Summary
La presencia de VPH de alto riesgo en el tejido del tumor de cabeza y cuello se asocia con resultados favorables. El ARN recientemente desarrollada en la técnica de hibridación in situ llamado RNAscope permite la visualización directa de HPV E6/E7 mRNA en secciones de tejido FFPE.
Abstract
El "patrón oro" para la detección del VPH oncogénico es la demostración de transcripcionalmente activo VPH de alto riesgo en el tejido tumoral. Sin embargo, la detección de E6/E7 mRNA de la polimerasa con transcripción inversa reacción en cadena cuantitativa (QRT-PCR) requiere la extracción de RNA que destruye el tejido tumoral contexto crítico para la correlación morfológica y ha sido difícil de adoptar en la práctica clínica habitual. Nuestro ARN desarrollado recientemente en la tecnología de hibridación in situ, RNAscope, permite la visualización directa de ARN en, (FFPE) tejido incluido en parafina fijado en formol con una sola molécula sensibilidad y la resolución de una sola célula, que permite alta sensibilidad y especificidad en el análisis in situ de cualquier biomarcador de ARN en muestras clínicas de rutina. El ensayo RNAscope VPH fue diseñado para detectar el ARNm E6/E7 de siete genotipos de VPH de alto riesgo (VPH 16, 18, 31, 33, 35, 52 y 58), utilizando un pool de sondas específicas del genotipo. Se ha demostrado una excelente sensibilidady especificidad contra el método actual "estándar de oro" de la detección de E6/E7 mRNA por QRT-PCR. Estado de VPH determinado por RNAscope es fuertemente pronóstico de resultado clínico en pacientes con cáncer de la orofaringe.
Introduction
La infección por virus del papiloma humano de alto riesgo (VPH-AR) representa aproximadamente el 5% de todos los cánceres en todo el mundo 1. La incidencia de cáncer de orofaringe asociados al VPH ha aumentado durante las últimas décadas, especialmente entre los hombres. Orofaríngea carcinoma de células escamosas del VPH-positivo (OPSCC) probablemente constituirá una mayoría de todos los cánceres de cabeza y cuello en los Estados Unidos en los próximos 20 años 2. Los carcinomas de células escamosas de la orofaringe causadas por el VPH se asocian con una supervivencia favorable, y el estado de VPH del tumor es un factor pronóstico independiente y fuerte para la supervivencia 3.
Evidencia para la activación transcripcional de los oncogenes virales E6 y E7 se considera como el estándar de oro para la presencia de VPH clínicamente relevante 4. Sin embargo, la detección de ARNm de E6/E7 de tejido tumoral fresco por la técnica de RT-PCR no es práctico en la práctica clínica de rutina y se ha limitado a los laboratorios de investigación. Recientemente, have desarrollado una nueva tecnología llamada ARN ISH RNAscope, que permite la detección múltiple en células individuales con una sola molécula de ARN sensibilidad en formalina parafina fijo muestras de tejido embebidos (FFPE) 5-10. Hemos proporcionado tres líneas de evidencia para la molécula de detección único 5. En primer lugar, el diseño y la señal del sistema de la sonda de amplificación RNAscope permitió la detección de copia única HER2 objetivos de ADN genómico en células HeLa y SK-BR-3 líneas celulares. En segundo lugar, cuando se compara con las señales de ADN genómico HER2, la distribución de las intensidades fluorescentes de puntos de señal de HER2 de mRNA en células HeLa fue consistente con una molécula por punto. En tercer lugar, el número de puntos de señal de ARNm de HER2 por célula coincide estrechamente el número de copias de ARNm de HER2 estimado mediante un ensayo de cuantificación basado en solución, más el apoyo detección de moléculas individuales. Además, counterstaining de núcleos con DAPI en microscopía fluorescente o con hematoxilina en microscopía de campo claro permite la visualización de los núcleos individuales, quICH a su vez permite la detección y cuantificación de dianas de ARN en una base de una sola célula 10. La capacidad de analizar la expresión génica in situ en muestras clínicas de rutina hace RNAscope una plataforma prometedora para la patología de diagnóstico, especialmente aquellos a base de sección-ensayos de tejidos FFPE 10,11. Hemos desarrollado un ensayo basado VPH-RNAscope para detectar ARNm de E6/E7 de siete genotipos de VPH de alto riesgo (HPV16, 18, 31, 33, 35, 52, y 58) utilizando un grupo de sondas específicas del genotipo. Nuestros estudios recientes en OPSCC han demostrado que el ensayo RNAscope VPH es altamente sensible y específica para determinar la condición del VPH en los tejidos FFPE 12-17, y también informa el pronóstico en OPSCC 12,16.
El principio de la tecnología RNAscope se ha descrito previamente 5. Aquí se describe el protocolo de ensayo RNAscope completa y demostrar su uso en la detección de VPH-AR en FFPE secciones de tejidos tumorales.
Protocol
1. Muestra, Equipo y Preparación de los reactivos
- Cortar muestra de tejido en bloques de 3-4 mm de espesor, fijar en el 10% formalina tamponada neutra fresco para 16-32 horas a temperatura ambiente (25 ° C) e incrustar en parafina. Cortar FFPE en secciones de 5 ± 1 m de espesor de FFPE bloques, montar secciones sobre portaobjetos y secar al aire. Nota: Las diapositivas se pueden almacenar a temperatura ambiente en la desecación durante un máximo de 3 meses. Los portaobjetos de tejidos montados deben ser horneados en un lugar seco sobre a 60 ° C durante 1 hora antes del ensayo RNAscope.
- Traiga horno de hibridación a 40 ° C. Coloque un papel de humidificación en la bandeja del control de la humedad. Añadir 50 ml de dH2O al Libro de humidificación para mojar completamente. Inserte la bandeja cubierto en el horno para precalentar durante al menos 30 minutos antes de su uso.
- Hacer 700 ml 1x Pretreat 2 Solución (10 nl, pH 6 tampón citrato) diluyendo 10 veces la solución de pretratamiento en dH 2 O. Calentar el 1x Pretreat 2 Solución a hervir y maintain la temperatura entre 100-104 ° C, mientras que la prevención de sobre-ebullición.
- Hacer 3 L 1x tampón de lavado (0,1 x SSC) diluyendo precalentado 50x tampón de lavado en dH 2 O.
- Prepare 2 x 200 ml de xileno y 2 x 200 ml de EtOH al 100% para desparafinización bajo una campana de humos.
- Preparar 50% de solución de tinción de hematoxilina-reactivo azulado (0,01% de agua amoníaco) para el post-tinción bajo una campana de humos.
- Preparar 200 ml de xileno, 200 ml de 70%, y 2 x 200 ml de EtOH al 100% para la deshidratación bajo una campana de humos.
- Sondas Precaliente objetivo a 40 ° C durante 10 min y traen Detección RTU reactivo kit a temperatura ambiente, incluida la RTU Amp1, Amp2, Amp3, AMP4, Amp 5-Brown, y Amp6-Brown, excepto DAB cromógeno Brown-A y Brown-B .
2. RNAscope Ensayo
Desparafinización y Deshidratación
Después de la cocción, Desparafinar secciones de tejido en xileno durante 2 x 5 minutos con agitación frecuente y deshidrataren EtOH al 100% para 2 x 3 min con agitación frecuente. Secar al aire durante 5 min y dibujar una barrera hidrófoba alrededor de la sección de tejido con una barrera hidrófoba de la pluma.
Pretratamientos
- Incubar las secciones de tejido con 1 Trate previamente durante 10 min a TA durante la extinción de la actividad de la peroxidasa endógena, enjuague en dH2O
- Incubar las secciones de tejido con Pretrate 2 mantiene a una temperatura de ebullición durante 15 min para la recuperación de ARN, enjuague dos veces en dH 2 O.
- Incubar las secciones de tejido con 3 Trate previamente durante 30 min a 40 ° C durante la digestión de proteínas en el horno HybEZ, enjuague dos veces en dH 2 O.
Destino de la sonda de hibridación
Sondas diana de VPH-HR 7 de la piscina se incluyen: HPV 16, 18, 31, 33, 35, 52, y 58. Añadir sondas de VPH, la ubiquitina C (UBC) y bacterianas sondas dapB gen por separado en tres secciones de tejido adyacente. Hibridar a 40 º C en el horno durante 2hr, luego enjuague en tampón de lavado 1X para 2 x 2 minutos a temperatura ambiente.
Amplificación de Señal
- Incubar las secciones de tejido con Amp1 (preamplificador) durante 30 min a 40 ° C, Amp2 (fondo reductor) durante 15 min a 40 ° C, Amp3 (amplificador) durante 30 min a 40 ° C, y AMP4 (sonda marcadora) durante 15 min a 40 ° C en horno HybEZ. Después de cada etapa de hibridación, enjuague en tampón de lavado 1X para 2 x 2 minutos a temperatura ambiente.
- Incubar las secciones de tejido con AMP5 durante 30 min y Amp6 durante 15 min a TA. Después de cada paso de incubación, lavar en tampón de lavado 1X para 2 x 2 minutos a temperatura ambiente.
Detección de la señal
Incubar las secciones de tejido con 01:01 DAB mezcla mediante la mezcla de un volumen igual de Brown-A y de Brown-B durante 10 min a TA, enjuague dos veces en dH 2 O.
Contratinción
Montaje de diapositivas
Deshidratar secciones de tejido en 70%, 100%, y 100% de EtOH durante 2 min cada uno, xileno durante 5 min, montar con los medios de montaje a base de xileno.
Representative Results
RNAscope VPH flujo de trabajo de ensayo
El ensayo RNAscope tiene un flujo de trabajo altamente optimizada que es similar a la IHC (Figura 1). Se compone de cuatro pasos principales: pretratamientos, hibridación, amplificaciones de señal y detección. Emplea una estrategia de diseño de la sonda única que garantiza la amplificación de la señal de alta fidelidad 5. En el ensayo de RNAscope VPH, los siete conjuntos de sonda HR-HPV se agruparon, todo reconocido por el mismo sistema de amplificación de la señal ligada a peroxidasa de rábano picante (HRP). Las señales específicas de hibridación se detectan en forma de precipitados marrones formados por reacción catalizada con HRP cromogénico utilizando DAB como sustrato, que puede ser visualizado fácilmente por microscopía de campo brillante estándar.
Tinción Representante para la detección del VPH
La figura 2 muestra imágenes de ejemplo de las secciones FFPE manchadas de cabeza y cuello, carcinoma de células escamosas. En el caso del VPH-positivo (Fig.2A URE), las sondas de HR-HPV detectan señales puntiformes fuertes específicamente en las células tumorales. La sonda de la UBC detecta numerosas señales citoplasmáticas puntiformes en ambas células tumorales y las células del estroma (Figura 2B). La sonda dapB gen bacteriano demostró un fondo limpio (Figura 2 C). En el caso del VPH negativa, tanto la sonda de HR-HPV y la sonda dapB detectan señales (Figuras 2D y 2F), mientras que las señales fuertes se detectaron utilizando la sonda UBC (Figura 2E). En este ensayo, la UBC sirve como control positivo para evaluar la calidad del ARN de tejidos y dapB como control negativo para las señales de fondo. La puntuación para la determinación de la condición de VPH implica el examen de los tres toboganes para cada caso. El nivel de tinción en el portaobjetos de control negativo (dapB) deslizante se utiliza como punto de corte: positividad del VPH se define por la presencia de citoplasmática puntiforme y / o tinción nuclear que estaba por encima de la señal en la diapositiva dabpB.
Figura 1. Diagrama de flujo del ensayo RNAscope. Ilustración de RNAscope flujo de trabajo del ensayo. El ensayo RNAscope contiene 4 pasos principales, tratamientos previos, la hibridación sonda blanco, la amplificación de la señal y detección de señal. El procedimiento de ensayo se puede completar en 8 horas. Haz clic aquí para ver la imagen más grande.
Figura 2. Imágenes de ejemplo de portaobjetos teñidos-RNAscope. FFPE secciones teñidas con sondas para HR-HPV, UBC (control positivo) y dapB (control negativo)a partir de dos casos CECC. AC. Caso del VPH-positivo. A, HR-HPV E6/E7 mRNA expresión en las células tumorales. Inserción, 40x para mostrar señales puntiformes. B y C) las secciones de tejido adyacentes muestran una tinción positiva UBC (B) y negativo para dapB (C), respectivamente. DF) case-VPH negativo. D) ninguna tinción para HPV E6/E7 mRNA , similar a la del control negativo dapB (F). E) UBC tinción positiva. Haz clic aquí para ver la imagen más grande.
Discussion
El ensayo RNAscope HPV permite la visualización directa de E6/E7 mRNA in situ en la cabeza asociado al VPH y cuello, carcinoma de células escamosas. El ensayo RNAscope es totalmente compatible con el tejido tumoral fijo rutinariamente y conserva la morfología del tejido para las correlaciones histopatológicas (Figura 2). Una ventaja clave del ensayo RNAscope sobre los métodos convencionales de CISH es que amplifica específicamente las señales de hibridación (Figuras 2B y 2E) sin amplificar el ruido de fondo (figuras 2C y 2F).
En la práctica, el procedimiento de ensayo RNAscope VPH se puede completar en 8 horas o convenientemente dividido en dos días. El ensayo RNAscope VPH se ha utilizado para determinar el estado de VPH en la cabeza y el cuello carcinoma de células escamosas de 12-16, lo que demuestra el 97% de sensibilidad y 93% de especificidad mediante QRT-PCR como método de referencia 16. Chr ConvencionalISH omogenic para HR-HPV ADN es altamente específica, pero tiene una sensibilidad del 80% ~ 12. Inmunohistoquímica (IHC) para la tinción celular p16 marcador sustituto demuestra una excelente sensibilidad, pero puede generar falsos positivos 15,18, especialmente en cabeza y cuello nonoropharyngeal 15. El método actual "estándar de oro" de QRT-PCR para VPH E6/E7 mRNA detección requiere tejido fresco congelado para obtener resultados óptimos y es técnicamente compleja, lo que limita su uso para el laboratorio de investigación solamente. Además, se requiere la extracción de RNA que hace imposible correlacionar HR-HPV E6/E7 expresión de ARNm con la histopatología.
Existen varios factores críticos para el éxito del ensayo RNAscope. En primer lugar, para obtener mejores resultados, los tejidos deben ser fijadas en 10% formalina tamponada neutra fresco a temperatura ambiente durante 16 a 32 horas según las directrices de la ASCO / CAP 19. En segundo lugar, el horno HybEZ es muy recomendable, ya que permites control óptimo de la temperatura y la humedad para la hibridación de la sonda y etapas de amplificación de señal. En tercer lugar, es importante eliminar el exceso de tampones residuales antes de cada paso, pero aún así mantener la sección de tejido de secado durante cualquiera de estos pasos.
El procedimiento RNAscope manual descrito aquí ha sido totalmente automatizada en un portaobjetos de sistema de auto-tinción comercial 10. Esto debería facilitar en gran medida la normalización de las condiciones de ensayo y ahorro en su valioso trabajo manual en los laboratorios de patología clínica. Además, el software de análisis de imágenes dedicada ha sido desarrollado 10 para identificar automáticamente las células y señales de tinción en una diapositiva digitalizada, lo que debería ayudar a eliminar la subjetividad y mejorar la reproducibilidad en la puntuación.
En resumen, el ensayo RNAscope VPH detecta la presencia de transcritos de HR-HPV E6/E7 mRNA in situ en tejidos FFPE. Tiene un flujo de trabajo que es familiar para laboratorios de patología clínicarios al permitir la visualización directa de éstos en secciones de tejido. Ofrece una plataforma ideal para el examen (FFPE) muestras de tejido, y puede ser fácilmente adoptada por los laboratorios de diagnóstico de patología.
Disclosures
Todos los autores son empleados de acciones propias y en los diagnósticos avanzados celulares, Inc.
Acknowledgments
Apoyado en parte por subvención NIH (R43/44CA122444) y subvención DOD BRCP (W81XWH-06-1-0682) para YL.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SuperFrost Plus slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| HybEZ Oven, Tray, and Rack | Advanced Cell Diagnostics | 310011, 310012, 310014 | |
| RNAscope 2.0 FFPE Reagent Kit - Brown | Advanced Cell Diagnostics | 310035 | |
| RNAscope HPV-HR7 Probe for HPV 16, 18, 31, 33, 35, 52, and 58, E6/E7 mRNA | Advanced Cell Diagnostics | 312351 | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratory | H-4000 | |
| 100% EtOH | American Master Tech Scientific | ALREAGAL | |
| Xylene | Fisher Scientific | X3P-1GAL | |
| Gill's Hematoxylin I | American Master Tech Scientific | HXGHE1LT | |
| Ammonia hydroxide | Sigma-Aldrich | 320145-500mL | |
| Cover Glass 24 mm x 50 mm | Fisher Scientific | 12-545-F | |
| Hot Plate | Fisher Scientific | 11-300-49SHP | |
| Drying Oven | Capable of holding temperature at 60±1 °C | ||
| Water Bath | Capable of holding temperature at 40±1 °C |
References
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