci GSK3 tüketenβ-katenin ciro GSK3 önemli rol belirten nopus yumurta özü blokları β-katenin bozulması. Farklı tükenmesi koşullar ampirik olarak farklı proteinler için tespit edilmesi gerekir. Örneğin, bol proteinler, tam olarak tükenmesini sağlamak için kullanılan antikor veya afinite ligand boncuk miktarında bir artış gerektirir. İyi bir başlangıç noktası özü seyreltme en aza indirmek amacıyla 1/10, ekstrenin hacmi en paketlenmiş boncuk kullanmaktır. Kullanılan hedef proteinin, boncuk türüne göre (örn., sefaroz, agaroz, veya manyetik) olarak, antikor / afinite ligandı bağlanma gücüne ek olarak, Xenopus yumurta özü 36 protein tükenmesi etkinliğini etkileyebilir. Son olarak, (tipik olarak immünolojik işaretleme ile) tükenmesi ölçüde analiz etmek için ideal olacaktır. Β-katenin Reaksiyon tamamlandıktan sonra, numuneler işlenir hangi bir şekilde büyük ölçüde deney sonuçlarını etkileyebilir. KonsantrasyonuTarif edilen şekilde hazırlandı Xenopus yumurta ekstresi preparatlarıyla 52,41 mg / 5.40 mg / ml ± ml olduğunu ve SDS-PAGE jeli kapasitesini aşırı için önemli değildir; bu, lusiferaz-β-katenin deneyi ile ilgili bir sorun değildir. Dolayısıyla, her bir zaman noktası için, özütün eşdeğer fazla 1 ml bir SDS-PAGE jeli her şeride yüklenmelidir. Ayrıca sonuçların kalitesini artırmak için, jel tespit adımı (isteğe bağlı) arka plandaki radyoaktivitenin azaltmak ve sinyal-gürültü oranını arttıracaktır. Lusiferaz deneyi için, Xenopus yumurta özü 100,000 RLU bir başlangıç sinyalinden bir azalma sadakatle β-katenin-lusiferaz füzyon proteininin protein seviyelerindeki değişimi yansıtır.
Xenopus yumurta ekstre sistemi β-katenin bozulması düzenlenmesini incelemek için çekici bir sistemi temsil eder. Ekstre sistem tükenmesi ve reconstitu üzerinden bireysel proteinlerin konsantrasyonunun hassas kontrol sağlar: tion. Zamanla β-katenin ciro kinetikleri üzerindeki etkilerini izlemek için kapasitesi daha iyi bir Wnt sinyal iletiminde önemli bir aşama, bu biyokimyasal mekanizmasını anlamak için izin verir. Bu tür manipülasyonlar Wnt yolunun bileşenleri arasındaki karmaşık moleküler etkileşim içine derin anlayış sağlamış ve Wnt yolunun 24 ilk matematiksel modelin geliştirilmesi için kritik uğradılar. Bir uyarı Xenopus yumurta özü ve memeli hücre lizatlarında Wnt yolu bileşenlerinin konsantrasyonları muhtemelen Wnt yolu yetişkin durumda 37 versus embriyojenez sırasında düzenlenir şekilde farklılıkları yansıtmaktadır, farklı tespit edilmiş olmasıdır. Xenopus yumurta özü kullanılarak radyoaktif ve enzimatik, lusiferaz dayalı deneyleri gerçekleştirmek için kapasite β-katenin bozulması biyokimyasal düzenlenmesi eğitim için güçlü bir tamamlayıcı nitel ve nicel araçlar eklendi sağlar.
β-katenin devir izlenmesine ek olarak t ">, negatif Wnt regülatörü, Axin, bozulması ya da lusiferaz için bir radyo-etiketli füzyon proteini olarak ya da Xenopus yumurta özü olarak izlenebilir. lusiferaz bir varyantını kullanarak, Renilla, kaynaşmış Axin, daha önce, aynı anda iki Wnt yolu proteinler, β-katenin ve Axin 19, 20 modülatörlerinin taranması için yüksek verimli bir format lusiferaz ayrışma deneyi için uyarlanmıştır. bu biyokimyasal ekran artan FDA onaylı bir ilaç, pyrvinium tespit ve sırasıyla, β-katenin ve Axin, degradasyon oranı azalmıştır Xenopus yumurta özü 19'da. Pyrvinium ardından doğal Wnt küçük bir molekül inhibitörü olarak kültürlenmiş insan hücreleri ve çeşitli model organizma (örneğin, Xenopus ve C. elegans) doğrulandı yolu. Özetle, Ksenopus yumurta özü sistemi çok yönlü bir biyokimyasal sistemi tha olduğunut Wnt sinyallemesinin çalışma mekanizması hem de Wnt yolunun küçük molekül modülatörlerinin tanımlanması için yolları çok sayıda kullanılabilir. Burada tarif edilen yöntem, biyokimyasal protein bozulması önemli bir rol oynayabileceği diğer sinyal yollarının uygulanabilir.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.
Acknowledgments
Biz yazının eleştirel okuma için Laurie Lee teşekkür ederiz. TWC bir Amerikan Kalp Derneği predoctoral Kardeşliği (12PRE6590007) tarafından desteklenmektedir. MRB Ulusal Kanser Enstitüsü eğitim bursu (T32 CA119925) tarafından desteklenmektedir. SSH Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01DK078640) tarafından desteklenmektedir. EL Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01GM081635 ve R01GM103926) tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) | ProSpec | hor-272-A | Reconstituted with distilled water before use. |
| Human chorionic gonadotropin | Sigma | CG10-10VL | |
| Potassium chloride | Fisher | BP366-1 | |
| Sodium chloride | Research Products International | S23020-5000.0 | |
| Magnesium chloride | Fisher | BP214-500 | |
| Calcium chloride | Acros Organics | AC42352-5000 | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Cysteine | Acros Organics | AC17360-1000 | |
| Leupeptin | Sigma | L2884-10MG | |
| Aprotinin | Sigma | A1153-10MG | |
| Pepstatin | Sigma | P4265-5MG | |
| Cytochalasin B | Sigma | C8273-10MG | |
| 3 ml syringe: Luer Lock tip | Becton Dickinson | 309657 | |
| 27 G needle | Becton Dickinson | 305109 | |
| 96 well solid white polystyrene microplate, round bottomed | Corning | 3605 | |
| Steady-Glo luciferase assay system | Promega | E2520 | Store long-term at -80 °C, can store for up to 1 month at -20 °C |
| TNT Sp6 coupled reticulocyte lysate system | Promega | L4600 | |
| TNT Sp6 high-yield wheat germ protein expression system | Promega | L3260 | Generally higher yield than reticulocyte lysate |
| EasyTag Express protein labeling mix [S35] | Perkin Elmer | NEG772007MC | |
| Creatine phosphate | Sigma | 27920-5G | |
| ATP | Sigma | A2383-5G | |
| Creatine phosphokinase | Sigma | C3755-35KU | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418-50ML | |
| Dual-Glo luciferase assay system | Promega | E2920 | Same storage conditions as Steady-Glo |
| 50 ml Centrifuge tubes | Fisher Scientific | 0556214D | |
| Sorvall SS-34 fixed angle rotor | Thermo Scientific | 28020 | |
| 115 V 50/60 Hz Minicentrifuge | Fisher Scientific | 05-090-128 | |
| mMessage mMachine Sp6 kit | Ambion | AM1340 | |
| Anti-firefly luciferase antibody | Abcam | ab16466 | |
| Anti-GSK3 antibody | BD Transduction Laboratories | 610201 | |
| FLUOStar Optima | BMG Labtech | ||
| Sorvall RC-6 Plus centrifuge | Thermo Scientific | ||
| 16 °C Incubator | Percival Scientific |
References
- Glotzer, M., Murray, A. W., Kirschner, M. W. Cyclin is degraded by the ubiquitin pathway. Nature. 349, 132-138 (1991).
- Salic, A., Lee, E., Mayer, L., Kirschner, M. W. Control of beta-catenin stability: reconstitution of the cytoplasmic steps of the wnt pathway in Xenopus egg extracts. Molecular Cell. 5, 523-532 (2000).
- Murray, A. W. Cell cycle extracts. Methods in cell biology. 36, 581-605 (1991).
- Dabauvalle, M. C., Scheer, U. Assembly of nuclear pore complexes in Xenopus egg extract. Biology of the cell / under the auspices of the European Cell Biology Organization. 72, 25-29 (1991).
- Tutter, A. V., Walter, J. C. Chromosomal DNA replication in a soluble cell-free system derived from Xenopus eggs. Methods Mol Biol. 322, 121-137 (2006).
- Theriot, J. A., Rosenblatt, J., Portnoy, D. A., Goldschmidt-Clermont, P. J., Mitchison, T. J. Involvement of profilin in the actin-based motility of L. monocytogenes in cells and in cell-free extracts. Cell. 76, 505-517 (1994).
- Maresca, T. J., Heald, R. Methods for studying spindle assembly and chromosome condensation in Xenopus egg extracts. Methods Mol Biol. 322, 459-474 (2006).
- Shennan, K. I. Xenopus egg extracts: a model system to study proprotein convertases. Methods Mol Biol. 322, 199-212 (2006).
- Kornbluth, S., Yang, J., Powers, M. Analysis of the cell cycle using Xenopus egg extracts. Current protocols in cell biology / editorial board, Juan S. Bonifacino ... [et al.]. 11, (2006).
- Chan, R. C., Forbes, D. I. In vitro study of nuclear assembly and nuclear import using Xenopus egg extracts. Methods Mol Biol. 322, 289-300 (2006).
- Masui, Y., Markert, C. L. Cytoplasmic control of nuclear behavior during meiotic maturation of frog oocytes. The Journal of experimental zoology. 177, 129-145 (1971).
- Forbes, D. J., Kirschner, M. W., Newport, J. W. Spontaneous formation of nucleus-like structures around bacteriophage DNA microinjected into Xenopus eggs. Cell. 34, 13-23 (1983).
- Lohka, M. J., Masui, Y. Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components. Science. 220, 719-721 (1983).
- Newport, J. W., Kirschner, M. W. Regulation of the cell cycle during early Xenopus development. Cell. 37, 731-742 (1984).
- Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312, 237-242 (1984).
- Blow, J. J., Laskey, R. A. Initiation of DNA replication in nuclei and purified DNA by a cell-free extract of Xenopus eggs. Cell. 47, 577-587 (1986).
- Verma, R., et al. Ubistatins inhibit proteasome-dependent degradation by binding the ubiquitin chain. Science. 306, 117-120 (2004).
- Yu, H., King, R. W., Peters, J. M., Kirschner, M. W. Identification of a novel ubiquitin-conjugating enzyme involved in mitotic cyclin degradation. Curr Biol. 6, 455-466 (1996).
- Thorne, C. A., et al. Small-molecule inhibition of Wnt signaling through activation of casein kinase 1alpha. Nature Chemical Biology. 6, 829-836 (2010).
- Thorne, C. A., et al. A biochemical screen for identification of small-molecule regulators of the Wnt pathway using Xenopus egg extracts. Journal of Biomolecular Screening. 16, 995-1006 (2011).
- Hinkson, I. V., Elias, J. E. The dynamic state of protein turnover: It's about time. Trends in Cell Biology. 21, 293-303 (2011).
- Kinzler, K. W., Vogelstein, B. Lessons from Hereditary Colorectal Cancer. Cell. 87, 159-170 (1996).
- Lee, E., Salic, A., Kirschner, M. W. Physiological regulation of [beta]-catenin stability by Tcf3 and CK1epsilon. J Cell Biol. 154, 983-993 (2001).
- Lee, E., Salic, A., Krüger, R., Heinrich, R., Kirschner, M. W. The roles of APC and Axin derived from experimental and theoretical analysis of the Wnt pathway. PLoS Biology. 1, (2003).
- Seeling, J. M., et al. Regulation of beta-catenin signaling by the B56 subunit of protein phosphatase 2A. Science. 283, 2089-2091 (1999).
- Guger, K. A., Gumbiner, B. M. beta-Catenin has Wnt-like activity and mimics the Nieuwkoop signaling center in Xenopus dorsal-ventral patterning. Dev Biol. 172, 115-125 (1995).
- Cselenyi, C. S., et al. LRP6 transduces a canonical Wnt signal independently of Axin degradation by inhibiting GSK3's phosphorylation of β-catenin. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 8032-8037 (2008).
- Jernigan, K. K., et al. Gbetagamma activates GSK3 to promote LRP6-mediated beta-catenin transcriptional activity. Science Signaling. 3, (2010).
- Major, M. B., et al. Wilms tumor suppressor WTX negatively regulates WNT/beta-catenin signaling. Science. 316, 1043-1046 (2007).
- Cross, M. K., Powers, M. Obtaining eggs from Xenopus laevis females. J Vis Exp. , (2008).
- Cross, M. K., Powers, M. Preparation and fractionation of Xenopus laevis egg extracts. J Vis Exp. , (2008).
- Willis, J., DeStephanis, D., Patel, Y., Gowda, V., Yan, S. Study of the DNA damage checkpoint using Xenopus egg extracts. J Vis Exp. , (2012).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus Laevis : A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
- Rubinfeld, B., et al. Binding of GSK3β to the APC-β-Catenin Complex and Regulation of Complex Assembly. Science. 272, 1023-1026 (1996).
- Salic, A., King, R. W. Identifying small molecule inhibitors of the ubiquitin-proteasome pathway in Xenopus egg extracts. Methods in Enzymology. 399, 567-585 (2005).
- Trinkle-Mulcahy, L., et al. Identifying specific protein interaction partners using quantitative mass spectrometry and bead proteomes. J Cell Biol. 183, 223-239 (2008).
- Tan, C. W., et al. Wnt signalling pathway parameters for mammalian cells. PLoS One. 7, (2012).
