Summary
الأوعية الدموية هي مفتاح النهج في هندسة الأنسجة ناجحة. ولذلك، هناك حاجة إلى تقنيات موثوقة لتقييم تطوير شبكات الأوعية الدموية في الأنسجة يبني. هنا نقدم طريقة بسيطة وفعالة من حيث التكلفة لتصور وقياس الأوعية الدموية في الجسم الحي.
Abstract
يعتبر الأوعية الدموية كافية ليكون واحدا من العوامل الرئيسية التي تحد من النجاح السريري ليبني الأنسجة المهندسة. من أجل تقييم استراتيجيات جديدة تهدف إلى تحسين الأوعية الدموية، يطلب من وسائل موثوق بها لجعل في نمو أوعية دموية جديدة في السقالات الحيوية الاصطناعي مرئية وقياس النتائج. على مدى العامين الماضيين، وقد أدخلت مجموعتنا نموذجا عيب الجلد الكامل تمكن رؤية مباشرة من الأوعية الدموية التي تضوء ويوفر إمكانية القياس الكمي من خلال تجزئة الرقمية. في هذا النموذج، واحدة يخلق جراحيا عيوب البشرة الكاملة في الجزء الخلفي من الفئران ويحل لهم المواد التي تم اختبارها. ويمكن أيضا أن يدرج جزيئات أو خلايا من الاهتمام في هذه المواد لدراسة آثارها المحتملة. بعد وقت الملاحظة من اختيار المرء، وexplanted المواد للتقييم. توفر الجروح الثنائية إمكانية إجراء المقارنات الداخلية التقليل في القطع الأثرية بين الأفراد وكذلك انخفاض عدد الحيوانات اللازمة للدراسة. بالمقارنة مع المناهج الأخرى، أسلوبنا يقدم، تحليل الفعال بسيط يمكن الاعتماد عليها والتكلفة. قمنا بتنفيذ هذا النموذج كأداة روتينية لأداء عالية الدقة عند اختبار فحص الأوعية الدموية من المواد الحيوية المختلفة وتفعيل النهج الحيوي.
Introduction
في العقود الأخيرة، فتحت هندسة الأنسجة تصل خيار علاجي جديد ليحل محل عيوب الأنسجة مع خلايا الجسم نفسه 1. من أجل دعم العملية الفسيولوجية لتجديد الأنسجة، فقد تم تصميم السقالات كبنية قابلة للتحلل، التي توفر سيناريو حيث الخلايا من السرير الجرح يمكن أن تنمو واستعادة الخلل 2،3.
يعتبر الأوعية الدموية كافية لتكون العقبة الرئيسية التي تتولى إعادة اختراق السريري السقالات bioartificial 4. مع نشوب الخلايا، فإن الطلب على المواد الغذائية وزيادة الأكسجين والأوعية الدموية من المواد يصبح أساسيا. بالتالي يمكن عدم كفاية أو تأخير الأوعية الدموية يؤدي إلى نخر المركزي للمنتجات الأنسجة المهندسة 5. بالإضافة إلى ذلك، توفر خلايا الأوعية الدموية المختصة المناعة وإزالة المخلفات الأيضية في منطقة تجديد. معدلات الإصابة العالية والمنخفضة ليست سوى تجديدبعض من مغبة عدم كفاية التروية الدموية لوحظ في هندسة الأنسجة، والتي تهدف إلى تجنبها من خلال زيادة الأوعية الدموية من السقالات 6،7.
العديد من الاستراتيجيات التي تهدف إلى تحسين الأوعية الدموية التركيز على الدور الرئيسي للمادة بيولوجية نفسها والمجهرية من السقالة. هناك جهود بحثية مكثفة لتطوير مناهج جديدة في تحويل عملية الشفاء من إصلاح إلى تجديد، وبالتالي (إعادة) توليد الأنسجة مع أقرب الخصائص الفسيولوجية للواحد لاستعادة 8،9. وتضمنت المواد الحيوية التي تم دراستها وتقييمها فيما يتعلق إمكاناتهم التجدد الكولاجين، الفيبرين، الشيتوزان والجينات 10،11. هذه المواد الحيوية يمكن استخدامها ودمجها باعتبارها العمود الفقري لبناء السقالات جديدة باستخدام استراتيجيات مختلفة مثل decellularization الأنسجة، والتجميع الذاتي، النماذج الأولية السريعة وelectrospinning 12. من أجل ENHتعصب قدرة الجسم على التجدد الخاصة، يمكن bioactivated السقالات. إدراج النمو عائية المؤتلف 13 أو عوامل الجينات ناقلات ترميز لهذه العوامل فقد أظهرت 14 إلى تحسين الأوعية الدموية من السقالة. استخدام الخلايا الجذعية على نطاق واسع وقد تبين أن تكون استراتيجية واعدة لتحسين الأوعية الدموية، حيث اكتسبت خلايا انسجة الوسيطة والخلايا البطانية السلف بأكبر قدر من الاهتمام 15،16. مناهج أخرى تحاول بناء بنيات التي تحتوي على شبكات سفينة الجاهزة المسبقة لزرع 17. على الرغم من الجهود المكثفة في تصميم سقالة والتنشيط الحيوي، وتوجد استراتيجية تحسنت الأوعية الدموية على مستوى كبير سريريا، وباستثناء استبدال الجلد في حروق هائلة، وترجمة مواد الهندسة البيولوجية في روتين السريرية يجري فقط بتردد 18 .
واحد من الأسباب التي تجعل الأوعية الدمويةمن يبني أنسجة اصطناعية لا يزال مشكلة لم تحل بعد، هو صعوبة لتقييم مدى نجاح تكنولوجيات جديدة في النهج في الجسم الحي. على الرغم من أن التجارب في المختبر يمكن أن توفر معلومات هامة من إمكانات الأوعية الدموية السقالات، يطلب من النماذج الحيوانية المناسبة لدراسة المعايير الأساسية مثل توافق مع الحياة من المواد، وسلامة وفعالية العلاج و، أهمية خاصة، والأوعية الدموية في الأنسجة بناء. لذا، أدوات موثوقة لتصور وقياس شبكات الأوعية الدموية في الجسم الحي ضرورية.
في هذه الدراسة نقدم طريقة بسيطة وموثوق بها التي تسمح التصور وتقدير من شبكة الأوعية الدموية داخل السقالات explanted. ويستند هذا الأسلوب على تضوء الأنسجة وتجزئة الرقمية. لأن هذا الأسلوب هو غير الغازية، لأنها تتيح المزيد من التحليلات الجزيئية والنسيجية من المواد المستهدفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد السقالات
- توليد عينات من السقالات باستخدام 12 ملم اللكمات الخزعة.
- لإدخال الجزيئات النشطة بيولوجيا أو الخلايا في السقالة، واستنزاف السقالات طريق الضغط عليها بلطف مع شاش معقم. ثم ترطيب السقالات من خلال إضافة 160 ميكرولتر من محلول يحتوي على جزيئات الحيوية النشطة أو خلايا الفائدة. انقر نقرا مزدوجا تحقق نجاح التنشيط الحيوي مع الخلايا من خلال فحوصات الأيض مثل MTT فحوصات.
- إذا لزم الأمر، إصلاح المركبات أو الخلايا لفحصها داخل سقالة من خلال تقديم لهم، على سبيل المثال في حل الليفين-الثرومبين أو هيدروجيل، مرة أخرى من خلال معالجة الجفاف كما هو موضح في الخطوة 1.2.
ملاحظة: هذه الخطوة يمكن أن يكون من المفيد عند المركبات أو خلايا لا نعلق ميكانيكيا لهذه المادة. يمكن للمرء أيضا التحكم في ديناميات الافراج عن المركبات .. - إعداد تنسجم titanized، والتي سيتم وضعها تحت كل سقالة في كل مجموعة التجربة والسيطرة، من خلال cuttinز من جولة على شكل قطعة، وحوالي 14 ملم في القطر.
ملاحظة: شبكة titanized يعمل الحدود المادية اللازمة لتحديد الأنسجة مجدد من السرير الجرح.
2. الحيوانات
- قبل تنفيذ النموذج المقدم، راجع قوانين حماية الحيوان المقابلة والحصول على إذن من السلطات المحلية. في هذا العمل، أجريت جميع التجارب على الفئران، وفقا للقانون الألماني الرفق بالحيوان الحالي وافقت عليها حكومة مقاطعة بافاريا العليا (Regierung فون Oberbayern).
- تختار بعناية الحيوان والتوتر. وعلى الرغم من تأسيس نموذج للفئران، ويمكن ترجمتها إلى الحيوانات الأخرى الشائعة، مثل الفئران والأرانب أو الخنازير.
- في حال كنت تعمل مع الحيوانات مفرى، حلاقة الجزء الخلفي من الحيوانات قبل زرع السقالات.
ملاحظة: يستخدم هذا العمل الفئران من 6 إلى 8 أسابيع من العمر مع وزن الجسم بين 20 غراما و 25 غراما، لكن الأعمار المختلفة وبويمكن أيضا أن تستخدم الأوزان ODY.
3. التخدير
- إجراء العملية تحت ظروف معقمة. من أجل الحفاظ على درجة حرارة الجسم الطبيعية للحيوان، واستخدام حصيرة الاحترار.
- قبل inhalative تخدير الحيوانات تتلقى Buprenorphin بجرعة 0،05 حتي 0،1 ملغ / كغ من وزن الجسم، تحت الجلد كل ساعة 8.
- وضع الحيوان تحت التخدير inhalative (الأيزوفلورين) أو تطبيق الإجراءات يماثلها. تأكيد التخدير إما عن طريق الضغط بلطف أصابع الحيوان أو عن طريق قرصة الجلد.
- لمنع exsiccosis، حقن 0.5 مل تحت الجلد محلول ملحي فيزيولوجي في بداية العملية.
4. استئصال الجلد
- وضع الحيوان في وضعية الرقود وعلامة خط الوسط من الخلف الماوس مع تلميح غرامة القلم دائم (الشكل 1A).
- تحديد منطقة الختان. وضع العيوب في المنطقة الموضحة في فيقوإعادة 1C. لاحظ أنه إذا وضعت العيوب نحو caudally جدا، الحيوانات أكثر عرضة لإزالة الضمادات والسقالات.
- خلق جولة عيوب الثنائية باستخدام 10 ملم خزعة لكمة (الشكل 1B). لكمة يجب أن يجبر بعناية على الجلد ويجب عدم استخدامها لقطع تماما من خلال الجلد، ولكن لتحديد منطقة الختان (أرقام 1C و 1E).
- رفع بلطف الجلد ملحوظ مع ملقط وشق على طول دائرة ملحوظة باستخدام مقص الجراحية الدقيقة (الشكل 1F). في حالة النزيف، ضغط بعناية بشاش معقم. ويرد وصف خطوة بخطوة من الختان في الشكل 1.
ملاحظة: يتم إنشاء عيب مع لكمة أصغر من واحد لتوليد السقالات، لتعويض توسيع الخلل نظرا لمرونة الجلد.
5. سقالة زرع
- من أجل جعل الفضاء لتيتاالمفلكن عيون، تمديد الفصل بين الجلد والأنسجة الكامنة عند حدود الجرح لمدة 2-4 مم (الشكل 2A).
- وضع titanized مش عيب في مباشرة على السرير الجرح وتحت حواف الجرح (أرقام 2A & B).
- مكان السقالات مباشرة عبر شبكة.
- خياطة السقالات على حواف الجرح المجاورة مع 4 إلى 6 عقدة واحدة، وترك حواف قليلا على سقالة (الشكل 2C).
ملاحظة: تجنب استخدام الخيوط الجراحية القابلة للتحلل. - خياطة الجرح شفافة خلع الملابس فوق العيوب لحماية السقالة بينما يسمح رصد منطقة الجرح (الشكل 2D).
6. بعد العملية الجراحية العناية
- إبقاء الماوس في قفص واحد لتجنب التلاعب المتبادل بين الملابس والسقالات.
- تقييم الحالة العامة للحيوان على أساس يومي من خلال مراقبة النشاط الحركي، ووزن الجسم، وعلامات الألم والتسامحلخلع الملابس والسيارات والتشويه. أيضا مراقبة منطقة الجرح لوقف نزيف والمحلية والنظامية علامات العدوى وموقف خلع الملابس.
- من أجل تقليل الألم للحيوان، وضخ Buprenorphin يوميا بجرعة 0،05 حتي 0،1 ملغ / كغ من وزن الجسم أو دواء مسكن ما يعادلها.
- إذا يزيل الماوس أو أضرار خلع الملابس الجرح، استبدال أو أعد تحت التخدير.
7. القتل الرحيم وExplantation من سقالة
- في نقاط الوقت المطلوب، التضحية الحيوانات عن طريق جرعات زائدة من بنتوباربيتال (150 ملغ / كلغ).
- بمناسبة موقع استئصال الجلد مع علامة دائمة، والتي ينبغي أن تشمل السقالات وأكبر قدر من الماوس مرة أخرى الجلد ممكن (الشكل 3A).
- شق الجلد على طول خطوط ملحوظ مع زوج من مقص أو مشرط. فصل الجلد بأكمله، بما في ذلك السقالات وشبكة titanized، من الأنسجة الكامنة من خلال إعداد حادة (فايجوري 3B).
- وضع الأنسجة explanted تفترش طبق بتري (الشكل 3C وD)
8. التصور النوعي والكمي لشبكة الأوعية الدموية
- تضوء:
- إعداد جهاز تضوء، من خلال تركيب طبق بتري فوق مصدرا قويا من الضوء الأبيض (100 وات لمبة ضوء قياسي).
- إصلاح كاميرا رقمية فوق نقل transilluminator للحصول على الصور الرقمية.
- وضع عينات رأسا على عقب على طبق بيتري على الجهاز تضوء.
- التقاط صور للالسقالات كاملة في وضع الماكرو وكذلك المناطق متساوية الحجم من الجلد الطبيعي. تخزين الصور في شكل TIFF لمزيد من التحليل الرقمي.
- حفظ الأنسجة لمزيد من التحليل الكيميائي الحيوي أو النسيجي.
- تجزئة الرقمية وتقدير:
- تحميل وتثبيت البرنامج VesSeg، أداة، التي يمكن الحصول عليها الابهه من تهمة في: http://www.isip.uni-luebeck.de/index.php؟id=150&L=2٪255 .
- فتح الصورة مع البرنامج VesSeg-أداة.
- حدد منطقة من الصورة عن طريق السقالة للتحليل الرقمي (صورة → حدد) مغطاة.
- لزيادة التباين السفن استخدام الخيار "العتبة التخلفية" (صورة → تعزيز السفينة مرشح → → العتبة التخلفية أعلى هات التحول → حساب تعزيز السفينة).
- المضي قدما في تقسيم الخريطة سفينة (الحدود → تعزيز صورة السفينة مرشح → → التخلفية العتبة عتبة). تحديد العتبة الأولى ("تغطية السفينة")، وذلك في كل بكسل، وهو ولو من بعيد تشبه الأوعية الدموية، كما سيتم تسمية السفينة. تحديد عتبة الثانية ("تغطية الخلفية")، وذلك فقط تلك بكسل التي هي خاصة الأوعية الدموية تشبه سيتم وصفها بأنها السفن.
- تحقق الاقتراح تجزئة التلقائي يدويا لإضافة السفن غير القبض والقضاء على الهياكل إيجابية كاذبة المشتركة، التي عادة ما تكون، هياكل تشبه سفينة طويلة ورقيقة مثل الشعر أو الغرز.
- حساب طول الأوعية والمساحة الكلية التي تغطيها سفن (إحصاءات صورة صورة → → إحصاءات صورة ثنائية).
ملاحظة: لحساب أطوال السفينة، وضعفت السفن في الناتج الخريطة السفينة إلى خطوط بعرض 20 بكسل واحد.
- تحليل منطقة الجلد الأصلي تحت نفس المعلمات كما السقالات وتحديد قيمة 100٪ للأنسجة الأم وربط السقالة إلى تلك القيمة. على سبيل المثال، إذا كانت نسبة بكسل البيضاء هي 60٪ في الأنسجة الطبيعية و 30٪ في السقالة، فإنه سيمثل الأوعية الدموية 50٪ من السقالة. ملاحظة: يتم تعيين تغطية السفن البيضاء إلى منطقة مربع حول السقالة. ضبط عدد البكسلات البيضاء consi تغطيةdering أن مساحة الدائرة هي أصغر بكثير (π خ R 2) من المربع (4 × R 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يمكن إنشاء موثوق الثنائي عيب الجلد الكامل في الماوس (الشكل 1) حيث يمكن استبدال الجلد بواسطة مادة بيولوجية قيد الدراسة (الشكل 2). هنا، لم يلاحظ أي تعقيدات كبيرة أثناء أو بعد إجراء الجراحة، لا علامات العيانية للعدوى أو رد فعل جسم غريب. في حالات نادرة، ويحصل على سقالة فقدت عندما ماوس يزيل ذلك. انكماش الجرح وحظ أبدا (الشكل 3). الأنسجة تضوء يسمح التصور الواضح للهياكل الأوعية الدموية تصل إلى 30 ميكرون في العرض، في عينة الأنسجة كلها التي شملت كلا، الأنسجة الأم والسقالات مزروع (الشكل 4). بعد تجزئة الرقمية والأوعية يمكن تقديرها بسهولة في الأوقات المطلوبة بعد انغراس الاجنة. على سبيل المثال، بعد 2 أسابيع الزرع، لوحظت مستويات الأوعية الدموية من 62.28 ± 8.6٪ (المتوسط ± الخطأ المعياري للمتوسط، ن = 8) 21. تماما، حوالي 25 دقيقة و# 160؛ لكل حيوان (2 السقالات) المطلوبة لغرس، 5 دقائق للحصاد الأنسجة وتصوير و10 دقيقة للتحليل الرقمي من عينة واحدة. وكنقطة أخيرة، وهذه الطريقة لا تؤثر على نوعية الأنسجة explanted لمزيد من التحليل. على سبيل المثال، والبروتينات ومقتطفات RNA يمكن الحصول عليها بسهولة من العينة بالطرق العادية.
يتم وضع علامة الرقم 1. عيب الجلد كامل. خط الوسط من الخلف الماوس مع تلميح القلم غرامة، ويستخدم لكمة خزعة لتحديد المنطقة وسيتم إنشاء عيب (A، B، C و D). مرة واحدة يتم تحديد المناطق، تتم إزالة الجلد الكامل مع مقص جراحي القياسية كما رأينا في الصورة عن قرب إعداد (E و F). وووأظهرت نتيجة إينال الخلل في (D) وتضخيم في (G). تمثل أشرطة النطاق 1 سم في ABCD و 5 مم في المجموعة المالية. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. زرع السقالة. المسبقة لزرع السقالة، يتم وضع شبكة في الخلل مباشرة على السرير الجرح وتحت حواف الجرح (A و B). يتم وضع السقالات القادمة خلال شبكة وخياطة على حواف الجرح (C). أخيرا، يتم وضع ضماد الجرح شفاف وتخاط على الجلد (D). يمثل شريط النطاق 5 ملم في (A، B، و C) و د 1 سم في (D). يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 3. الأنسجة explantation. لتحليل الأنسجة تتم إزالة الجلد الكامل من الجزء الخلفي من الحيوان جراحيا (A و B) وتفترش طبق بتري (C). لتضوء يتم تشغيل الجلد رأسا على عقب ويتم أخذ صورة رقمية (D). إزالة الجلد بجانب السقالات ضروري لتطبيع البيانات الأوعية الدموية. تمثل أشرطة النطاق 1 سم. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
ق = "jove_content" FO: المحافظة على together.within الصفحات = "دائما"> 
الرقم 4. تضوء، وتجزئة الرقمية والكمي. تم رفعه أنسجة الجلد وشبكة الأوعية الدموية داخل وتصور بواسطة تضوء (صور العليا) الجلد كامل من الظهر (A) والمناطق مفصلة من الجلد الأصلي (B) والسقالة (C وترد). وتشير السهام المناطق في تضخيم (B) و (C). كل واحد من أدنى صور تظهر نتائج عملية تجزئة الرقمية للصورة التي تقع مباشرة فوق. أشرطة النطاق تمثل 5 ملم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هناك حاجة إلى إنشاء النهج الناجحة في تحسين التروية الدموية في الأنسجة المهندسة ويبني، الذي يطالب تطوير طرق موثوقة جديدة لدراسة العمليات الحيوية داخل الأوعية الدموية. الطرق الشائعة لصنع سقالة الأوعية الدموية مرئية خارج الحي تشمل استخدام المجهر، والذي يوفر أداة عالية الدقة. في معظم الحالات، على الرغم من هذه الطريقة يقتصر على تحليل الأنسجة المناطق الصغيرة وتميل إلى أن تكون مكلفة وتستغرق وقتا طويلا. وعلاوة على ذلك، فإنه غالبا ما تشمل وضع العلامات تفصيلا وطرق تلوين، حيث لا يمكن تمييزها الأوعية الدموية perfused لمن هم غير وظيفية 22. الأساليب المستخدمة لتقييم وظائف الأوعية هي المقطعي المحوسب والتصوير بالرنين المغناطيسي والتصوير المقطعي بوزيترون الإلكترون. هذه الأساليب لديها عيوب معدات مكلفة للغاية ومنخفضة الدقة قوة 23. استراتيجية أخرى تستخدم عادة لتصور الأوعية الدموية هياستخدام الأوعية الدموية يلقي تليها التآكل الكيميائي للأنسجة 24. هذا الأسلوب يجعل من الممكن الحصول على هيكل 3D التمثيلي للشبكة الأوعية الدموية، ولكن النتائج تختلف بشدة حسب مستوى التروية والأنسجة الاصطناعية لا يمكن استخدامها لمزيد من الدراسات البيوكيميائية، مثل البروتين أو تحليل الحمض النووي الريبي. غشاء مشيمائي الدجاج (CAM) نموذج 25 ونموذج غرفة ثنية الجلد في القوارض 26،27 أظهرت أن أساليب فعالة لتحليل الأوعية الدموية، نضح الشعرية وتدفق الدم. في الآونة الأخيرة، كما تم استخدام نموذج غرفة ثنية الجلد لتطبيقات هندسة الأنسجة تقييم الاستراتيجيات القائمة على الأوعية الدموية MSC في السقالات البولي يوريثين مسامية 28. هذه الطرق مزايا هامة الحالية للتصوير في الجسم الحي وتمثل هدفا جذابا للأسلوب الموصوفة هنا.
تم تطوير النموذج المقدم هنا للتغلب على أوجه القصور في أساليب مentioned أعلاه. الاستفادة من الخصائص الجوهرية فريدة من الجلد، ويتم إنشاؤها العيوب كاملة واستخدامها لتقييم الأوعية الدموية من المواد الحيوية. الجلد هو الجهاز الخارجي، والذي يسمح أسهل التصور والتلاعب في الأنسجة. بسبب السطحية ومتجانس هيكلها كبير، عيوب متعددة يمكن إنشاء أي إجراء مقارنات الداخلية ممكن، في حين تناقص عدد الحيوانات اللازمة للدراسة. بسبب التماثل-انتيرو الخلفي من الحيوان، واقترح عيوب الثنائية، ولكن؛ ينبغي النظر في تأثير تأثيرات جهازية عند مقارنة كلا الجانبين لبعضهما البعض. أخيرا، والجلد هو الأنسجة شفافة إلى حد ما يمثل الجهاز الأمثل لاختيار لتضوء. على الرغم من أن الطريقة الموصوفة هنا هي مناسبة للعديد من أنسجة الأم مختلفة والعديد من المواد الحيوية، أنشئ هذا البروتوكول في الأصل لاستخدامه مع سقالة القائم على الكولاجين طبقة مزدوجة غير أن وافقت عليها الهيئة واستخدامها لدي سريرياإصلاح rmal. شرط مسبق هام لتنفيذ هذا الأسلوب هو أن السقالة يجب أن تكون شفافة جزئيا. اعتمادا على المواد سقالة المختار، قد يلزم بعض التكيف من البروتوكول. سابقا، وقد استخدمت مجموعتنا نموذج لبيان كيفية تطبيق خلايا اللحمة المتوسطة الإنسان السقالات يعزز الأوعية الدموية الخاصة 29.
كاميرا رقمية قياسية ومصدر الضوء كافية لتصور شبكة الأوعية الدموية، والتي يمكن قياسها كميا من خلال البرمجيات الحرة. تجزئة شبه من الصور من قبل VesSeg-أداة تتكون من خطوتين. في الخطوة الأولى، الصورة مأخوذة من شبكة الأوعية الدموية يؤدي إلى خريطة سفينة محسنة التباين. ثم، خوارزمية تجزئة تختار المناطق السفينة وأخيرا، يتم تقديم اقتراح تجزئة كصورة (الشكل 4) 30. في خطوة المعالجة الثانية، وذلك باستخدام حقيقة أن السفن ترتبط شارعuctures (بمعنى أن السفينة بكسل شنق معا مكانيا)، يتم استخدام تجزئة الثانية لتحديد من أول واحد فقط بكسل السفينة الحقيقية وكل بكسل السفينة الحقيقية. ولذلك، فإن التسمية النهائية من "واحد" تمنح فقط لأولئك انخفاض الثقة سفينة بكسل من الصورة الأولى التي ترتبط عبر سلسلة من الجيران إلى ارتفاع الثقة سفينة بكسل في الصورة الثانية.
منذ أي إضافات كيميائية ضرورية، وهذا الأسلوب هو أيضا فعالة من حيث التكلفة. ويظهر التحليل الرقمي لاستنساخ جيدة في تحديد أبعاد السفينة، مسافات داخل الأوعية الدموية، وعدد المتفرعة نقطة، منطقة أوعية دموية ويبلغ طول شبكة الأوعية الدموية. لقد أظهرنا سابقا أن شبكة الأوعية الدموية يمكن تصور أفضل عن طريق تضوء من خلال دراسات الراديو التصوير الوعائي 31. وجود شبكة تيتان لديه وظيفة مزدوجة. من جهة، ويمنع انكماش الجرح، الذي هو العيب الشائع استخدام الماوس مودلس. من ناحية أخرى، فإنه يوفر الحدود المادية بين سقالة والسرير الجرح. لأن معظم السقالات هي قابلة للتحلل، وظيفة الأخيرة المذكورة أمر بالغ الأهمية لdelimitate جسديا الحدود بين سقالة والسرير الجرح أثناء حصاد السقالات. من بين العوائق الرئيسية لهذه الطريقة هي حاجة شرحا السقالات وبالتالي كبح جماح التحليل الى نقطة واحدة مرة واحدة؛ وبالتالي مراقبة ديناميكية من الأوعية الدموية غير ممكن مع الإعداد الحالي. مشكلة أخرى هي أن هذا الأسلوب يقتصر على المواد الحيوية شبه شفافة تسمح تضوء. وأخيرا، على الرغم من أن إجراء العملية لا تتطلب مهارات جراحية خاصة، منحنى التعلم من حوالي 6 - 12 حيوانات تشغيلها يجب أن تعتبر لإتقان طريقة صحيح.
ونحن نقدم وقت ونهج فعالة من حيث التكلفة التي تسمح عالية الدقة تصور وتقدير هياكل الأوعية الدموية، صepresenting الأسلوب الأمثل لمقارنة الأوعية الدموية في المواد الحيوية المختلفة أو استراتيجيات مختلفة سقالة-التنشيط الحيوي. هذه الطريقة سهلة لإنشاء ولا يتطلب معدات خاصة. ومن السمات الرئيسية لهذا النموذج هي أنه بعد التصور السفينة، أنسجة يمكن استخدامها لمزيد من الدراسات مثل النسيجية أو التحليل الجزيئي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
تضارب المصالح بيان:
جميع المؤلفين: لا أحد
الإفصاحات المالية:
أي من الكتاب لديه مصلحة مالية في أي من المنتجات والأجهزة وأو المخدرات المذكورة في هذه المخطوطة.
Acknowledgments
وقدمت انتيغرا قالب الجلد تجديد تفضلت انتيغرا علوم الحياة مؤسسة. مصادر الأموال التي تدعم العمل: هذا العمل تم تمويله جزئيا من قبل جائزة CIRM-BMBF المبكر بالحركة الثانية ومركز FONDAP لتنظيم الجينوم على حد سواء لJTE (العدد 15090007).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethilon P-3 13 mm 3/8 circle 5-0 | Ethicon, Norderstedt, Germany | 698G | Ethilon polyamid-6 precision point-reverse cutting suture |
| Biopsy punches (10 mm) | Xiomedics, Acuderm inc., Fort Lauderdale, FL, USA | P1050 | |
| Biopsy punches (12 mm) | Xiomedics, Acuderm inc., Fort Lauderdale, FL, USA | P1250 | |
| Digital camera | Ricoh, Hannover, Germany | Cx1 | |
| Gazin Mullkompresse | Lohmann und Rauscher, Neuwied, Germany | 13622 | Sterile gauze (10 cm x 10 cm) |
| Double-layer collagen-based scaffold (8' x 10') | Integra Life Science Corporation, Plainsboro, NJ, USA | 88101 | |
| Isoflurane, liquid-gas for inhalative anesthesia | Baxter, Unterschleissheim, Germany | 100196040 | |
| Pentobarbital, 16 g / 100 ml | Fa. Merial, Hallbergmoos | ||
| Nuri Nu/Nu Nude mice, CrLNU-Foxn1nu | Charles River, Sulzfeld, Germany | Strain code 088 | Athymic nude mice, 6 to 8 weeks of age and with a body weight between 20 to 25 g |
| Buprenorphine (0.3 mg/ml) | Essex Pharma GmbH, Munich, Germany | ||
| Titanized mesh (15 cm x 15 cm), extralight | PFM Medical AG, Köln, Germany | 6000029 | |
| Tissucol Duo S Immuno 2 ml | Baxter Germany GmbH, Unterschleißheim, Germany | B1332020110614 | Fibrin-thrombin solution |
| Transparent adhesive drape (30.5 cm x 26 cm) | KCI Medical Products, Wimborne Dorset, UK | M6275009/10 |
References
- Rahaman, M. N., Mao, J. J. Stem cell-based composite tissue constructs for regenerative medicine. Biotechnology and Bioengineering. 91 (3), 261-284 (2005).
- Lutolf, M. P., Hubbell, J. A. Synthetic biomaterials as instructive extracellular microenvironments for morphogenesis in tissue engineering. Nature Biotechnology. 23, 47-55 (2005).
- Machens, H. G., Berger, A. C., Mailaender, P. Bioartificial skin. Cells Tissues Organs. 167, 88-94 (2000).
- Priya, S. G., Jungvid, H., Kumar, A. Skin tissue engineering for tissue repair and regeneration. Tissue Engineering Part B: Reviews. 14, 105-118 (2008).
- Papavasiliou, G., Cheng, M. H., Brey, E. M. Strategies for vascularization of polymer scaffolds. Journal of Investigative Medicine. 58 (7), 838-844 (2010).
- Laschke, M. W., et al. Angiogenesis in tissue engineering: breathing life into constructed tissue substitutes. Tissue Engineering. 12, 2093-2104 (2006).
- Zhong, S. P., Zhang, Y. Z., Lim, C. T. Tissue scaffolds for skin wound healing and dermal reconstruction. Wiley Interdisciplinary Reviews Nanomedicine and Nanobiotechnology. 2 (5), 510-525 (2010).
- Liu, G., Zhang, Y., Liu, B., Sun, J., Li, W., Cui, L. Bone regeneration in a canine cranial model using allogeneic adipose derived stem cells and coral scaffold. Biomaterials. 34 (11), 2655-2664 (2013).
- Hansson, A., Di Francesco, T., Falson, F., Rousselle, P., Jordan, O., Borchard, G. Preparation and evaluation of nanoparticles for directed tissue engineering. International Journal of Pharmaceutics. 439 (1-2), 73-80 (2012).
- Sarkar, S. D., Farrugia, B. L., Dargaville, T. R., Dhara, S. Chitosan-collagen scaffolds with nano/microfibrous architecture for skin tissue engineering. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 18, (2013).
- Wang, X., et al. The roles of knitted mesh-reinforced collagen-chitosan hybrid scaffold in the one-step repair of full-thickness skin defects in rats. Acta Biomaterials. 9 (8), 7822-7832 (2013).
- Rizzi, S. C., Upton, Z., Bott, K., Dargaville, T. R. Recent advances in dermal wound healing: biomedical device approaches. Expert Review of Medical Devices. 1, 143-154 (2010).
- des Rieux, A., et al. 3D systems delivering VEGF to promote angiogenesis for tissue engineering. Journal of Controlled Release. 150, 272-278 (2011).
- Reckhenrich, A. K., et al. Bioactivation of dermal scaffolds with a non-viral copolymer-protected gene vector. Biomaterials. 32, 1996-2003 (2011).
- Chen, J., et al. The Key Regulatory Roles of the PI3K/Akt Signaling Pathway in the Functionalities of Mesenchymal Stem Cells and Applications in Tissue Regeneration. Tissue Engineering Part B Rev. 19, 516-528 (2013).
- Fedorovich, N. E., et al. The role of endothelial progenitor cells in prevascularized bone tissue engineering: development of heterogenous constructs. Tissue Engineering Part A. 16 (7), 2355-2367 (2010).
- Wang, L., et al. Osteogenesis and angiogenesis of tissue-engineered bone constructed by prevascularized β-tricalcium phosphate scaffold and mesenchymal stem cells. Biomaterials. 36, 9452-9461 (2010).
- Cuadra, A., et al. Functional results of burned hands treated with Integra. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 65 (2), 228-234 (2012).
- Wilcke, I., et al. VEGF(165) and bFGF protein-based therapy in a slow release system to improve angiogenesis in a bioartificial dermal substitute in vitro and in vivo. Langenbecks Arch Surg. 392 (3), 305-314 (2007).
- Condurache, A., Aach, T., Grzybowsky, S., Machens, H. G. Vessel segmentation and analysis in laboratory skin transplant micro-angiograms. Proceedings of the Eighteenth IEEE Symposium on Computer-Based Medical Systems. , 21-26 (2005).
- Danner, S., et al. The use of human sweat gland-derived stem cells for enhancing vascularization during dermal regeneration. Journal of Investigative Dermatology. 132 (6), 1707-1716 (2012).
- Shaterian, A., et al. Real Time Analysis of the Kinetics of Angiogenesis and Vascular Permeability in an Animal Model of Wound Healing. Burns. 35 (6), 811-817 (2009).
- McDonald, D. M., Choyke, P. L. Imaging of angiogenesis: from microscope to clinic. Nature Medicine. 9 (6), 713-725 (2003).
- Bergeron, L., Tang, M., Morris, S. F. A review of vascular injection techniques for the study of perforator flaps. Plastic and Reconstructive Surgery. 117, 2050-2057 (2006).
- Schlatter, P., König, M. F., Karlsson, L. M., Burri, P. H. Quantitative study of intussusceptive capillary growth in the chorioallantoic membrane (CAM) of the chicken embryo. Microvascular Research. 54 (1), 65-73 (1997).
- Lehr, H. A., Leunig, M., Menger, M. D., Nolte, D., Messmer, K. Dorsal skinfold chamber technique for intravital microscopy in nude mice. American Journal of Pathology. 143 (4), 1055-1062 (1993).
- Menger, M. D., Jäger, S., Walter, P., Hammersen, F., Messmer, K. A novel technique for studies on the microvasculature of transplanted islets of Langerhans in vivo. International journal of microcirculation, clinical and experimental. 9 (1), 103-117 (1990).
- Laschke, M. W., et al. Three-dimensional spheroids of adipose-derived mesenchymal stem cells are potent initiators of blood vessel formation in porous polyurethane scaffolds. Acta Biomaterials. 9 (6), 6876-6884 (2013).
- Egaña, J. T., et al. Use of human mesenchymal cells to improve vascularization in a mouse model for scaffold-based dermal regeneration. Tissue Eng Part A. 15 (5), 1191-1200 (2009).
- Condurache, A., Aach, T. Vessel segmentation in angiograms using hysteresis thresholding. Proceedings of the Ninth IAPR Conference on Machine Vision Applications. , 269-272 (2005).
- Egaña, J. T., et al. Ex vivo method to visualize and quantify vascular networks in native and tissue engineered skin. Langenbecks Archives of Surgery. 394, 349-356 (2009).
